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문제 정의
- 본 연구에서는 잔토리졸과 어성초 추출물의 항균 및 항바이러스 효과를 평가하고 이들을 적용한 손 세정제 처방의 제품과 현재 유통되고 있는 제품과의 항균, 항바이러스의 효능을 비교해 보았다.
- 이러한 문제를 해결하기 위해서는 무엇보다도 쉽게, 즉 씻을 물도 그리고 말릴 필요도 없는 새로운 제형의 손 소독제의 개발을 적극 검토해야 할 것으로 생각된다. 이러한 목적으로 식물추출물을 적용한 손세정제로 장출혈성 대장균과 influenza virus에 대한 효과를 확인하였다. 그 결과 잔토리졸 2000 ppm, 어성초 500 ppm으로 처방된 제품에서 뛰어난 효능을 확인 하였다.
제안 방법
- 0 ml를 취하여 손소독제가 처리된 손바닥에 균일하게 유리봉으로 도포하여 clean-bench에서 건조시킨 후 대장균 검출용 Hand-Printing Agar Plate에 3초간 hand printing을 하였다. Hand printing한 손을 멸균된 polyglove로 씌우고 시간별 hand printing한 Hand-Printing Agar Plate를 온도 37 ℃ 배양기에서 24시간 배양한 후 균수를 관찰하였다.
- 바이러스 역가를 측정하기 위하여 haemagglutination assay(HA)방법을 이용하였다. 바이러스 배양액을 PBS로 2배 다단희석 (two fold dilution)하여 round bottom 96well plate에 50㎕씩 분주하고 적혈구용액(RBC)을 50 ㎕를 각 well에 가하여 상온에서 60분 이상 반응시킨 후 적혈구의 침강정도를 대조구와 비교하여 HA unit값을 결정하였다[7].
- 본 연구에서 influenza virus의 숙주세포는 Madin-Darby Canine Kidney(MDCK)를 사용 하였고 배양 배지로는 Eagle’s minimum essential medium(EMEM)에 fatal bovine serum을 10 wt% 첨가하여 사용하였다.
- 어성초 추출물을 잔토리졸이 0.2 wt% 함유된손 소독제에 0.05 wt%첨가하여 에탄올을 주요기제로 하는 P사의 손세정제(Table 1)와 influenza virus에 대하여 HI test로 항바이러스 효과를 비교 평가 하였다(Fig. 3). 그 결과 일반 적인 손 소독제로 쓰이는 에탄올은 influenza virus에 효과가 없는 것으로 나타났으며, P사의 손세정제는 세균에 대한 항균력과 달리 항바이러스 효과는 virus 용액에 10 wt%를 첨가하여도 항바이러스 역가는 50 % 미만으로 시험되었다.
- 어성초추출물과 잔토리졸의 각각에 대한 항 바이러스 활성을 비교하고 어성초추출물과 잔 토리졸을 혼합한 후 항바이러스 활성의 변화를 측정하기 위하여 influenza virus A(H1N1type)와 각 농도별 상온에서 4시간 반응하여 HI test 를 하였다. 그 결과 어성초 100 ppm농도에서 93% 이상의 항바이러스 효과를 나타내었으나 잔토리졸은 HA test에서 항바이러스 활성은 나타나지 않았다.
- 인플루엔자 바이러스 배양액에 농도별로 천연물 및 한약재 추출물을 첨가하고 4시간 뒤 HA시험을 하여 인플루엔자 바이러스의 역가를 측정하여 대조구와 비교하여 역가 감소(중화)차를 구하였다.
- 잔토리졸과 어성초추출물이 함유된 손 세정제를 제조한 후 대표적인 식중독 원인균인 E.coli O157: H7을 이용하여 살균력을 측정하였고 인플루엔자 바이러스는 사람, 기니아피그, 닭의 적혈구에 결합하는 성질을 이용하는 HA (Haemaggultination assay)test를 이용하여 바이러스역가를 측정하였고, HI(Haemaggultination inhibition)test로 항바이러스 활성을 평가하였다.
- 전 배양된 장출혈성대장균을 BHI액체배지에 106 CFU/ml이상 되도록 희석한 후 1.0 ml를 취하여 손소독제가 처리된 손바닥에 균일하게 유리봉으로 도포하여 clean-bench에서 건조시킨 후 대장균 검출용 Hand-Printing Agar Plate에 3초간 hand printing을 하였다.
대상 데이터
- 건조한 인도네시아산 생강(Curcuma xanthorrhiza)의 근경을 구입하여 건조한 후 분쇄하여 96% hexane에 3일정도 적침한 뒤 이를 여과하고, 감압 증발하여 조성이 23 wt%인 Curcuma Xanthorrhiza hexane extract를 얻었 으며, 이 시료를 silica fresh column을 이용하여 용매조건은 Hexane:ethylacetate(1:1)으로 분리 정제 하였다. 다시 silica fresh column을 이용하여 hydrophobic부분(α-curcumene)을 제거 하여 조성이 53.
- 기니아피그는 주)LG생명과학(대전광역시, 한국)에서 구입하여 1주일 이내에 사용하였고, 심장에서 주사기로 혈액을 채취(heart puncture) 하여 적혈구만 모아 적혈구 농도가 7.5 wt% 되도록 phosphate buffered saline(PBS,pH7.4)에 현탁하여 4 ℃에 보관하여 사용하였다.
- 본 연구에서 사용된 대장균은 E. coli O157: H7로 고려대학교 식품과학부 이민석 교수연구실에서 분양 받아 사용하였고 바이러스는 influenza virus［A/johanenesburg/33/94(H1N 1)］와［A/Brazil /1/79(H3N2)를 분양 받아 사용하였다.
- 0g을 얻었다. 본 추출물을 10 wt%농도가 되도록 에탄올로 재 희석하여 본 실험의 시료로 사용하였다.
- 1의 구조식을 가진 xanthorrhizol로 확인되었다. 어 성초(Houttuynia cordata Thunb.) 추출물은 어성초 1.0 Kg에 에탄올 2,000 mL를 넣고 추출 온도 25 ℃에서 24시간 추출 농축하여 제조하였다. 여과 장치를 사용하여 여과한 후 4 ℃에서 24시간 냉장보관 후 침전물을 여과 제거한후 여과액을 회전식 진공증발기를 사용하여 에탄올을 증발시키고 유체 상태의 추출물 35.
- 에탄올은 93%의 것을 사용하였으며 물은 정제 수를 가지고 초 순수 제조장치(미래과학, 한국) 를 통과시켜 18 MW 이상인 것을 사용하였다. 에틸렌다이아민테트라아세테이트(EDTA-2Na, Japan Catalyst, Japan)는 처방 실험의 재료로 사용하였다.
- 에탄올은 93%의 것을 사용하였으며 물은 정제 수를 가지고 초 순수 제조장치(미래과학, 한국) 를 통과시켜 18 MW 이상인 것을 사용하였다. 에틸렌다이아민테트라아세테이트(EDTA-2Na, Japan Catalyst, Japan)는 처방 실험의 재료로 사용하였다.
- 유기 용매인 메탄올, 부탄올, 에틸아세테이트는 공업용을 사용하였으며 그 외 시약Sigma-Aldrich사의 특급 시약을 사용하였다.
이론/모형
- 바이러스 역가를 측정하기 위하여 haemagglutination assay(HA)방법을 이용하였다. 바이러스 배양액을 PBS로 2배 다단희석 (two fold dilution)하여 round bottom 96well plate에 50㎕씩 분주하고 적혈구용액(RBC)을 50 ㎕를 각 well에 가하여 상온에서 60분 이상 반응시킨 후 적혈구의 침강정도를 대조구와 비교하여 HA unit값을 결정하였다[7].
- 천연물 및 한약재 추출물을 인플루엔자 A형에 대한 항바이러스 활성을 측정하기 위하여 HI(haemagglutination inhibition)시험법을 이용 하였다.
- 항균력을 측정하기 위하여 Agar plate법을 이용하였다. 하루 전에 배양한 대장균 원액을 희석하여 배지1.
성능/효과
- P사의 손세정제로 처리한 손에서의 장출혈성대장균은 초기에 감소 경향을 나타내나 90분 이후에도 103CFU 이상으로 유지되었다(Fig. 4 (a)-(d)).
- 어성초추출물과 잔토리졸의 각각에 대한 항 바이러스 활성을 비교하고 어성초추출물과 잔 토리졸을 혼합한 후 항바이러스 활성의 변화를 측정하기 위하여 influenza virus A(H1N1type)와 각 농도별 상온에서 4시간 반응하여 HI test 를 하였다. 그 결과 어성초 100 ppm농도에서 93% 이상의 항바이러스 효과를 나타내었으나 잔토리졸은 HA test에서 항바이러스 활성은 나타나지 않았다. 그러나 어성초와 잔토리졸의 혼합물에서는 어성초의 항바이러스 효과가 유지 되는 것으로 확인 하였다(Fig.
- 3). 그 결과 일반 적인 손 소독제로 쓰이는 에탄올은 influenza virus에 효과가 없는 것으로 나타났으며, P사의 손세정제는 세균에 대한 항균력과 달리 항바이러스 효과는 virus 용액에 10 wt%를 첨가하여도 항바이러스 역가는 50 % 미만으로 시험되었다. 어성초 추출물이 함유된 손 소독제는 10 wt%농도에서 93% 이상의 항바이러스 효과를 나타내었으며, 1.
- 이러한 목적으로 식물추출물을 적용한 손세정제로 장출혈성 대장균과 influenza virus에 대한 효과를 확인하였다. 그 결과 잔토리졸 2000 ppm, 어성초 500 ppm으로 처방된 제품에서 뛰어난 효능을 확인 하였다. 대조군으로 에탄올을 주원료(62%)로 하는 P사의 손세정제는 세균에 대한 초기 살균력은 뛰어나지만 항바이러스 활성에는 약한 것으로 시험 되었다.
- 또한 제품을 손에 사용 후 2시간 30분까지도 초기의 항균력을 그대로 유지하는 것을 확인하였다. 또한 Ethanol을 62% 함유하고 있는 외국의 P사의손세정제와 비교한 결과 잔토리졸과 어성초 추출물을 함유한 손세정제가 보다 우수한 항바이러스 효과와 잔류항균 효능을 확인하였다. 그러나 항균물질인 잔토리졸과 항바이러스 물질인 어성초를 첨가한 혼합제형에서 각각의 효능에서의 시너지 효과는 확인하지 못하였다.
- 잔토리졸(2000 ppm), 어성초(500 ppm)가 함유된 손세정제를 장출혈성 대장균과 influenza virus에 대한 효능을 실험한 결과 식중독 원인균에 대해서 105 이상의 균수 감소를 관찰하였고 influenza A형 virus에 대하여 항바이러스 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 제품을 손에 사용 후 2시간 30분까지도 초기의 항균력을 그대로 유지하는 것을 확인하였다. 또한 Ethanol을 62% 함유하고 있는 외국의 P사의손세정제와 비교한 결과 잔토리졸과 어성초 추출물을 함유한 손세정제가 보다 우수한 항바이러스 효과와 잔류항균 효능을 확인하였다.
- 그 결과 일반 적인 손 소독제로 쓰이는 에탄올은 influenza virus에 효과가 없는 것으로 나타났으며, P사의 손세정제는 세균에 대한 항균력과 달리 항바이러스 효과는 virus 용액에 10 wt%를 첨가하여도 항바이러스 역가는 50 % 미만으로 시험되었다. 어성초 추출물이 함유된 손 소독제는 10 wt%농도에서 93% 이상의 항바이러스 효과를 나타내었으며, 1.0 wt%농도에서도 50%의 항바이러스 역가를 나타냈다.
- 잔토리졸(2000 ppm), 어성초(500 ppm)가 함유된 손세정제를 장출혈성 대장균과 influenza virus에 대한 효능을 실험한 결과 식중독 원인균에 대해서 105 이상의 균수 감소를 관찰하였고 influenza A형 virus에 대하여 항바이러스 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 또한 제품을 손에 사용 후 2시간 30분까지도 초기의 항균력을 그대로 유지하는 것을 확인하였다.
- 4 (a)-(d)). 잔토리졸과 어성초 추출물을 함유한손 세정제는 30분 만에 장출혈성 대장균이 거의 사멸 되었으며 그 이후에도 대장균은 검출 되지 않았다. 잔토리졸이 손에 잔류하여 지속적인 살균력을 내는 것으로 판단된다(Fig.
후속연구
- 또한 Ethanol을 62% 함유하고 있는 외국의 P사의손세정제와 비교한 결과 잔토리졸과 어성초 추출물을 함유한 손세정제가 보다 우수한 항바이러스 효과와 잔류항균 효능을 확인하였다. 그러나 항균물질인 잔토리졸과 항바이러스 물질인 어성초를 첨가한 혼합제형에서 각각의 효능에서의 시너지 효과는 확인하지 못하였다.
- 이러한 문제를 해결하기 위해서는 무엇보다도 쉽게, 즉 씻을 물도 그리고 말릴 필요도 없는 새로운 제형의 손 소독제의 개발을 적극 검토해야 할 것으로 생각된다. 이러한 목적으로 식물추출물을 적용한 손세정제로 장출혈성 대장균과 influenza virus에 대한 효과를 확인하였다.
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