최근 많은 관심을 가지는 유산균은 사람이나 동물의 장내 방어 장벽인 위산, 담즙산염, 췌장에 효과가 있고, 이들 생균은 장 점막에 쉽게 집락화하는 특성을 가지면서도 인체에는 무해한 균이기 때문에 식품첨가물 부분에서 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 분류되어 있고, 이런 안전성을 기반으로 수많은 제품이 제조되어 유통되고 있다. 유산균의 다양한 연구는 유산균 생균제, 사균체, 유산균 파쇄액을 이용하여 항암 효과, 유당 단백질의 흡수 증진, 콜레스테롤의 저하 류머티스 관절염 치료 및 정장작용 개선에 효과적인 기능을 가진다고 보고하고 있다. 이런 다양한 효과를 가지는 유산균의 기능을 이용하기 위하여 금번 연구에서는 항암 활성이 우수한 Lactobacillus casei의 2차 산물인 배양여액에서 순수 분리한 것으로 UItrafiltration membrane(3, 30 KDa)으로 분리 농축한 단백질 물질인 CBT-AK5을 실험에 사용하였다. 이전 연구로 CBT-AK5가 정상세포와 암세포주를 이용한 세포 독성 실험 및 암세포 생육 억제 활성을 측정한 결과, 정상세포에 대한 세포 독성은 20% 이내로 낮은 세포 독성 효과를 나타난 반면, 각 장기별 암세포주에 대한 암세포 생육 억제 활성을 측정한 결과 70% 이상의 높은 암세포 생육 억제 활성을 나타내어 항암 활성 물질임을 확인하였다. Lactobacillus casei의 2차 산물인 배양여액에서 순수 분리한 CBT-AK5의 항암 효과에 대한 in vivo 실험을 실시하였다. In vivo 실험으로 6~8주령된 ICR mice를 사용하였고, 복수암 유발 및 고형암 유발을 위해 Sarcoma-180 cell line이용하였다. 투여 방법으로는 경구투여와 복강내 투여로 나누어 진행하였고, 각 투여 방법에 따른 치료군과 예방군으로 나누어 실험하였다. 또한 치료군과 예방군마다 다른 농도별($25\;{\mu}g/m{\ell}$, $250\;{\mu}g/m{\ell}$, $2.5\;{\mu}g/m{\ell}$ 차이도 관찰하였다. 위 실험에서 경구투여에 따른 항암 활성 효과는 양성대조군보다 체중 증가와 생존율 비교에 있어서 정상군보다 다소 높게 관찰되었으나, In vitro 실험시 높은 항암 활성 효과에 비해 유의적이지 않았다. 하지만, 복강내 투여에 따른 항암 활성 효과는 양성대조군보다 체중 증가와 생존율 비교에 있어서 높은 활성 효과가 관찰되었고, 치료군과 예방군 모두에서 항암 활성이 우수한 물질임을 확인하였다. 이상의 실험에서 Lactobacillus casei의 2차 산물인 배양여액에서 순수 분리한 CBT-AK5가 항암 활성에 우수한 물질임을 확인하였다.
최근 많은 관심을 가지는 유산균은 사람이나 동물의 장내 방어 장벽인 위산, 담즙산염, 췌장에 효과가 있고, 이들 생균은 장 점막에 쉽게 집락화하는 특성을 가지면서도 인체에는 무해한 균이기 때문에 식품첨가물 부분에서 GRAS(Generally Recognized As Safe)로 분류되어 있고, 이런 안전성을 기반으로 수많은 제품이 제조되어 유통되고 있다. 유산균의 다양한 연구는 유산균 생균제, 사균체, 유산균 파쇄액을 이용하여 항암 효과, 유당 단백질의 흡수 증진, 콜레스테롤의 저하 류머티스 관절염 치료 및 정장작용 개선에 효과적인 기능을 가진다고 보고하고 있다. 이런 다양한 효과를 가지는 유산균의 기능을 이용하기 위하여 금번 연구에서는 항암 활성이 우수한 Lactobacillus casei의 2차 산물인 배양여액에서 순수 분리한 것으로 UItrafiltration membrane(3, 30 KDa)으로 분리 농축한 단백질 물질인 CBT-AK5을 실험에 사용하였다. 이전 연구로 CBT-AK5가 정상세포와 암세포주를 이용한 세포 독성 실험 및 암세포 생육 억제 활성을 측정한 결과, 정상세포에 대한 세포 독성은 20% 이내로 낮은 세포 독성 효과를 나타난 반면, 각 장기별 암세포주에 대한 암세포 생육 억제 활성을 측정한 결과 70% 이상의 높은 암세포 생육 억제 활성을 나타내어 항암 활성 물질임을 확인하였다. Lactobacillus casei의 2차 산물인 배양여액에서 순수 분리한 CBT-AK5의 항암 효과에 대한 in vivo 실험을 실시하였다. In vivo 실험으로 6~8주령된 ICR mice를 사용하였고, 복수암 유발 및 고형암 유발을 위해 Sarcoma-180 cell line이용하였다. 투여 방법으로는 경구투여와 복강내 투여로 나누어 진행하였고, 각 투여 방법에 따른 치료군과 예방군으로 나누어 실험하였다. 또한 치료군과 예방군마다 다른 농도별($25\;{\mu}g/m{\ell}$, $250\;{\mu}g/m{\ell}$, $2.5\;{\mu}g/m{\ell}$ 차이도 관찰하였다. 위 실험에서 경구투여에 따른 항암 활성 효과는 양성대조군보다 체중 증가와 생존율 비교에 있어서 정상군보다 다소 높게 관찰되었으나, In vitro 실험시 높은 항암 활성 효과에 비해 유의적이지 않았다. 하지만, 복강내 투여에 따른 항암 활성 효과는 양성대조군보다 체중 증가와 생존율 비교에 있어서 높은 활성 효과가 관찰되었고, 치료군과 예방군 모두에서 항암 활성이 우수한 물질임을 확인하였다. 이상의 실험에서 Lactobacillus casei의 2차 산물인 배양여액에서 순수 분리한 CBT-AK5가 항암 활성에 우수한 물질임을 확인하였다.
This study implicated that the CBT-AK5 purified from Lactobacillus casei (LAFTI L26) which showed antitumor activity in ICR mice. Hence, ICR mice were inoculated intraperitoneally Sarcoma-180 as well as CBT-AK5. Then we observed the life span and tumor increment of those ICR mice. Here our studies s...
This study implicated that the CBT-AK5 purified from Lactobacillus casei (LAFTI L26) which showed antitumor activity in ICR mice. Hence, ICR mice were inoculated intraperitoneally Sarcoma-180 as well as CBT-AK5. Then we observed the life span and tumor increment of those ICR mice. Here our studies showed effect on two different way of treatment as intraperitoneally and orally treated in Sarcoma-180 infected ICR mice. We found that intraperitoneally treatment of Sarcoma-180 and CBT-AK5 is more effective than orally fed. The life span of the ICR mice were highly reduced after the inoculation of Sarcoma-180. Those effects like increment of body weight, the growth of ascites and solid were inhibited significantly after the treatment of CBT-AK5 in Sarcoma-180 infected ICR mice. Finally these studies suggested that CBT-AK5 isolated form Lactobacillus casei showed excellent antitumor activity against Sarcoma-180 infected ICR mice.
This study implicated that the CBT-AK5 purified from Lactobacillus casei (LAFTI L26) which showed antitumor activity in ICR mice. Hence, ICR mice were inoculated intraperitoneally Sarcoma-180 as well as CBT-AK5. Then we observed the life span and tumor increment of those ICR mice. Here our studies showed effect on two different way of treatment as intraperitoneally and orally treated in Sarcoma-180 infected ICR mice. We found that intraperitoneally treatment of Sarcoma-180 and CBT-AK5 is more effective than orally fed. The life span of the ICR mice were highly reduced after the inoculation of Sarcoma-180. Those effects like increment of body weight, the growth of ascites and solid were inhibited significantly after the treatment of CBT-AK5 in Sarcoma-180 infected ICR mice. Finally these studies suggested that CBT-AK5 isolated form Lactobacillus casei showed excellent antitumor activity against Sarcoma-180 infected ICR mice.
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문제 정의
따라서, 본 실험에서는 Lactobacillus casei (LAFTI L26) 배양액으로부터 분리한 물질(CBT-AK5)을 Sarcoma 180 세포로 유도한 복수암, 고형암 ICR mice에 투여하여 암 억제 활성에 대해 측정함으로써 항암제로 개발하기 위한 가능성을 밝히기 위한 기초 .자료를 확립하고자 하였다.
또한, 1962년 Bogdanov 등이 Lactobacillus bulgaricus에서 Sarcoma 180 암세포주와 Ehrcinoma 57 암세포주에 의한 복수암에 효과가 있는 3가지의 glycopeptide를 분리한 후 발효 유제품의 유산균에 대한 항암 효과는 많이 연구되었다. 본 연구자들은 Lactobacillus ceei의 배양여액에서 분리한 물질이 여러 암세포주에서 뛰어난 항암 활성 효과를 보여줌을 확인하였다(King JH, et al., 2008). 그러나 유산균체나 유산균체 파쇄액, 유산균으로부터 분리 한 세포벽 의 항암 효과는 많이 연구되어 왔지 만, 유산균 배양여액의 항암 기능에 대한 연구는 아직 부족한 실정이다.
위한 기초 .자료를 확립하고자 하였다.
제안 방법
ICR 마우스에 in vivo 계대중인 Sarcoma 180을 일회용 주사기를 이용하여 복강으로부터 채취한 후 RPMI 1640(Hyclone, cat. No SH 30027.01) 배지에 희석하여 Sarcoma 180 세포의 농도가 # 되게 한 다음 10배 희석하고, 이 희석액을 # 주사기로 100 #씩 ICR 마우스 (male, 6주령, 30.30.7)의 복강에 접종하였다.
ICR 마우스에 in vivo 계대중인 Sarcoma 180을 일회용 주사기를 이용하여 복강으로부터 채취한 후 RPMI 1640(Hyclone, cat. No SH 30027.01) 배지에 희석하여 Sarcoma 180 세포의 농도가 3.5x1V cells/ml 되게 한 다음 10배 희석하고, 이 희석액을 1 ml 주사기로 100 M3-5X106 cells)씩 ICR 마우스 (male, 6주령, 30.30.7)의 피하에 접종하였다. 실험군은 고형암 유발군 Control(), Lactobacillus casei 배양여액에서 분리한 CBT-AK5의 항암치료 효과를 보기 위한 군(Treat 250ug/ml으로 각각 5마리로 하여 매일 고형 암에 100 ml씩 고형 암에 투여하여 22일이 경과한 후 쥐를 치사시켜 암괴를 적출하여 무게를 측정하였다.
lactobacillus casef의 배양물에서 항암 활성을 알아보기 위해 두 가지 실험방법으로 경구투여 방법과 복강내 투여 방법으로 병행 실험하였다.
7)는 Sarcoma 180 복수암과 고형암을 유발시키기 위한 숙주로 사용하였다. 마우스의 예 비 사육은 온도 22~24, 습도 60~70%로 유지 하였으며, 명암주기를 12시간(am 07:00~pm 07:00)으로 조절하였다. 이상의 조건에서 사료는 펠렛형 실험동물사료(삼양배양사료(주)삼양사)와 물은 자유 급식시키고, 깔짚은 주 2회 교체하였다.
복수암이 유발되어 복부가 팽만한 마우스의 복강을 통해 일회용 주사기를 사용하여 노란색의 복수를 채취하여 실험 및 계대에 사용하였으며, 계대는 13일마다 실시하였다.
분리 된 단백 질을 농축하기 위하여 분획분자량이 3, 30 KDa 인 한외 여과막(ultrafiltration membrane)을 사용하였으며, 250 Stirred Ultrafiltration Cell(Milipore, model 8200, USA)을 이용하여 농축하였다. 농축 순서는 30 KDa 한외 여과막을 사용하여 통과하는(flow-through) 용액을 받고, 3 KDa 한외 여과막을 사용하여 상등액을 얻어 최종 3~30 KDa의 농축 물질을 이용하여 실험에 사용하였다.
7)의 피하에 접종하였다. 실험군은 고형암 유발군 Control(), Lactobacillus casei 배양여액에서 분리한 CBT-AK5의 항암치료 효과를 보기 위한 군(Treat 250ug/ml으로 각각 5마리로 하여 매일 고형 암에 100 ml씩 고형 암에 투여하여 22일이 경과한 후 쥐를 치사시켜 암괴를 적출하여 무게를 측정하였다.
실험동물군은 ( Table 1>과 같이 경구투여와 복강투여로 나누어 정상군(Control(-)), 복수암 유발5(Control()), # 배양여액에서 분리한 CBT-AK5의 농도별 항암 치료 효과를 보기 위한 치료군(treated)과 예방효과를 보기 위하여 복수암 유발 1 주일 전에 투여한 예방군(prevented)으로 5마리를 1군으로 하여 각각 마우스에 농도별로 100 ul씩 매일 투여하고 접종 후 21 일간 매일 체중을 측정하였으며, 그 생존일도 측정하였다.
005%)를 사용하였다. 여기에 Lactobacillus casei 균주를 접종(초기 접종농도 0.5%)하여 37에서 약 13~14시간 동안 배 양하였고 배 양시의 pH는 5.5~6.5 로 조절하여 배양 후, 원심분리기를 이용하여 8, 000 X g로 20분간 원심 분리 한 배 양물을 0.45 /an 크기의 공극막(pore membrane, Millipore, Bedford, Mass.)에 통과시켜 실험에 사용하였다(kimet al., 2007).
마우스의 예 비 사육은 온도 22~24, 습도 60~70%로 유지 하였으며, 명암주기를 12시간(am 07:00~pm 07:00)으로 조절하였다. 이상의 조건에서 사료는 펠렛형 실험동물사료(삼양배양사료(주)삼양사)와 물은 자유 급식시키고, 깔짚은 주 2회 교체하였다.
2) 단백질(CBT-AK5) 분리 및 정제
제조된 Lactobacillus casei 균주의 배양물을 양이온 교환수지(SK-104, 강산, Na*형), 음이온교환수지(PAY12, 강염기, CI형) 및 합성이온교환수지(HP-20)를 이용하여 전처리하고, 상기 전처리된 배 양물에 황산암모늄(ammonium sulfhte)을 최종농도 70%가 되도록 4에서 4시간 동안 투여하여 교반하였다. 교반 후, 4에서 8, 000 X g로 20분간 원심 분리하여 단백질을 침전시키고, 침전된 단백질을 50 mM Tris-HCl 버퍼(pH 7.
대상 데이터
The survival monitored for 21 days after tumor inoculation. Each experimental group consisted of 5 mice(*p<0.01 compare with Control) Group).
2주간 예비 사육한 후 실험에 사용하였다. ICR 마우스( 8주령, 36.01.5 : 6주령, 30.30.7)는 Sarcoma 180 복수암과 고형암을 유발시키기 위한 숙주로 사용하였다. 마우스의 예 비 사육은 온도 22~24, 습도 60~70%로 유지 하였으며, 명암주기를 12시간(am 07:00~pm 07:00)으로 조절하였다.
Sarcoma 180 세포는 한국세포주은행으로부터 분양 받아 8~10주령된 ICR 마우스의 복강에 in vivo 계대하였다. 복수암이 유발되어 복부가 팽만한 마우스의 복강을 통해 일회용 주사기를 사용하여 노란색의 복수를 채취하여 실험 및 계대에 사용하였으며, 계대는 13일마다 실시하였다.
경구투여 실험에 사용된 동물은 6주령된 ICR 마우스(male) 와 복강내 투여 실험에 사용된 4주령된 ICR 마우스(male)를 중앙실험동물(주)로부터 구입한 것을 본 연구소의 동물 사육실에서 2주간 예비 사육한 후 실험에 사용하였다. ICR 마우스( 8주령, 36.
공시균주로는 현재 (주)쎌바이오텍의 주요 생산균주 중 가장 항암활성이 뛰어난 Lactobacillus casei (LAFTI L26)를 선별하여 사용하였으며, 배지조건은 기존의 생산용 현장배지 (glucose 4.0%, soy-peptone A3 1.5%, yeast extract 1.0%, K2HPO4 0.1%, sodium acetate 0.1%, diarnmonium citrate 0.1%, MgSO4 0.01%, MnSO4 0.005%)를 사용하였다. 여기에 Lactobacillus casei 균주를 접종(초기 접종농도 0.
Ultrafiltration Cell(Milipore, model 8200, USA)을 이용하여 농축하였다. 농축 순서는 30 KDa 한외 여과막을 사용하여 통과하는(flow-through) 용액을 받고, 3 KDa 한외 여과막을 사용하여 상등액을 얻어 최종 3~30 KDa의 농축 물질을 이용하여 실험에 사용하였다.
성능/효과
관찰해 본 결과, <Fig. 1>에서와 같이 경구투여시 치료군은 실험 개시 10일 후부터 Sarcoma 180만을 투여한 양성대조군(Control(- ))보다 체중의 증가가 적었고, 농도별(25 //g/ml, 250 2.5 mg/ml)에서는 저농도(25 mg/nl)와 고농도(2.5 mg/ml)에서는 양성대조군보다 체중이 증가하지 않았지만, 비슷한 양상을 나타났다. 그리고 치료군 중 중간농도 (250mg/ml)에서 정상군(Control!- ))과 가깝게 나타났다.
관찰해 본 결과, <Fig. 5>에서와 같이 복강투여시 치료군은 실험 개시 6일 후부터 정상군보다 체중이 증가가 적었고 25 /zg/ml, 250 ug/ml 2.5 mg/ml 농도 순서로 체중 증가가 낮게 나타났다. <Fig.
2>의 결과에서 양성대조군보다 CBT-AK5를 경구투여 하였을 때 평균 3일의 생존율이 높게 나타났다. 그러나 치료군의 평균 생존일수 비율(mean survival day rate, T/C(%)) 에서는 양성대조군 100%에 비하여 CBT-AK5 투여군 118% 에서 각각 농도별에 따른 유의적 차이는 나타나지 않았다.
본 연구에서는 유산균이나 유산균 파쇄물 보다는 유산균배양 후 2차 산물인 유산균 배양물에서 항암 활성이나 면역 활성에 뛰어난 물질을 발굴하고 그 효능을 검증한 결과, 유산균 배양물인 CBT-AK5는 복수암과 고형암 모두에서 예방 및 치료 효과에 우수한 항암 활성을 가지고 있음을 검증하였다.
세포 독성을 나타내는 기존의 항암제와는 달리 유산균의 배양 여액에서 분리된 CBT-AK5의 암 예방 및 치료에 긍정적인 효과가 나타났다. 유산균의 배양여액에서 분리된 CBT-AK5 가 각 장기 별 특이적 암세포(AGS, A549, MCF-7, SK-OV-3, LoVo)에 미치는 영향에 대한 선행 연구가 이루어졌다(Kim et qL, 2008).
이상의 복강내 투여 실험에서 치료군과 예방군 양쪽 그룹에서 농도별 차이와 상관없이 양성대조군과 비교하였을 때 CBT-AK57} Sarcoma 180 복수암에 대한 억제효과가 확인되었다.
후속연구
효능을 가지고 있다고 보고되어지고 있다. 향후 다양한 유산균주와 유산균 배양물에서 항암 활성 및 면역 활성에 관여하는 다양한 신 물질의 발굴로 다양한 연구가 이루어질 것이라 생각되며, 향후 바이오 의약품 개발에 있어서 훌륭한 기초자료로 활용될 수 있을 것이다.
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