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문제 정의
- 따라서 본 연구는 소변을 이용하여 MA 또는 MDMA 투약여부를 확인하기 위하여 기존의 LLE 추출법 대신에 SPE 방법을 적용하여, 5종 마약성분 (AP, MA, MDA, MDMA, MDEA)을 자동으로 추출하여 분석하는 감정방법을 제시하였다. 또한 개발된 감정 방법을 메스암페타민 또는 엑스터시 실제 투약혐의자의 소변에 적용한 결과 이들 성분을 신속하고 정확하게 분석할 수 있었다.
- 미치는 중요한 요인 중 하나이다. 선택한 SPE 카트리지에 시료 pH 변화에 따른 절대 회수율 (absolute recovery) 을 비교하여 상기 5종 성분을 동시에 추출 할 수 있는 최적의 적정 pH를 선정하고자 하였다. 실험에 사용된 소변은 마약성분 투약 사실이 없는 성인 남자 소변을 채취하여 대조 소변 (blank urine) 으로 하였다.
제안 방법
- MA, MDMA, MDEA 성분은 100, 10, 1 |ig/mL 농도로, AP, MDA 성분은 50, 5, 0.5 μg/mL 농도로 희석된 표준용액을 이용하여 검정곡선을 작성하였다. 검정 곡선 작성용 표준액 은 AP, MDA는 34 (28; MDA), 50, 150, 300, 500, 1000 ng/mL 의 농도로, MA, MDMA, MDEA는 50, 100, 300, 600, 1000, 2000 ng/mL의 농도가 되도록 하였다.
- '항의 고체상추출 및 유도체화 조건에 따라 실시하였다. pH별 절대 회수율 결과는 각각 성분의 크로마토그램 면적를 5회 반복 비교하였다.
- 5 μg/mL 농도로 희석된 표준용액을 이용하여 검정곡선을 작성하였다. 검정 곡선 작성용 표준액 은 AP, MDA는 34 (28; MDA), 50, 150, 300, 500, 1000 ng/mL 의 농도로, MA, MDMA, MDEA는 50, 100, 300, 600, 1000, 2000 ng/mL의 농도가 되도록 하였다. 검정곡선 작성용 표준액은 대조 소변 3 mL 에 각각의 농도에 맞추어 표준용액을 첨가하고 질소 하에 증발시킨 후, 각각의 농도에 내부표준 용액 50 mL를 첨가하여 앞서 기술한 분석방법을 이용하여 실험하였다.
- 검정 곡선 작성용 표준액 은 AP, MDA는 34 (28; MDA), 50, 150, 300, 500, 1000 ng/mL 의 농도로, MA, MDMA, MDEA는 50, 100, 300, 600, 1000, 2000 ng/mL의 농도가 되도록 하였다. 검정곡선 작성용 표준액은 대조 소변 3 mL 에 각각의 농도에 맞추어 표준용액을 첨가하고 질소 하에 증발시킨 후, 각각의 농도에 내부표준 용액 50 mL를 첨가하여 앞서 기술한 분석방법을 이용하여 실험하였다.
- 검출한계(limit of detection, LOD)는 대조 소변을 10회 분석한 결과와 서로 비교하여 신호대 잡음비 (signal/noise, S/N) 가 3 이상인 농도를 검출한계 값으로 정하였고, 정량한계 (limit of quantitation, LOQ)는 S/N 비가 10 이상인 값을 정량한계 값으로 정하였다. 상대 회수율 (relative recovery) 은 대조 소변에 표준용액을 이용하여 AP, MDA는 75, 350, 750 ng/mL 농도로 각각 첨가하고, MA, MDMA, MDEA 는 75, 700, 1500 ng/mL 농도가 되도록 각각 첨가한 후 시료 처리 방법과 동일한 방법으로 분석하였다.
- 실험에 사용된 소변은 마약성분 투약 사실이 없는 성인 남자 소변을 채취하여 대조 소변 (blank urine) 으로 하였다. 그리고 대조 소변에 각 성분 표준용액을 첨가하여 0.3 μg/mL 농도가 되도록 하여 절대 회수율 비교용 시료를 제조하였다. 대조 소변의 pH는 6이었으며, 0.
- 정밀도는 각각의 농도에서 측정된 값들을 비교하여 구하였으며, 그 결과는 변동계수(coefficient of variance, % CV) 로나타냈다. 그리고 정확도는 분석하여 얻은 측정농도 (calculated concentration) 와 명목농도 (nominal concentration) 를 비교하여 계산하였다. 그 결과는 치우침값(%, bias)으로 나타냈다.
- 3 μg/mL 농도가 되도록 하여 절대 회수율 비교용 시료를 제조하였다. 대조 소변의 pH는 6이었으며, 0.1 M NaOH 용액을 가하여 pH가 7, 8, 11이 되도록 조정하였다. 실험은 pH 별로 제조된 각 시료 3 mL 를 시험관(16x100 mm) 에 넣고 자동 SPE 장비에 장착 한 후에 ‘2.
- 2의 (A)는 대조 소변의 크로마토그램으로 대조 소변에 표준용액을 첨가한 크로마토그램 (B)와 비교시 동일 한 위치의 머무름 시간에서 방해물질이 나타나지 않았다. 또한 Fig. 3의 질량 스펙트럼으로부터 각 성분 TFA-AP(m.z 140, 118, 91), TFA-MA (^/z 154, 118, 91), TFA-MDA (^/z 275, 162, 135), TFA-MDMA (m/z 289, 162, 154), TFA-MDEA (m/Z 303, 168, 162)와 내부표준물질 TFA-Cl-AP (m/Z 152, 140, 125)의 특성 이온들을 확인하였다.
- 정하였다. 상대 회수율 (relative recovery) 은 대조 소변에 표준용액을 이용하여 AP, MDA는 75, 350, 750 ng/mL 농도로 각각 첨가하고, MA, MDMA, MDEA 는 75, 700, 1500 ng/mL 농도가 되도록 각각 첨가한 후 시료 처리 방법과 동일한 방법으로 분석하였다. 상대 회수율은 대조 소변에 표준용액을 첨가하여 추출 한 후 분석한 결과와 대조 소변을 추출 한 후 표준용액을 첨가하여 분석한 결과를 상호 비교하여 구하였다.
- 소변 중 암페타민계 5성분(AP, MA, MDA, MDMA, MDEA)을 기존 LLE 방법 대신 SPE 방법을 도입하여 추출하고 GC/MS 로 동시 분석하는 방법을 제시하였으며, MA 와 MDMA 투약여부를 확인하는 감정 과정의 자동화를 가능하게 하였다.
- 따라서 성분의 분리와 감도를 향상시키기 위해서는 아민기를 비극성 성질로 전환해주는 유도체화 과정이 필요하다. 이를 위해 유도체 시약 trifluoro-acetic anhydrid(TFAA) 을 사용하여 유도체화 후 분석하였다. Table 1은 유도체화된 5종 성분의 표준물질과 내부표준물질의 정량 및 정성 이온들을 나타낸 것이다.
- 정밀도(precision)와 정확도 (accuracy)는 회수율 실험에서 사용된 각각의 농도를 사용하여 시료와 동일한방법으로 처리하고 분석하여 측정하였다. 정밀도는 각각의 농도에서 측정된 값들을 비교하여 구하였으며, 그 결과는 변동계수(coefficient of variance, % CV) 로나타냈다.
- 그 결과는 치우침값(%, bias)으로 나타냈다. 정밀도와 정확도의 실험일내 (intra-day) 측정은 하루 동안 3회 실시하였으며, 실험 일간 (inter-day) 측정은 3일 동안 실시하였다.
- 추출에 사용된 메탄올과 에틸아세테이트는 Mallinckrodt Baker사 (Phillipsburg, NJ, USA) 에서구입하였으며, 용매와 시약은 모두 특급을 사용하였다. 표준용액은 1 mg/mL 농도로 된 각 표준물질을 메탄올에 녹여 MA, MDMA, MDEA 성분은 100, 10, 1 μg/mL 농도로, AP, MDA 성분은 50, 5, 0.5 μ g/mL 농도로 각각 희석하여 제조하였다. 내부표준용액은 분말로 된 내부표준물질을 메탄올에 녹여 10 μg/mL 로 희석시켜 사용하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. SPE 카트리지는 Waters사 (Milford, MA, USA) Oasis HLB 카트리지 (60 mg, 3 cc)를 사용하였다. 유도체 시약으로 사용된 trifluoroacetic anhydride (TFAA)는 Sigma-Aldrich사 (St.
- 본 연구에 사용된 SPE 카트리지로 시료 pH 변화에 따른 각 성분의 절대 회수율을 비교한 결과는 Fig. 1 에 나타냈다. 절대 회수율을 비교한 결과, pH 6에서 AP, MA 성분이 가장 높은 회수율을 나타냈으나, MDA, MDMA, MDEA 성분은 낮았다.
- 본 연구에 사용된 시료는 일선 마약수사팀에서 의뢰한 메스암페타민 또는 엑스터시 남용자 14명의 소변을 시료로 사용하였다. 시료는 사용 전까지 -64 oC 초저온 냉장고에 보관하였다.
- 분석기기는 미국 Hewlett- Packard사의 HP 6890 Series Gas Chromatograph/HP 5973 Mass Selective Detector이 사용되었으며, 시료 자동주입기는 HP 6890 series injector 를 사용하였다. 분석 칼럼은 미국 Agilent Technologies사의 DB-5MS (30 mx0.25 mm I.D., 0.25 mm film thickness) 를 사용하였다. 운반기체는 유속 1.
- 모델을 사용하였다. 분석기기는 미국 Hewlett- Packard사의 HP 6890 Series Gas Chromatograph/HP 5973 Mass Selective Detector이 사용되었으며, 시료 자동주입기는 HP 6890 series injector 를 사용하였다. 분석 칼럼은 미국 Agilent Technologies사의 DB-5MS (30 mx0.
- 선택한 SPE 카트리지에 시료 pH 변화에 따른 절대 회수율 (absolute recovery) 을 비교하여 상기 5종 성분을 동시에 추출 할 수 있는 최적의 적정 pH를 선정하고자 하였다. 실험에 사용된 소변은 마약성분 투약 사실이 없는 성인 남자 소변을 채취하여 대조 소변 (blank urine) 으로 하였다. 그리고 대조 소변에 각 성분 표준용액을 첨가하여 0.
- 25 mm film thickness) 를 사용하였다. 운반기체는 유속 1.0 mL/min 의 헬륨 가스를 사용하였다. 칼럼 온도는 110 에서 2분간 유지시킨 후 280 oC 까지는 15oC/min 속도로 온도를 높이고, 그 후 290 oC 까지는 30 oC/min 속도로 승온 하고 3분 동안 유지 시 켰다.
- SPE 카트리지는 Waters사 (Milford, MA, USA) Oasis HLB 카트리지 (60 mg, 3 cc)를 사용하였다. 유도체 시약으로 사용된 trifluoroacetic anhydride (TFAA)는 Sigma-Aldrich사 (St. Louis, MO, USA) 에서구입하였다. 추출에 사용된 메탄올과 에틸아세테이트는 Mallinckrodt Baker사 (Phillipsburg, NJ, USA) 에서구입하였으며, 용매와 시약은 모두 특급을 사용하였다.
- Louis, MO, USA) 에서구입하였다. 추출에 사용된 메탄올과 에틸아세테이트는 Mallinckrodt Baker사 (Phillipsburg, NJ, USA) 에서구입하였으며, 용매와 시약은 모두 특급을 사용하였다. 표준용액은 1 mg/mL 농도로 된 각 표준물질을 메탄올에 녹여 MA, MDMA, MDEA 성분은 100, 10, 1 μg/mL 농도로, AP, MDA 성분은 50, 5, 0.
- 표준물질 (土)-amphetamine (AP), (±)-methamphetamine (MA), (±)-3, 4-methylenedioxyamphetamine (MDA), (±) -3, 4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA), (±) 3, 4-methylenedioxyethylamphetamine (MDEA) 는 Cerilliant 사 (Austin, TX, USA)에서, 내부표준물질 (±)-P-chloro- amphetamine는 Sigma사 (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. SPE 카트리지는 Waters사 (Milford, MA, USA) Oasis HLB 카트리지 (60 mg, 3 cc)를 사용하였다.
데이터처리
- 상대 회수율 (relative recovery) 은 대조 소변에 표준용액을 이용하여 AP, MDA는 75, 350, 750 ng/mL 농도로 각각 첨가하고, MA, MDMA, MDEA 는 75, 700, 1500 ng/mL 농도가 되도록 각각 첨가한 후 시료 처리 방법과 동일한 방법으로 분석하였다. 상대 회수율은 대조 소변에 표준용액을 첨가하여 추출 한 후 분석한 결과와 대조 소변을 추출 한 후 표준용액을 첨가하여 분석한 결과를 상호 비교하여 구하였다.
- 처리하고 분석하여 측정하였다. 정밀도는 각각의 농도에서 측정된 값들을 비교하여 구하였으며, 그 결과는 변동계수(coefficient of variance, % CV) 로나타냈다. 그리고 정확도는 분석하여 얻은 측정농도 (calculated concentration) 와 명목농도 (nominal concentration) 를 비교하여 계산하였다.
이론/모형
- SPE 장비는 Caliper Life Science사 (Hopkinton, MA, USA)의 자동 RapidTrace를 사용하였으며, pH meter는 Orion Research사 (Boston, MA, USA)의 420A 모델을 사용하였다. 분석기기는 미국 Hewlett- Packard사의 HP 6890 Series Gas Chromatograph/HP 5973 Mass Selective Detector이 사용되었으며, 시료 자동주입기는 HP 6890 series injector 를 사용하였다.
- 주입 구와 검 출기 의 온도는 각각 250 oC 와 280 oC로 설정 하였다. 시료 주입은 분할 주입 방식 (split mode) 을 적용하였으며, 각 성분에 대한이온 검출 방법으로는 선택적 이온 검출법(selected ion monitoring)을 적용하였다.
성능/효과
- 994 이상의 직선성을 나타냈다 (Table 2). 검출한계 (LOD) 는 AP 10.0 ng/mL, MA 5.0 ng/mL, MDA 8.0 ng/mL, MDMA 7.0 ng/mL, 그리고 MDEA 4.0 ng/mL 농도로 측정되었으며, 정량한계 (LOQ)는 AP 34.0 ng/mL, MA 17.0 ng/mL MDA 28.0 ng/mL MDMA 23.0 ng/mL, 그리고 MDEA 12.0 ng/mL 농도로 측정되었다.
- 17 그러나 본 실험 방법에서는 최소한의 추출과정과 단일 추출 용매를 사용하여도 남용자 소변 시료에서 위의 5성분을 간편하고 정확하게 확인할 수 있었다. 결과로부터 14 명 중 13명은 MA 투약자로 확인하였고, 그 중 2명은 MA와 MDMA를 함께 투약하였음을 알 수 있었다. 그리고 나머지 1명은 MDMA 를 투약한 사실이 확인되었다.
- 8% 범위를 나타냈다. 그리고 실제 마약 투약자 소변을 개발한 분석방법을 이용하여 감정한 결과 기존 LLE 방법보다 간편하고 정확한 투약 여부의 확인이 가능하였다.
- 분석하는 감정방법을 제시하였다. 또한 개발된 감정 방법을 메스암페타민 또는 엑스터시 실제 투약혐의자의 소변에 적용한 결과 이들 성분을 신속하고 정확하게 분석할 수 있었다.
- 본 실험방법의 검량곡선은 직선성 상관계수 (r2) 가 0.994 이상이었으며, 검출한계 (LOD)와 정량한계 (LOQ) 는 각각 10.0 ng/mL, 34.0 ng/mL 이하로 측정되었다. 상대 회수율은 5성분 모두 93.
- 0 이상인 경우는 한 성분의 약물을 투약한 것이 아니라, 2종 이상의 약물을 함께 투약한 것으로 추정하였다. 본 연구에서도 두 시료 (NO. 12, 14)를 분석한 결과 AP/MA 대사체 농도비가 1.0 이상인 것으로 보아 MA와 다른 약물을 함께 투약한 것으로 추정할 수 있었다.
- 상대 회 수율은 AP 93.8~103.7%, MA 100.3~107.7 %, MDA 93.5~96.8%, MDMA 98.2~100.8 %, 그리 고 MDEA 99.3~105.1% 로 측정되었다 (Table 3). 정확도 (accuracy) 의 경우, 시험일내 (intra-day) 치우침 값은 AP I.
- 암페타민계 각 대상성분에 대한 검정곡선은 각 정량범위 내에서 상관계수 (I2) 0.994 이상의 직선성을 나타냈다 (Table 2). 검출한계 (LOD) 는 AP 10.
- 1 에 나타냈다. 절대 회수율을 비교한 결과, pH 6에서 AP, MA 성분이 가장 높은 회수율을 나타냈으나, MDA, MDMA, MDEA 성분은 낮았다. pH 8에서는 반대로 MDA, MDMA, MDEA 성분은 높았으나, AP, MA 성분은 낮았다.
- 1% 로 측정되었다 (Table 3). 정확도 (accuracy) 의 경우, 시험일내 (intra-day) 치우침 값은 AP I. 2~10.0%, MA 0.1~8.5%, MDA -8.7~-1.1%, MDMA -7.5~-1.8%, 그리고 MDEA -3.5~-0.2 %였으며 , 시 험일간(inter-day)은 AP -0.3~9.3 %, MA -3.0~3.7%, MDA -2.0~8.1 %, MDMA -0.7~8.9%, 그리고 MDEA 3.1~14.8 %로 나타났다. 정밀도(precision)의 경우, 시험일내 (intra-day) 변동계수 값은 AP 6.
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