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문제 정의
- 본 논문에서는 국내에서 양봉에 허가되어있지 않은 스트렙 토마이신을 극미량까지 정성 및 정량확인이 가능하도록 기존의 고체상(SPE) 시료 전 처리 방법을 개선한 후 LC-MS/MS로 분석하는 방법에 대한 유효성 확인시험을 실시하였다. 확립된 시험 방법을 국내에서 시판되는 벌꿀 시료에 적용한 예를 보여 줌으로써 벌꿀 중의 스트렙토마이신 확인을 위한 시험 방법으로 활용될 수 있으며, 벌꿀 중에서 잔류 실태를 파악함으로써 안전관리 방향을 설정하는 데 활용할 수 있을 것이다.
가설 설정
- 스트렙토마이신이 검출되지 않은 벌꿀 시료 (공시료)에 예측되는 정량한계농도 수준으로 스트렙토마이신을 spike 한 벌꿀 시료 5 g 을 분석하였을 때 정량한계 (LOQ) 농도는 신호대 잡음비(S/N ratio)가 10 이상이며 정밀성을 표현하는 상대 표준편차 (RSD) 가 20% 이하이고 정확성을 나타내는 bias가 ±20%인 조건을 만족하는 농도로 하였을 때 0.75 卩g/kg가 정량한계로 정하였다.
제안 방법
- 3 mL/min, 주입량은 2 ul이었다. HPLC의 이동상은 10 mM ammonium acetate 95%에 아세토나이트릴(ACN)이 5%, formic acid가 0.2% 함유된 이 동상 A와 아세토나이트릴 95%에 10 mM ammonium acetate 5%와 formic acid 0.2%가 함유된 이동상 B 를 Table 1의 기울기 용매 조건으로 사용하였다.
- LC-MS/MS를 이용한 벌꿀 시료에 대한 스트렙토마이신 분석법의 정확성과 정밀성을 평가하기 위하여, 시료 중 스트렙토마이신의 농도가 5.0, 20.0, 50.0 ug/kg 이되도록 spike 한 5 g 의 벌꿀 시료를 각 농도에 대해서 3회 시험하였다.
- 되도록 spike한 벌꿀 시료 5 g을 위의 시료 전 처리 방법으로 분석하고, 이와 동일한 농도의 스트렙토마이신 표준물질을 시료 전 처리를 거치지 않고 직접 동일 조건의 LC-MS/MS에서 분석하여 피크 면적비를 비교하여 회수율을 평가하였다.
- 검량선을 작성하기 위하여 스트렙 토마이신이 검출되지 않은 벌꿀 공 시료 (blank sample) 에 스트렙토마이신의 농도가 0.75, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 40.0, 50.0 ug/kg 이되도록 spike 한 후 2.4의 시료 전처리방법과 동일한 방법으로 처리한 후 LC-MS/MS 에 주입하여 크로마토그램을 얻은 후 검량곡선을 작성하였다.
- 벌꿀 시료에 대한 스트렙토마이신 분석법의 정밀성과 정확성을 평가하기 위하여, 스트렙토마이신의 농도가 5.0, 20.0, 50.0 卩 g/kg 이 되도록 spike 한 5 g 의 벌꿀 시료를 처리하여 분석하였으며 각 농도에 대하여 3번 반복 실험하였다.
- 벌꿀 중에 잔류하는 스트렙 토마이신을 LC-MS/MS 로 분석하기 위해서 HLB 카트리지를 사용한 고체상추출법으로 크로마토그래피 분리에 방해되는 매트릭스를 효과적으로 제거함으로써 스트렙 토마이신을 양호한 추출율, 정밀도, 정확도를 나타내는 분석 방법을 확립하였다. 5.
- 스트렙토마이신을 spike 한 벌꿀 시료 5 g 을 분석하였을 때 정량한계 (limit of quantitation, LOQ) 농도는 신호 대잡음비 (S/N ratio)를 10 이상으로 하고 정밀성이 20% 이하이고 정확성은 bias로써 ±20%인 조건을 만족하는 농도로 정하였다.
- 3의 상단 스펙트럼). 양이온 모드에서 [M+H「인 m/z 582가 base ion 으로 검출되어 이를 선구 이온(precursor ion) 으로 선택하였으며, product ion scan을 통하여 m/z 176, 221, 246, 263, 407 이온이 특성이온을 나타내었으므로 이들을 정성 이온으로 선정하였다(Fig. 3의 하단 스펙트럼).
- 분석 시 MRM 모드로 분석하였다. 이때 각성분별로 collision cell에서 collision energy강도를 조절하여 생성이온 (product ion)의 감응 도가 크도록 조정하였으며, 그 결과 최적의 precursor/product ion pair를 선정하였다.
대상 데이터
- HPLC 칼럼의 고정상으로는 역상 칼럼인 Zorbax Rx-SIL로써 내경 2.1 mm, 길이 150 mm, 입자크기가 5 um의 칼럼을 선택하였으며, 이동상의 유량은 0.3 mL/min로 흘려주었고 칼럼 온도는 실온에서 양호한 결과를 나타내었다.
- 45 pm 크기를 사용하였으며, 초음파 장치는 NEURON FIT사(Tokyo, Japan)의 JAC Ultrasonic 4020 제품, 고체상 추출을 위한 진 공감 압장치로는 Supelco 사 (Bellefonte, PA, USA)의 SPE vacuum manifold 제품을 사용하였다. 고체상 추출 카트리지인 Oasis HLB (hydrophilic lipophilic balance, 60 mg, 3 cc) 카트리지는 Waters 사(Milford, MA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
- 메탄올, 물, 아세토나이트릴은 J.T. Baker사(Phillip- sburg, NJ, USA)의 HPLC 급 고순도 용매를 사용하였고, 아세트산과 이온 쌍 시약으로 사용된 1-heptane- sulfonic acid는 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.
- 분석 장비인 LC-MS/MS는 시료 자동주입기(Agilent 1200 Series G1313A Autosampler)가 장착된 Agilent 사(Palo Alto, CA, USA)의 Agilent 1200 Series HPLC와결합된 Agilent 6410 Triple-Quadrupole 텐뎀 질량분석기이었다. 사용된 HPLC 칼럼은 Zorbax Rx-SIL (2.
- 사용된 HPLC 칼럼은 Zorbax Rx-SIL (2.1 >150 mm (length), 5 pm particle size)이 었으며 , 유량은 0.3 mL/min, 주입량은 2 ul이었다. HPLC의 이동상은 10 mM ammonium acetate 95%에 아세토나이트릴(ACN)이 5%, formic acid가 0.
- 스트렙토마이신 (streptomycin) 표준품은 Riedel- deHaen사 (Seelze, Germany)의 고순도 시약을 사용하였고, 증류수는 Milli-Q system을 통과한 3차 증류수를 사용하였다. 표준품은 증류수를 이용하여 1 mg/ mL 농도로 만든 후 4oC 냉장 보관하였고, 이 용액을 증류수로 희석 하여 사용하였다.
- 시료의 혼합을 위해 사용된 shaker는 EYELA사 (Tokyo, Japan)의 Multi Shaker MMS 제품을 사용하였으며, 시료 농축을 위한 회전증발기도 EYELA 사 (Tokyo, Japan) 의 제품을 사용하였다. 시린지 필터는 National Scientific사(Rockwood, TN, USA)의 0.
- Japan) 의 제품을 사용하였다. 시린지 필터는 National Scientific사(Rockwood, TN, USA)의 0.45 pm 크기를 사용하였으며, 초음파 장치는 NEURON FIT사(Tokyo, Japan)의 JAC Ultrasonic 4020 제품, 고체상 추출을 위한 진 공감 압장치로는 Supelco 사 (Bellefonte, PA, USA)의 SPE vacuum manifold 제품을 사용하였다. 고체상 추출 카트리지인 Oasis HLB (hydrophilic lipophilic balance, 60 mg, 3 cc) 카트리지는 Waters 사(Milford, MA, USA)로부터 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 분석의 선택성과 검출 감도를 향상시키기 위하여 MS/MS 분석 시 MRM 모드로 분석하였다. 이때 각성분별로 collision cell에서 collision energy강도를 조절하여 생성이온 (product ion)의 감응 도가 크도록 조정하였으며, 그 결과 최적의 precursor/product ion pair를 선정하였다.
성능/효과
- 5.0, 20.0, 50.0 ug/kg 농도에서 정밀도는 5.5~14%, 정확도는 bias로써 -10.0~3.8%를 나타내었고 정량한계(LOQ) 는 0.75 ug/kg이었다.
- 또한, ESI 의 양이온 (+) 모드와 음이온 (-) 모드를 비교한 결과 양이 온 모드에서 훨씬 더 좋은 감도를 보였다.
- 스트렙토마이신 표준물질을 대상으로 HPLC 칼럼을 통과시키지 않고 직접 질량분석기로 주입한 후 ESI 와 APCI (atmospheric pressure chemical ionization) 이온화 방법 중에서 이온화가 효과적이며 감도가 좋은 조건을 비교한 결과, ESI 방식에서 검출이 용이하였다. 또한, ESI 의 양이온 (+) 모드와 음이온 (-) 모드를 비교한 결과 양이 온 모드에서 훨씬 더 좋은 감도를 보였다.
- 스트렙토마이신이 검출되지 않은 벌꿀 시료에 0.75, 1.0, 5.0, 10.0, 20.0, 40.0, 50.0 u g/kg의 농도로 스트렙토마이신을 첨가한 후 확립된 시료 전처리방법에 따라서 전처리한 후 LC-MS/MS로 분석한 피크 면적으로부터 검량선을 작성한 결과 상관계수 (coefficient of correlation, r2) 는 0.9904로 CODEX 기준 (r2 > 0.95)에 적합한 직선성을 보였다(Fig. 5).
- 확립된 분석법의 벌꿀 시료에 대한 스트렙토마이신의 회수율을 평가하기 위하여, 시료 중 스트렙토마이신의 농도가 10 ug/kg 이 되도록 spike 한 벌꿀 시료 5 g 을 “2.4 시료전처리”에 기술된 절차에 따라 분석하였고, 이와 동일한 농도의 스트렙토마이 신 표준용액을 시료 전 처리 과정 없이 직접 LC-MS/MS에서 분석한 결과의 피크 면적을 비교한 결과 3회 반복 실험에서 평균 회수율은 74%이었다.
후속연구
- 확립된 분석 방법은 벌꿀 중에 잔류하는 스트렙토마이신을 효과적으로 분석하는 데 이용하였으며, 벌꿀의 안전관리에 이용될 수 있을 것이다.
- 확인시험을 실시하였다. 확립된 시험 방법을 국내에서 시판되는 벌꿀 시료에 적용한 예를 보여 줌으로써 벌꿀 중의 스트렙토마이신 확인을 위한 시험 방법으로 활용될 수 있으며, 벌꿀 중에서 잔류 실태를 파악함으로써 안전관리 방향을 설정하는 데 활용할 수 있을 것이다.
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