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문제 정의
- 본 연구에서는 천연 항생제가 포함된 기능성 가축 사료를 개발하기 위하여 배양이 용이한 효모세포에 박테리오신의 일종인 Subpeptin JM4-A 혹은 Subpeptin JM4-B의 유전자를 도입하여 항균 활성 효모를 제작하였고, 그람 양성 대표 세균인 B.subtilis 및 그람 음성세균 세균인 Escherichia coli, Pseudonomas aerwginosa에 대한 항균 활성을 확인하였다.
- aeruginosa) 에 대해서도 항균 활성을 나타냈다. 이 연구의 결과로 부패하기 쉬운 식품들의 보존성을 향상시키기 위한 보존제 대체물질 또는 가축사료에서 병원균의 생육을 저해하기 위한 항생제 대체물질로 사용할 수 있는 박테리오신을 산업적으로 생산할 수 있는 효모세포를 제작하였다.
- 이 연구의 결과로 부패하기 쉬운 식품의 보존성을 향상시킬 수 있는 보존료 대체물질 혹은 가축사료에서 병원균의 생육을 저해하기 위한 항생제 대체물질로 사용 가능한 박테리오신의 산업적 대량생산에 활용할 수 있는 효모세포들을 제작하였다. 박테리오 신은 세포 표면의 특정 혹은 비 특정 수용체에 부착하여 항균 작용을 나타내며 1차 표적인 세포질막의 막투과성을 변화시켜 막 수송을 방해하거나 proton mo-five force에 영향을 미쳐 에너지 생산과 단백질이나 핵산의 합성을 저해하는 것으로 알려져 있다 [3].
제안 방법
- 1) (주)바이오니아(Seoul, Korea)ofl 의뢰하여 합성하였다. Subpeptin JM4-A와 Subpeptin JM4-B 유전자의 용이한 클로닝 및 발현을 위하여 유전자의 5’ 말단에 제한효소 Xbal 인식부위와 개시코돈 ATG를, 그리고 3’ 말단에 종지코돈 TAA와 제한효소 Xhol 인식부위를 도입하여 oligonucleotide 들을 화학합성하였다(Fig. 2). 제작된 oEgonucleotide들을 annealing하여 이중가닥 DNA로 만든 후, 효모발현벡터 pAUR123의 XM과 Xbal 부위에 연결하였다.
- 대장균형질전환체의 선별을 위해서는 LB 배지에 ampicillin 을 최종 농도가 100 µg/ml가 되게 첨가하여 사용하였다. 고체배지는 LB 배지에 한천(agar)을 1.5%가 되도록 첨가하여 제작하였다.
- aeruginosa KCTC 2004)을 LB 배지를 이용하여 30°C에서 하룻밤 배양하고, 사용 직전에 이를 100배로 희석하였다. 균희석액을 YPD 고체 배지에 도 말하였고, 여기에 pAUR-SubpA 및pAUR-SubpB가 도입된 형질전환 효모와 대조군으로 효모의 발현벡터(pAUR123)가 도입된 형질전환 효모의 배양액을 각각 100 ㎕씩 일정 부위에 접종하였다. 이를 30°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 항균 작용에 의해 형성된 생육 억제환(clear zone)을 비교.
- 그람 양성 대표 세균인 고초균(B. subtilis ATCC 6633)과 그람음성 장내 세균인 대장균(E. coli KCTC 2223), 그람 음성 녹농균(P. aeruginosa KCTC 2004)을 LB 배지를 이용하여 30°C에서 하룻밤 배양하고, 사용 직전에 이를 100배로 희석하였다. 균희석액을 YPD 고체 배지에 도 말하였고, 여기에 pAUR-SubpA 및pAUR-SubpB가 도입된 형질전환 효모와 대조군으로 효모의 발현벡터(pAUR123)가 도입된 형질전환 효모의 배양액을 각각 100 ㎕씩 일정 부위에 접종하였다.
- coli DH5a)를 사용하였다. 대장균(E. coli DH5a)에서 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소 Xhol과 Xbal으로 삽입된 48 bp의 Subpeptin JM4-A 와 Subpeptin JM4-B 유전자 단편을 확인하였다. 구축된 발현 플라스미드를 각각 pAUR-SubpA과 pAUR-SubpB로 명명하고 효모(S.
- 박테리오신 Subpeptin JM4-A와 Subpeptin JM4-B의 유전자는 문헌고 찰[11]을 통해 확보된 DNA 염기서열을 토대로 (Fig. 1) (주)바이오니아(Seoul, Korea)ofl 의뢰하여 합성하였다. Subpeptin JM4-A와 Subpeptin JM4-B 유전자의 용이한 클로닝 및 발현을 위하여 유전자의 5’ 말단에 제한효소 Xbal 인식부위와 개시코돈 ATG를, 그리고 3’ 말단에 종지코돈 TAA와 제한효소 Xhol 인식부위를 도입하여 oligonucleotide 들을 화학합성하였다(Fig.
- 박테리오신의 일종인 Bacillus subtilise] Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B를 생산하는 효모의 제작을 위하여 48 bp 길이의 개시코돈과 종지 코돈을 포함하는 Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B의 유전자를 합성하여 효모발현 vector pAUR123에 클로닝하였다. 이렇게 제작된 재조합 DNA로 효모세포를 형질전환시켜 Subpeptin JN4A와 Subpeptin JM4-B를 생산하는 형질전환 효모세포를 제작하였다.
- 박테리오신의 일종인 Bacillus subtilise] Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B를 생산하는 효모의 제작을 위하여 48 bp 길이의 개시코돈과 종지 코돈을 포함하는 Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B의 유전자를 합성하여 효모발현 vector pAUR123에 클로닝하였다. 이렇게 제작된 재조합 DNA로 효모세포를 형질전환시켜 Subpeptin JN4A와 Subpeptin JM4-B를 생산하는 형질전환 효모세포를 제작하였다. 형질전환 효모는 그람 양성 대표 세균인 고초균(B.
- 균희석액을 YPD 고체 배지에 도 말하였고, 여기에 pAUR-SubpA 및pAUR-SubpB가 도입된 형질전환 효모와 대조군으로 효모의 발현벡터(pAUR123)가 도입된 형질전환 효모의 배양액을 각각 100 ㎕씩 일정 부위에 접종하였다. 이를 30°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 항균 작용에 의해 형성된 생육 억제환(clear zone)을 비교. 관찰하였다.
- 2). 제작된 oEgonucleotide들을 annealing하여 이중가닥 DNA로 만든 후, 효모발현벡터 pAUR123의 XM과 Xbal 부위에 연결하였다. 유전자 클로닝을 위한 숙주로는 대장균 세포(E.
- 2).합성된 oli gonucleotide 들을 annealing하여 얻어 진 이중 가닥 DNA 단편들을 효모발현 vector pAUR123의 제한효소X/zoI와 Xbal부위에 삽입하여 효모발 현 플라스 미드를 구축하였고 이를 각각 pAUR-SubpA와 pAUR-SubpB이 라고 명 명하였다(Fig. 2).
- cerevisiae KCTC 7913)의 형질전환은 electro poration (Cell-Porator, Life technologies, MD, USA) 법으로 행하였다. 형질전환된 효모의 선별은 YPD 배지(1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% D-glucose) 에 aureobacidin A (Takara Korea, Seoul Korea)> 최종 농도가 0.2 jig/ml가 되게 첨가한 후 30°C에서 3일간 배양하여 행하였다.
대상 데이터
- 유전자 클로닝을 위한 숙주로는 대장균 세포(E coll DH5(X)를 사용하였다. 대장균은 LB 배지(1% bacto tryptone, 0.
- 제작된 oEgonucleotide들을 annealing하여 이중가닥 DNA로 만든 후, 효모발현벡터 pAUR123의 XM과 Xbal 부위에 연결하였다. 유전자 클로닝을 위한 숙주로는 대장균 세포(E. coli DH5a)를 사용하였다. 대장균(E.
- 제한효소, T4 polynucleotide kinase, DNA ligation kit ver. 2f Taq DNA polymerase^- Takara Korea (Seoul, Korea)에서 구입하였다.
- 효모의 배양에는 YPD 배지(1% yeast extract, 2% poly peptone, 2% D-glucose)를 사용하였다. 효모의 발현 플라스미드는 alcohol dehydrogenase promoter (ADH)에 의해 발현이 유도되는 pAUR123 (Takara Koreaz Seoul Korea)을 사용하였다.
- 효모의 배양에는 YPD 배지(1% yeast extract, 2% poly peptone, 2% D-glucose)를 사용하였다. 효모의 발현 플라스미드는 alcohol dehydrogenase promoter (ADH)에 의해 발현이 유도되는 pAUR123 (Takara Koreaz Seoul Korea)을 사용하였다.
이론/모형
- coli DH5a)에서 플라스미드 DNA를 분리하고 제한효소 Xhol과 Xbal으로 삽입된 48 bp의 Subpeptin JM4-A 와 Subpeptin JM4-B 유전자 단편을 확인하였다. 구축된 발현 플라스미드를 각각 pAUR-SubpA과 pAUR-SubpB로 명명하고 효모(S. cerevisiae KCTC 7913)의 형질전환은 electro poration (Cell-Porator, Life technologies, MD, USA) 법으로 행하였다. 형질전환된 효모의 선별은 YPD 배지(1% yeast extract, 2% polypeptone, 2% D-glucose) 에 aureobacidin A (Takara Korea, Seoul Korea)> 최종 농도가 0.
성능/효과
- 2 ng/ml에서 가장 효과적으로 형질 전환 콜로니를 형성 하였다(data-not shown). Aureobacidin A의 최종 농도가 너무 낮으면 콜로니 형성은 원활하지만 형질 전환되지 않은 야생효모의 콜로니의 형성 빈도가 높아지고, 최종 농도가 너무 높으면 콜로니 형성이 되지 않거나 형성에 많은 시간을 요한다는 사실을 확인할 수 있었다.
- 그람 양성 대표 세균인 고초균(8. subtilis), 그람 음성 대표 세 균인 대장균(E. coli) 및 그람 음성 녹농균(P. aerwgimsg) 에 대한 형질전환 효모들의 항균 활성을 측정한 결과, pAUR-SubpA 또는 pAUR-SubpB가 도입된 형질전환 효모의 경우는 그람 양 성 고초균, 그람 음성 대장균 및 녹농균 모두에서 생육을 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3). 반면, 효모발현 vec tor (pUAR123)만을 도입한 형질전환 효모의 경우는 이들 세균 모두에서 생육 억제를 나타내지 않았다(Fig.
- aeruginosa 에.대해서는 pAUR-SubpA를 생산하는 형질전환 효모와 pAUR-SubpB를 생산하는 형질전환 효모 모두가 비교적 넓은 생육 억제 환을 나타내는 것이 관찰 되었다(Fig. 3C). 이 연구로 제작된 항균 활성 효모를 사료 첨가물로 활용하기 위해서는 효모 배양조건에 따른 항균 활성 의 영향과 다양한 세균들에 대한 항균 활성의 확인 등을 통한 생산 최적 조건의 검토가 필요할 것으로 생각된다.
- 3A). 또한, 그람 음성 세균인 E. coli 에 대해서는 pAUR-SubpA를 생산하는 형질전환 효모보다 pAUR-SubpB를 생산하는 형질전환 효모가 약간 더 넓은 생육억제 환을 나타내는 것이 관찰되었다(Fig. 3B). 한편, 그람 음성세균인 P.
- 3). 이 결과로 이들 세균 모두에 대해 항균 활성을 나타내는 형질전환 효모가 성공적으로 제작되었음을 확인할 수 있었다. 문헌에 따르면 Subpeptin JM4-A는 그람 양성 세균들에 대해 항균 활성 을 나타내는 것으로 알려져 있으며, Subpeptin JM4^B는 그람 음성세균들에 대해 항균 활성을 나타내는 것으로 알려져 있다[4, 12].
- 2). 형질 전환 효모의 효과적인 선별을 위하여 선별marker로 사용되는 aur- eobacidin A의 최종 농도를 0.1 µg/ml에서 0.5 ug/ml까지 다양하게 사용하여 형질 전환 효모 콜로니의 형성 효율을 검토하였다 그 결과, 이 연구에서는 aureobacidin A의 최종 농도 가 0.2 ng/ml에서 가장 효과적으로 형질 전환 콜로니를 형성 하였다(data-not shown). Aureobacidin A의 최종 농도가 너무 낮으면 콜로니 형성은 원활하지만 형질 전환되지 않은 야생효모의 콜로니의 형성 빈도가 높아지고, 최종 농도가 너무 높으면 콜로니 형성이 되지 않거나 형성에 많은 시간을 요한다는 사실을 확인할 수 있었다.
- 효모(S. cerevisiae)^ pAUR-SubpA 및 pAUR-SubpB를 도입하고 aureobacidin A를 포함하는 YPD 배지에서 선별하여 Subpeptin JM4-A 및 Subpeptin JM4-B 의 발현유전자가 도입된 형질전환 효모를 얻을 수 있었다(Fig. 2). 형질 전환 효모의 효과적인 선별을 위하여 선별marker로 사용되는 aur- eobacidin A의 최종 농도를 0.
후속연구
- 3C). 이 연구로 제작된 항균 활성 효모를 사료 첨가물로 활용하기 위해서는 효모 배양조건에 따른 항균 활성 의 영향과 다양한 세균들에 대한 항균 활성의 확인 등을 통한 생산 최적 조건의 검토가 필요할 것으로 생각된다.
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