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문제 정의
- 그러나 상황버섯의 항산화 효과는 in vitro 실험계를 이용한 1, 1- diphenyl-2 -picrylhydrazyKDPPH) radical과 지질 과산화억제효과에 대해서만 보고되어져 있고 다양한 자유라디칼 억제 효과와 관련된 실험결과는 미비한 상태이다. 그러므로 본 연구에서는 세포의 손상 및 노화 등 각종 질병의 원인이 되는 자유라디칼(superoxide, O『; hydroxyl radical, - OH; nitric oxide, NO; peroxinitrite, ONOC厂)을 유발시키는 다양한 in vitro 실험 계와 자유라디칼에 의한 형광단백질 allophycocyanin 물질의 산화정도를 측정하는 방법을 이용하여 상황버섯 열수 추출물의 항산화 효과를 규명하고자 한다.
제안 방법
- . OH radicale 반응성이 크고 반응속도가 매우 빠른 자유라디칼이므로 ESR을 이용하여 측정하였다(Li et al., 2003). Fig.
- 15CW DPPH 용액과 시료를 각 농도별로 조제한 후에 96- well plate에 각 well당 100/4씩 넣은 다음에 실온에서 30분 동안 차광상태로 방치하고 ELISA reader (Immuno Mini NJ- 2300)로 540nm에서 홉광도를 측정하였다. 양성 대조물로는 ascorbic acid 성분을 이용하였다.
- 50mM phosphate buffer(pH 7.4)에 녹인 SNP 용액과 시료용액를 25℃에서 150분 동안 반응시킨 후, 96-well plate에 각 well당 반응액 150㎕와 Griess 시약 100㎕씩을 넣고 5분 후에 각 well 에 생성된 nitrite 양을 ELISA reader (Immuno Mini NJ-2300)로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조물로 NO 억제효과를 갖는 curcumin 성분을 이용하였다.
- 즉정하는데 이용되는 단백질이다. 96-Well plate에 각 well당 75mM phosphate buffer(pH 7.0)에 녹인 시료용액 2Qd와 37.5nM allophycocyanin 용액 200M를 빠르게 첨가한 후 3 M AAPH 2㎕를 넣은 후부터 90분 동안 일정한 간격으로 fluorescence spectrophotometer(DEKAN SPECTRFlour Plus)로 excitation 598nm, emission 65㎕에서 allophyco- cyanin의 형광도를 측정하였으며, 양성 대조물로는 trolox 물질을 이용하였다.
- 2mM FeSO4, 1 mM DTPA를 첨가한 후 시료와 ImM hydrogen peroxide(H2O2)를 넣고 잘 혼합하여 ESR spectrometer(JEOL FESX, Tokyo, Japan)# 이용하여 spin spectrum을 측정하였다. ESR spectrometer 조건은 microwave power 1.02mW, modulation frequency 9.4201 GHz, field modualation 339.853mT, sweep width 5.000mT time constrant 0.03sec의 조건에서 측정하였다.
- Fenton 반응에 의해 생성되어지는 - OH radicale spin- trapping제인 DMPO 용액과 빠르게 반응하여 생성되는 DMPO-OH adduct를 electron spin resonance(ESR) spectrometer 기기로 측정하고자 microtube에 10% DMPO (v/v), 0.2mM FeSO4, 1 mM DTPA를 첨가한 후 시료와 ImM hydrogen peroxide(H2O2)를 넣고 잘 혼합하여 ESR spectrometer(JEOL FESX, Tokyo, Japan)# 이용하여 spin spectrum을 측정하였다. ESR spectrometer 조건은 microwave power 1.
- 본 연구에서는 3, - OH radical, NO, ONOCr 자유라디칼을 유발시키는 in vitro assay system과 free radical- induced oxidative stress에 의한 단백질 손상에 대한 진흙 버섯 속에 속하는 상황버섯 물 추출물의 항산화 효과를 측정하였다. 상황버섯 물 추출물의 02-, .
- 125mM EDTA, 62//M NBT, 98/zM NADH)과 시료 용액을 넣은 다음에 곧 바로 50mM phosphate buffer에 녹인 33//M PMS 용액을 첨가하여 5분 동안 반응시킨 후, Tecan SPECTRA Fluor 징.비를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조물로는 ascorbic acid 물질을 이용하였다.
- 시료를 농도별로 희석하여 96-well plate에 각 well당 10㎕ 씩 넣고 90mM sodium chloride와 5mM potassium chloride 가 포함된 50mM sodium phosphate buffer(pH 7.4)에 녹인 5mM DTPA 4㎕와 5mM DHR123 0.24 용액을 첨가한 다음에 200/zM SIN-1 시약을 첨가하여 차광상태로 실온에서 10분 동안 반응시킨 후, fluorescence spectrophotometer(DEKAN SPECTRFlour Plus)로 excitation 485nm, emission 535㎕에서 형광도를 측정하였다. 양성 대조물로는 D-L-penicillamine 물질을 이용하였다.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 1, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), sodium nitroprusside(SNP), nitro blue tetrazolium(NBT), ^-nicotineamide adenine dinucleotide disodium salt reduced form(£ -NADH), D-L- penicillamine, 5, 5-dimethyl-l-pyrroline-N-oxide (DMPO), naphtlethylene diaminedihydrochloride, sulfanilamide, diethylenetriaminepenta acetic acid (DTPA), 2, 2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) 등은 Wako사(Osaka, Japan)의 제품을 이용하였다.
- 3-Morpholinosydnonimine(SIN-l), dihydrorhod- aminel23(DHR123), phenazine methosulfate(PMS), ethylenediamine-TV, TV, N\N-tetraacetic acid(EDTA), allophycocyanin, N~acetylcysteine(NAC), ascorbic acid (AA), curcumine, trolox 등은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 1, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), sodium nitroprusside(SNP), nitro blue tetrazolium(NBT), ^-nicotineamide adenine dinucleotide disodium salt reduced form(£ -NADH), D-L- penicillamine, 5, 5-dimethyl-l-pyrroline-N-oxide (DMPO), naphtlethylene diaminedihydrochloride, sulfanilamide, diethylenetriaminepenta acetic acid (DTPA), 2, 2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH) 등은 Wako사(Osaka, Japan)의 제품을 이용하였다.
- 상황버섯은 광주시 소재의 한약상에서 구입하여 중량의 2배 증류수를 첨가하여 1시간 열탕 추출한 후, 45℃ 이하의 수욕 상에서 감압 농축하여 동결 건조시킨 후에 분말시료를 제조하였다.
- 4)에 녹인 SNP 용액과 시료용액를 25℃에서 150분 동안 반응시킨 후, 96-well plate에 각 well당 반응액 150㎕와 Griess 시약 100㎕씩을 넣고 5분 후에 각 well 에 생성된 nitrite 양을 ELISA reader (Immuno Mini NJ-2300)로 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조물로 NO 억제효과를 갖는 curcumin 성분을 이용하였다.
- 24 용액을 첨가한 다음에 200/zM SIN-1 시약을 첨가하여 차광상태로 실온에서 10분 동안 반응시킨 후, fluorescence spectrophotometer(DEKAN SPECTRFlour Plus)로 excitation 485nm, emission 535㎕에서 형광도를 측정하였다. 양성 대조물로는 D-L-penicillamine 물질을 이용하였다.
- 비를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조물로는 ascorbic acid 물질을 이용하였다.
- 540nm에서 홉광도를 측정하였다. 양성 대조물로는 ascorbic acid 성분을 이용하였다.
성능/효과
- 1의 실험결과를 설명하자면, 상황버섯 물 추출물의 02- 생성 저해 효과는 양성 대조물인 AA와 비교하여 뚜렷한 차이를 보이지 않지만 농도 의존적으로 활성이 증가하여 5 또는 10㎍/ml에서 28%와 44%로 AA 성분 26%와 41%보다 약간 높게 억제 효과가 나타났다. NO 생성 억제효과는 양성 대조물인 curcumin 성분보다 낮게 나타났으나 상황버섯 물 추출물 1.0㎍/ml 농도에서 curcumin 성분 13%보다 높은 23% 정도의 NO 생성 억제 효과를 나타냈다. ONOCT 생성 저해효과는 상황버섯 물 추출물이 모든 농도에서 양성 대조물로 이용된 D-L-penicillamine 성분보다 소거능이 낮았지만 농도 의존적으로 소거 활성이 증가하여 10㎍/ml에서 69%의 ONOCT 소거 활성효과를 나타냈다.
- 상황버섯 물 추출물의 02-, . OH radical, NO, ONOCT 자유라디칼 억제효과에서는 실험에 사용된 양성 대조물 보다는 낮게 나타났으나 모든 실험계에서 대조군에 비해 뚜렷하게 자유라디칼 소거효과를 나타냈다. 또한 상황버섯 물 추출물은 산화적스트레스에 의한 단백질 손상 억제효과에서도 대조군에 비해 명확한 저해효과를 나타냈다.
- 0㎍/ml 농도에서 curcumin 성분 13%보다 높은 23% 정도의 NO 생성 억제 효과를 나타냈다. ONOCT 생성 저해효과는 상황버섯 물 추출물이 모든 농도에서 양성 대조물로 이용된 D-L-penicillamine 성분보다 소거능이 낮았지만 농도 의존적으로 소거 활성이 증가하여 10㎍/ml에서 69%의 ONOCT 소거 활성효과를 나타냈다.
- , 1990). 구체적으로 Fig. 1의 실험결과를 설명하자면, 상황버섯 물 추출물의 02- 생성 저해 효과는 양성 대조물인 AA와 비교하여 뚜렷한 차이를 보이지 않지만 농도 의존적으로 활성이 증가하여 5 또는 10㎍/ml에서 28%와 44%로 AA 성분 26%와 41%보다 약간 높게 억제 효과가 나타났다. NO 생성 억제효과는 양성 대조물인 curcumin 성분보다 낮게 나타났으나 상황버섯 물 추출물 1.
- OH radical, NO, ONOCT 자유라디칼 억제효과에서는 실험에 사용된 양성 대조물 보다는 낮게 나타났으나 모든 실험계에서 대조군에 비해 뚜렷하게 자유라디칼 소거효과를 나타냈다. 또한 상황버섯 물 추출물은 산화적스트레스에 의한 단백질 손상 억제효과에서도 대조군에 비해 명확한 저해효과를 나타냈다. 그러므로 상황버섯의 항산화 효과는 상황버섯의 약리학적 효능을 설명하는데 중요한 기초 자료라고 사료된다.
- 1과 같다. 상황버섯 물 추출물의 모든 농도에서 양성 대조군 AA 물질보다 DPPH radical 생성 저해효과가 낮게 나타났으나 농도 의존적으로 DPPH radical 소거효과를 나타냈으며, 대조군에 비해 50% 흡광도 감소를 나타내는 시료의 농도는 50〃g/ml이었다. 현재까지 보고된 상황버섯 추출물에 대한 DPPH radical 소거효과를 보자면, 상황버섯 열수 추출물보다 에탄올 추출물에서 활성이 높게 나타났다(권 등, 2006),
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