내열성 extracellular lipase 생산을 위한 Geobacillus kaustophilus DSM 7263의 배양조건 Culture Conditions of Geobacillus kaustophilus DSM 7263 for Production of Thermophilic Extracellular Lipase원문보기
고온성 균주로 알려진 Geobacillus 속의 다양한 균주로부터 내열성 extracellular lipase를 생산하는 G. kaustophilus DSM 7263를 선별하였다. 우리는 본 균주로부터 lipase를 대량생산하기 위한 최적 조건을 조사하였다. 배양 배지에 다양한 천연오일을 첨가한 결과, lipase의 최적 생장을 위한 탄소원으로는 0.5% 올리브 오일이 최적 조건으로 확인되었다. 본 균주의 생장을 위한 최적온도와 pH는 각각 $55^{\circ}C$와 8.0인 반면, lipase 생산을 위한 최적 온도와 pH는 각각 $50^{\circ}C$와 6.0을 나타내어 최적생육조건과는 다른 양상을 나타내었다. 금속이온에 대한 영향에 대해서는 배지에 $Mg^{2+}$과 $Mn^{2+}$을 첨가한 경우 각각 247%와 157%의 효소 생산이 증가한 반면, $Co^{2+}$, $Fe^{2+}$, $Ni^{2+}$, $Cu^{2+}$는 효소 생산을 저해 하였다. 또한 0.1% (v/v) triton X-100을 첨가하면 대조구에 비해 효소생산과 균의 생장이 모두 증가하는 것으로 나타났다.
고온성 균주로 알려진 Geobacillus 속의 다양한 균주로부터 내열성 extracellular lipase를 생산하는 G. kaustophilus DSM 7263를 선별하였다. 우리는 본 균주로부터 lipase를 대량생산하기 위한 최적 조건을 조사하였다. 배양 배지에 다양한 천연오일을 첨가한 결과, lipase의 최적 생장을 위한 탄소원으로는 0.5% 올리브 오일이 최적 조건으로 확인되었다. 본 균주의 생장을 위한 최적온도와 pH는 각각 $55^{\circ}C$와 8.0인 반면, lipase 생산을 위한 최적 온도와 pH는 각각 $50^{\circ}C$와 6.0을 나타내어 최적생육조건과는 다른 양상을 나타내었다. 금속이온에 대한 영향에 대해서는 배지에 $Mg^{2+}$과 $Mn^{2+}$을 첨가한 경우 각각 247%와 157%의 효소 생산이 증가한 반면, $Co^{2+}$, $Fe^{2+}$, $Ni^{2+}$, $Cu^{2+}$는 효소 생산을 저해 하였다. 또한 0.1% (v/v) triton X-100을 첨가하면 대조구에 비해 효소생산과 균의 생장이 모두 증가하는 것으로 나타났다.
A producer of thermophilic extracellular lipase, Geobacillus kaustophilus DSM 7263, was selected from various microorganisms of the Geobacillus genus. We investigated optimum conditions for mass production of G. kaustophilus lipase. Among the different natural oil media, olive oil was optimal for en...
A producer of thermophilic extracellular lipase, Geobacillus kaustophilus DSM 7263, was selected from various microorganisms of the Geobacillus genus. We investigated optimum conditions for mass production of G. kaustophilus lipase. Among the different natural oil media, olive oil was optimal for enzyme production. The maximum amount of enzyme production was obtained when G. kaustophilus was grown in a medium containing 0.5% olive oil as a carbon source. The pH and temperature for optimal growth were pH 8.0 and $55^{\circ}C$, respectively, while the optimum pH and temperature for lipase production were pH 6.0 and $50^{\circ}C$, respectively. In the presence of $Mg^{2+}$ and $Mn^{2+}$, lipase production was dramatically enhanced by 247% and 157%, respectively, whereas enzyme production was inhibited by $Zn^{2+}$, $Cu^{2+}$, and $Cd^{2+}$. The addition of 0.1% (v/v) triton X-100 increased lipase production and cell growth when compared to the negative control.
A producer of thermophilic extracellular lipase, Geobacillus kaustophilus DSM 7263, was selected from various microorganisms of the Geobacillus genus. We investigated optimum conditions for mass production of G. kaustophilus lipase. Among the different natural oil media, olive oil was optimal for enzyme production. The maximum amount of enzyme production was obtained when G. kaustophilus was grown in a medium containing 0.5% olive oil as a carbon source. The pH and temperature for optimal growth were pH 8.0 and $55^{\circ}C$, respectively, while the optimum pH and temperature for lipase production were pH 6.0 and $50^{\circ}C$, respectively. In the presence of $Mg^{2+}$ and $Mn^{2+}$, lipase production was dramatically enhanced by 247% and 157%, respectively, whereas enzyme production was inhibited by $Zn^{2+}$, $Cu^{2+}$, and $Cd^{2+}$. The addition of 0.1% (v/v) triton X-100 increased lipase production and cell growth when compared to the negative control.
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문제 정의
본 연구에서는 우수한 내열성 extracellular lipase 생산균을 분리하기 위하여 고온균인 Geobacillus 속 균주들로부터 lipase 활성이 높은 균주를 선별하였고, 이 균주의 extracellular lipase 효소 생산을 증가시키기 위해 배양조건을 최적화함으로써 선별균주로 하여금 lipase의 활성을 향상시키고자 하였다.
제안 방법
G. kaustophilus DSM 7263의 lipase 생산을 위해 탄소원의 영향을 조사하였다. 탄소원으로 olive oil, lard oil.
G. kaustophilus의 lipase 생산에 있어 금속이온이 미치는 효과를 알아보기 위하여 최소배지에 2 mM의 금속이온을 첨가하고 50℃에서 36시간 배양한 후 조효소액을 취하여 lipase 활성을 측정하였다(Table 1). Table 1에서와 같이 금속이온 중에서 Mg2+와 Mn2+을 배지에 첨가한 경우, 금속이온을 넣지 않은 대조구에 비해 각각 247%와 157%로 효소 활성이 증가하여 두 가지 금속은 효소 생산에 좋은 영향을 미치는 것으로 나타났다.
Lipase 생산을 위한 최적 pH를 확인하기 위하여 pH 4-11의 범위에서 서로 다른 완충용액을 사용하여 효소활성을 측정하였다. pH 4.
탄소원으로 olive oil, lard oil. fish oil, sesame oil, soybean oil, grapeseed oil, canola oil등의 각종 천연오일을 최소배지에 최종 농도가 0.5%가 되게 첨가하고 50℃에서 36시간 배양한 후 조효소액을 취하여 lipase 활성을 측정하였다. Lipase 활성 측정 결과, olive oil이 가장 활성이 높았고 fish oil, sesame oil에서도 95% 이상의 높은 활성을 보였으며 soybeen oil과 canola oil에서는 약 50%의 활성을 나타냈다(Fig.
반면 lard oil과 grapeseed oil에서는 상대적으로 낮은 활성을 보였다. 가장 높은 활성을 보인 olive oil에 대해서 최소 배지에 0.1%, 0.5%, 1.0%, 1.5% 2.0%의 다양한 농도로 첨가하고, 배양시간대별로 lipase 활성을 측정하였다. 그 결과 Lipase 활성은 olive oil 농도 0.
kaustophilus의 효소 생산을 향상시키는 것으로 나타났다(data not shown). 배양 배지에 triton X-100을 0-1.0% (v/v)까지 다양한 농도로 첨가하여 배양한 후 조효소액을 취하여 효소 활성을 측정하였다. 그 결과 0.
효소 생산을 위해 선별된 균주를 LB배지에서 50℃, 24시간 배양한 후 이 배양액을 0.5% olive oil이 함유된 최소배지(0.7% NaNO3, 0.2% K2HPO4, 0.1% KH2PO4, 0.01% KCl, 0.05% MgSO4·7H2O, 0.001% CaCl2, 0.0012% FeSO4·7H2O, 0.01%(v/v) Trace elements solution (0.026% H3BO3, 0.05% CuCl2·2H2O, 0.05% MnCl2·4H2O, 0.006% Na2MoO4·2H2O, 0.07% ZnSO4·7H2O), 0.1 % yeast extract)에 1% 농도로 접종한 후 50℃,36시간 배양한 후 원심분리(10,000 rpm, 10min)하여 상등액을 회수하였다.
효소 생산을 위한 최적 온도를 측정하기 위하여 30℃, 37℃, 50℃,55℃, 60℃, 70℃에서 배양한 후 효소 활성을 측정하였다.
대상 데이터
내열성 lipase 생산균을 선별하기 위하여 genome 정보에서 lipase 유전자를 모두 보유하는 것으로 잘 알려진 Geobacillus 속의 균주를 선별 대상균주로 삼았다. Geobacillus 속 균주는 한국농업미생물자원센터(KACC)로부터 표준균주 8종(G. caldoxylosilyticus, G. gargensis, G. jurassicus, G. kaustophilus, G. lituanicus, G. pallidus, G. stearothermophilus, G. subterraneus)을 분양 받아 사용하였다. 분양 받은 미생물 중에서 지질 분해균의 선별을 위한 기질로 tributyrin을 사용하였으며 plate assay법[9]으로 lipase 활성이 높은 균주를 선별하였다.
내열성 lipase 생산균을 선별하기 위하여 genome 정보에서 lipase 유전자를 모두 보유하는 것으로 잘 알려진 Geobacillus 속의 균주를 선별 대상균주로 삼았다. Geobacillus 속 균주는 한국농업미생물자원센터(KACC)로부터 표준균주 8종(G.
분양 받은 미생물 중에서 지질 분해균의 선별을 위한 기질로 tributyrin을 사용하였으며 plate assay법[9]으로 lipase 활성이 높은 균주를 선별하였다. 지질 분해균 선별 배지에 균을 접종하여 colony 주위에 투명환(clear zone)을 형성하는 것을 lipase 활성 양성균으로 선별하였고 이들을 1% olive oil nutrient broth에서 배양하여 배양 상등액의 효소활성이 가장 높은 균주를 최종 선별하여 사용하였다.
이론/모형
1로 조정) 1 ml을 첨가하여 90초간 vortex한 후 흡광도 715 nm에서 측정하였다. Lipase 활성 측정은 colorimetric 방법과 Kwon 등의 방법을 병행하여 사용하였고 두 가지 측정값의 평균값을 사용하였다. Lipase의 1 unit는 1분 동안에 1 μmol의 유리지방산을 생산하는 효소 양으로 나타내었다.
subterraneus)을 분양 받아 사용하였다. 분양 받은 미생물 중에서 지질 분해균의 선별을 위한 기질로 tributyrin을 사용하였으며 plate assay법[9]으로 lipase 활성이 높은 균주를 선별하였다. 지질 분해균 선별 배지에 균을 접종하여 colony 주위에 투명환(clear zone)을 형성하는 것을 lipase 활성 양성균으로 선별하였고 이들을 1% olive oil nutrient broth에서 배양하여 배양 상등액의 효소활성이 가장 높은 균주를 최종 선별하여 사용하였다.
1). 8종의 균주를 액체배지에서 배양하여 배양 상등액의 효소활성을 측정한 결과, G. kaustophilus DSM 7263가 가장 높은 활성을 나타내어(data not shown), 이 균주를 내열성 lipase 생산 균주로 최종 선별하였다.
5%가 되게 첨가하고 50℃에서 36시간 배양한 후 조효소액을 취하여 lipase 활성을 측정하였다. Lipase 활성 측정 결과, olive oil이 가장 활성이 높았고 fish oil, sesame oil에서도 95% 이상의 높은 활성을 보였으며 soybeen oil과 canola oil에서는 약 50%의 활성을 나타냈다(Fig. 2). 반면 lard oil과 grapeseed oil에서는 상대적으로 낮은 활성을 보였다.
kaustophilus의 lipase 생산에 있어 금속이온이 미치는 효과를 알아보기 위하여 최소배지에 2 mM의 금속이온을 첨가하고 50℃에서 36시간 배양한 후 조효소액을 취하여 lipase 활성을 측정하였다(Table 1). Table 1에서와 같이 금속이온 중에서 Mg2+와 Mn2+을 배지에 첨가한 경우, 금속이온을 넣지 않은 대조구에 비해 각각 247%와 157%로 효소 활성이 증가하여 두 가지 금속은 효소 생산에 좋은 영향을 미치는 것으로 나타났다. 반면, Co2+, Fe2+, Ni2+, Cu2+는 효소 생산을 저해시키는 것으로 나타났다.
0% (v/v)까지 다양한 농도로 첨가하여 배양한 후 조효소액을 취하여 효소 활성을 측정하였다. 그 결과 0.1% (v/v) triton X-100의 농도에서 배양했을 때 가장 높은 효소생산율을 보였고 균의 생장도 높게 나타났다(Fig. 6). 그러나 0.
0%의 다양한 농도로 첨가하고, 배양시간대별로 lipase 활성을 측정하였다. 그 결과 Lipase 활성은 olive oil 농도 0.5%에서 가장 높은 활성을 나타냈고 균의 생육 정지기인 18시간에서 36시간까지 높은 활성을 유지하였다(Fig. 3). 따라서 lipase 생산을 위해서는 0.
효소 생산을 위한 최적 온도를 측정하기 위하여 30℃, 37℃, 50℃,55℃, 60℃, 70℃에서 배양한 후 효소 활성을 측정하였다. 그 결과 미생물 생장은 55℃에서 가장 높은 생장을 보였고, 효소활성에 있어서는 50℃가 가장 높아 효소 생산을 위한 최적 온도는 50℃로 나타났다(Fig. 5).
subterraneus)을 1% trybutylin을 첨가한 nutrient agar 배지에서 배양하고 생성되는 투명환으로 lipase 생성균을 1차 선별 하였다. 그 결과, 모든 균주에서 투명환이 생성되었고, 그 중 G. kaustophilus DSM 7263가 가장 넓은 투명환을 나타내었다(Fig. 1). 8종의 균주를 액체배지에서 배양하여 배양 상등액의 효소활성을 측정한 결과, G.
3). 따라서 lipase 생산을 위해서는 0.5%의 olive oil 농도가 가장 적합한 것으로 판단되었다.
여러 가지 계면활성제(tween 20, tween 80, triton X-100)를 배지에 첨가하여 lipase 활성을 측정한 결과, triton X-100이 G. kaustophilus의 효소 생산을 향상시키는 것으로 나타났다(data not shown). 배양 배지에 triton X-100을 0-1.
0에서 가장 높은 생장을 보였으나 낮은 pH에서는 미생물 생장이 좋지 않았다. 한편 pH 5.5-7.0 범위에서 배양한 시료에서 비교적 높은 효소활성을 나타냈고, 그 중 pH 6.0에서 가장 높은 값을 나타내어 효소 생산을 위한 최적 pH는 6.0으로 확인하였다. 효소 생산을 위한 최적 온도를 측정하기 위하여 30℃, 37℃, 50℃,55℃, 60℃, 70℃에서 배양한 후 효소 활성을 측정하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Lipase은 어디에서 발견되는가?
3)는 지질과 물의 현탁액 상태에서 triglycerides를 가수분해하여 monoglycerides, glycerol, 유리 지방산을 형성할 뿐만 아니라 alcohol과 지방산으로부터 ester 합성 또는 교환 반응을 촉매하기도 한다[4,11]. 이 효소는 동물의 췌액에서 처음 발견된 이래, 동물의 기관, 식물의 종자 내에 존재함이 밝혀졌으며, 곰팡이, 세균 등의 미생물 유래 lipase도 발견되어 생물계 전반에 널리 분포되어 있음이 확인되었다[2]. 이 중, 미생물이 생산하는 extracellular lipase는 동물과 식물 유래의 lipase 보다 열에 더 안정하므로 산업용 및 진단용 효소로 많은 주목을 받고 있다[17].
Lipase은 어떤 반응을 촉매 하는가?
1.3)는 지질과 물의 현탁액 상태에서 triglycerides를 가수분해하여 monoglycerides, glycerol, 유리 지방산을 형성할 뿐만 아니라 alcohol과 지방산으로부터 ester 합성 또는 교환 반응을 촉매하기도 한다[4,11]. 이 효소는 동물의 췌액에서 처음 발견된 이래, 동물의 기관, 식물의 종자 내에 존재함이 밝혀졌으며, 곰팡이, 세균 등의 미생물 유래 lipase도 발견되어 생물계 전반에 널리 분포되어 있음이 확인되었다[2].
extracellular lipase가 산업용 및 진단용 효소로 많은 주목을 받고 있는 이유는 무엇인가?
이 효소는 동물의 췌액에서 처음 발견된 이래, 동물의 기관, 식물의 종자 내에 존재함이 밝혀졌으며, 곰팡이, 세균 등의 미생물 유래 lipase도 발견되어 생물계 전반에 널리 분포되어 있음이 확인되었다[2]. 이 중, 미생물이 생산하는 extracellular lipase는 동물과 식물 유래의 lipase 보다 열에 더 안정하므로 산업용 및 진단용 효소로 많은 주목을 받고 있다[17]. 높은 온도에서의 효소 반응은 전환율 증가, 기질 용해도 증가, 미생물 오염 방지, 점도 감소 등의 효과가 있기 때문에 내열성 lipase는 산업적으로 매우 유용하다[12,14].
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