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문제 정의
- 이러한 표준시료에 대해 아직까지는 국내에서 직접 제조하는 방법에 관한 연구사례가 보도된 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 시료 내에 존재하는 정확한 생균수를 재현성 있게 측정하기 위하여 세포분열 억제제(bacteriostatic agents)를 사용하여 상온 조건에서도 운반할 수 있는 표준시료를 제작하는 방법을 제시하였고, 상업용으로 판매되는 표준시료와 비교하여 정도관리에 사용 가능성을 평가 하였다.
- 이 연구에서는 표준시료의 운반과 조작과정동안 실온에서도 안정적인 생균 개체수를 유지할 수 있는가를 확인하기 위하여 세포분열 억제제를 첨가하였다. 이는 환경 시료 중 활성세균을 측정하는 DVC (direct viable count)법에서 살아있는 세균의 세포분열을 저해하기 위해 항생물질을 첨가한 방법을 이용한 것이다.
제안 방법
- 9% saline buffer 및 3차 DW였다. 각 희석수 100, 20, 1 ml마다 제품을 녹여서 준비하였다. E.
- 배양 결과 기포가 생성된 것을 대장균 양성으로 판정하고 수질오염공정시험법에 제시되어있는 MPN 표를 이용하여 개체수를 추정하였다. 막여과법은 희석액을 cellulose nitrate 여과지(공극 0.2|im, 직경 45 mm, Whatman, England)에 여과한 뒤, M-Endo 한천배지 (Difco, USA)에 올려 35℃에서 배양 한 후 생성된 붉은색의 금속성 광택을 나타내는 집락을 계수하였으며, 평판집락법은 1ml 희석액을 멸균된 plate에 접종한 후 멸균된 Desoxy cholate 한천 배지(Difco, USA)를 부어 배지와 접종액이 골고루 섞이도록 흔들어준 후 35℃에서 배양, 붉은색 대장균 집락수를 측정하였다.
- 한편, 아무런 처리도 하지 않은 대조구 역시 동일한 방법으로 개체 수를 확인하였다. 모든 실험은 3회씩 반복하여 실시하였다.
- 배양 후 다람발효관에 기포가 생성되어 양성으로 판정된 시험관으로부터 10μ1를 취하여 다람발효관을 넣어 멸균한 BGLB (Brilliant Green Lactose Bile, Difco, USA) 액체 배지에 옮겨 35(2에서 재배양 하였다. 배양 결과 기포가 생성된 것을 대장균 양성으로 판정하고 수질오염공정시험법에 제시되어있는 MPN 표를 이용하여 개체수를 추정하였다. 막여과법은 희석액을 cellulose nitrate 여과지(공극 0.
- 농도는 세포 증가 억제 효과를 48시간까지 지속시키기 위해 예비 실험을 거쳐 Joux 등(20)및 Yokomaku 등(28)의 연구에서 사용된 농도보다 5배 높게 정하였다. 실험구는 분열억제제의 첨가 직후 배양액을 취해 acridine orange (C17H20Cl3N3Zn, Merck; 최종농도 0.1%)로 3분간 염색한 뒤 black polycarbonate 막 여과지(MiHpore, 공극 0.2 |im, 직 경 25 mm)에 여과하여 형광현미 경 (Olympus BX60, Exciting filter B)으류 계수하는 AODC (Acridine Orange Direct Count)법 (19)2로 개체수를 확인하였으며, 이를 초기 개체수(값)로 정하였다. 이후 48시간 동안 실온에 방치 하면서 12시간 단위로 배양액을 취하여 시간의 경과에 따른 개체수 변화를 측정하였다.
- 2 |im, 직 경 25 mm)에 여과하여 형광현미 경 (Olympus BX60, Exciting filter B)으류 계수하는 AODC (Acridine Orange Direct Count)법 (19)2로 개체수를 확인하였으며, 이를 초기 개체수(값)로 정하였다. 이후 48시간 동안 실온에 방치 하면서 12시간 단위로 배양액을 취하여 시간의 경과에 따른 개체수 변화를 측정하였다. 개체수 측정은 AODC컵과 배양액을 EC 한천배지에서 재배양하여 형성된 콜로니를 계수하는 평판집락법을 이용하였다.
- 제조된 대장균 표준시료 내 초기 생균수를 유지시키기 위하여 대장균의 증식을 효과적으로 방해하는 세포분열억제제(21)인 nalidixic acid (Sigma, USA) (18, 20)와 cephalexin(Sigma, USA) (20, 29)을 동시에 첨가한 실험구와 아무 처리도 하지 않은 대조 구를 비교하였다. 첨가한 nalidixic acid 및 cephalexin의 최종 농도는 각각 100 , 50 로 하였다.
- 비교하였다. 첨가한 nalidixic acid 및 cephalexin의 최종 농도는 각각 100 , 50 로 하였다. 농도는 세포 증가 억제 효과를 48시간까지 지속시키기 위해 예비 실험을 거쳐 Joux 등(20)및 Yokomaku 등(28)의 연구에서 사용된 농도보다 5배 높게 정하였다.
대상 데이터
- 2007년 환경오염물질 측정에 관한 정도관리 시행 대상 분석기관은 지방 환경청과 시 . 도 보건환경연구원, 측정대행업소 등을 포함하여 약 1, 200개기관이 선정되었다(4). 미국의 경우 독자적으로 이루어지는 연구사업마다 QA Project Plan (QAPP)를 수립하여 정도관리 및 정도보증을 평가하고 있으며(15), 실험실 및 기관에 대한 정도관리 평가를 국립 환경연구소 인증 협회 (National Environmental Laboratory Accreditation Conference; NELAC)가 따로 담당하고 있다(24).
- 이는 환경 시료 중 활성세균을 측정하는 DVC (direct viable count)법에서 살아있는 세균의 세포분열을 저해하기 위해 항생물질을 첨가한 방법을 이용한 것이다. 사용된 세포분열억제제의 종류는 DVC 시험을 위해 Joux 등(20) 이 제안한 antibiotic cocktail 가운데 대장균에 대한 억제 효과가 높은 nalidixic acid와 cephalexin을 선정하였다. Nalidixic acid는 그람음성 세균의 DNA 합성을 방해하는 물질로(17), 특히 E.
- 시험에 이용되는 희석수 및 분석과정이 개체수 측정에 영향을 주는지 확인하기 위하여 상업적으로 정량 분석이 가능하도록 제작, 판매되는 제품(bioball, BTF, Australia)을 이용하였으며 Escherichia coli (참값은 30 cells/bioball)를 대상으로 하였다. 상업 제품에 대한 평가는 제품 균주를 희석수에 녹여 준비하였으며, 사용된 희석수는 lx PBS (Phosphate buffered saline), 0.
- 정도관리를 위한 표준균주로서 대장균은 서울여자대학교 항생제 내성 균주 은행에서 E. coli를 분양받아 사용하였으며, Luria- Bertani (Difco, USA) 액체배지에 접종하여 35℃에서 24시간 배양한 것을 표준시료로 사용하였다.
이론/모형
- 각 희석수 100, 20, 1 ml마다 제품을 녹여서 준비하였다. E. coli 개체수 측정은 현행 수질 오염공정시험법 상의 방법(7)에 따라 최적확수 시험법(Most Probable Number; MPN), 막여과법, 주입평판법을 적용하였다. MPN법은다람발효관을 넣어 멸균한 lactose 액체 배지(Difco, USA) 10 ml에 희석액을 10, 1, 0.
- 이후 48시간 동안 실온에 방치 하면서 12시간 단위로 배양액을 취하여 시간의 경과에 따른 개체수 변화를 측정하였다. 개체수 측정은 AODC컵과 배양액을 EC 한천배지에서 재배양하여 형성된 콜로니를 계수하는 평판집락법을 이용하였다. 한편, 아무런 처리도 하지 않은 대조구 역시 동일한 방법으로 개체 수를 확인하였다.
성능/효과
- 대장균 공시균주의 상업적 제품, (30 cells/bioball)에 대해 최적확수 시험법(MPN)법을 적용한 결과 희석수에 따라 22±4~50± 20 MPN/bioball로 신뢰성 있는 결과를 얻지 못하였으며, 막 여과법의 경우 희석수마다 오차가 크지 않은 27±1, 30±1 CFU/biobaU 로 비교적 정확한 결과를 얻을 수 있었다. 이는 박 등(6)의 연구에서도 유사하게 나타났다.
- 그러나 이 방법은 시료를 -70℃의 냉동상태로 보관하고 수송하여야 하는 문제점이 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 문제점을 극복하기 위하여 미생물배양액에 분열억제제를 첨가하였으며, 표준시료의 개체수를 실온에서도 일정하게 유지시킬 수 있었다.
- 이는 세포분열억제제를 첨가함으로써 실온에서도 개체수가 비교적 안정적인 미생물 표준 시료를 제작할 수 있게 되었다는 것에 본 연구의 의의가 있다. 또한 본 연구에서 제조한 표준시료는 제조하는 자가 세포분열 억제제를 첨가하기 전 배양 시간을 조절함으로써 표준시료 내 미생물의 밀도를 조절 할 수 있다. 따라서 실제 환경에서 많은 양이존재하는 총대장균군의 정도관리에 더욱 적합할 것이라고 판단된다.
- 세포분열억제제 첨가 후 최초의 접종량은 AODC법 기준으로 6.6x104, 3.7x10s, 4.5x106 cells/ml이었으며, 평판도말법 기준으로는 5.3x102, 3.4x103, 1.2xl04 CFU/ml이었다. 아무것도 처리하지 않은 대조구와 세포분열억제제를 첨가한 실험구를 동일한 조건에서 배양하여 현미경으로 관찰했을 때 대조구는 개체수가 크게 증가한 반면, 분열억제제를 첨가한 시료에서는 세포의 크기만 증가되었을 뿐 세포분열은 일어나지 않았음이 확인되었다(Fig.
- 9% saline buffed lx PBS에 용해한 경우에는 각각 21±4, 14 ±10 CFU로 상당히 낮은 값을 나타났다(Table 1). 실험 결과 3차 증류수를 사용했을 때 대체로 참값에 근사한 결과를 얻을 수 있었으나 실험 방법 간에 차이를 보여 희석수 자체의 영향은 크지않은 것으로 판단되었다. 한편 세 가지 배양법 중 막여과법을 적용했을 때 가장 정확한 결과를 얻을 수 있었다.
- 2xl04 CFU/ml이었다. 아무것도 처리하지 않은 대조구와 세포분열억제제를 첨가한 실험구를 동일한 조건에서 배양하여 현미경으로 관찰했을 때 대조구는 개체수가 크게 증가한 반면, 분열억제제를 첨가한 시료에서는 세포의 크기만 증가되었을 뿐 세포분열은 일어나지 않았음이 확인되었다(Fig. 1). 또한 acridine orange로 염색한 결과 대조구는 초록색으로, 실험 구는 주황색으로 염색이 되었는데, Hobbie 등(19)의 연구에서 RNA 함량이 많아 활성이 높은 세포는 붉은색으로, 활성이 낮은 세포는 녹색으로 보인다고 보고하여, 세포분열억제제를 첨가하는 방법은 세포의 활성은 그대로 유지시키면서 증식만을 차단할 수 있는 방법임을 알 수 있었다.
- 보관이 가능하다는 장점이 있다. 이렇게 제작된 시료의 개체 수를 시간에 따라 측정한 결과, 대장균의 경우 nalidixic acid 와 cephalexin을 각각 100)xg/ml, 50Rg/ml로 주입했을 때 실온에서 48시간동안 개체수의 변화가 평균적으로 92~111%의 정확도를 보여 비교적 일정하게 유지되는 것으로 확인되어 정도 관리에 적합한 시료를 제작할 수 있었다. 이는 세포분열억제제를 첨가함으로써 실온에서도 개체수가 비교적 안정적인 미생물 표준 시료를 제작할 수 있게 되었다는 것에 본 연구의 의의가 있다.
- 이는 박 등(6)의 연구에서도 유사하게 나타났다. 즉, 막여과법으로 실험했을 때 측정된 값이 참값의 9:沁95.1% 범위이었으나, 최적확수 시험법의 경우 160~180%의 범위로 크게 벗어나서 위양성이 높은 것으로 나타났다. Edberg 등(13) 역시 최적확수 시험법의 경우, 시료 내에 개체 수가 많을 경우 유효범위 내의 결과가 나올 때까지 여러 단계의 희석과정을 거쳐야 하기 때문에 종종 위양성 및 위음성에 의한 변칙적인 결과가 발생한다고 주장하였다.
- 2xl05 cells/ml로 큰 차이를 보이지 않았다. 평판배양법에 의한 결과 역시 접종시료 1 ml 당 개체수가 1.2x104 cells였을 때 배양시간에 따른 변화는 1.0~ 1* .2x10 CFU/ml로 대장균의 증가가 거의 없는 것으로 관찰되었다(Fig. 2).
- 실험 결과 3차 증류수를 사용했을 때 대체로 참값에 근사한 결과를 얻을 수 있었으나 실험 방법 간에 차이를 보여 희석수 자체의 영향은 크지않은 것으로 판단되었다. 한편 세 가지 배양법 중 막여과법을 적용했을 때 가장 정확한 결과를 얻을 수 있었다.
- 한편, 평판집락법으로 배양한 경우, 제품을 3차 DW로 용해시켜 사용했을 때는 29±2 CFU로 비교적 정확하게 조사된 반면 0.9% saline buffed lx PBS에 용해한 경우에는 각각 21±4, 14 ±10 CFU로 상당히 낮은 값을 나타났다(Table 1). 실험 결과 3차 증류수를 사용했을 때 대체로 참값에 근사한 결과를 얻을 수 있었으나 실험 방법 간에 차이를 보여 희석수 자체의 영향은 크지않은 것으로 판단되었다.
후속연구
- 한편, 분열억제제를 첨가하는 방법은 표준시료의 제조시에만 아니라, 환경시료의 변질을 최소화하고 보존 기간을 연장시켜 주는 방법으로도 활용 가능할 것으로 보인다. 즉, 분석 기관에서는 시료의 채취 시 현장에서 세포분열 억제제를 첨가하는 간단한 조작만으로도 환경 시료 내 미생물 농도를 유지시킴으로써 시료의 보존을 용이하게 하는 유용한 방법으로도 활용 될 수 있을 것으로 해석된다.
- 따라서 정도관리용 미생물 표준시료를 신속히 마련하여 국내 측정기관의 정도관리 및 정도보증에 활용하여야 한다. 한편, 분열억제제를 첨가하는 방법은 표준시료의 제조시에만 아니라, 환경시료의 변질을 최소화하고 보존 기간을 연장시켜 주는 방법으로도 활용 가능할 것으로 보인다. 즉, 분석 기관에서는 시료의 채취 시 현장에서 세포분열 억제제를 첨가하는 간단한 조작만으로도 환경 시료 내 미생물 농도를 유지시킴으로써 시료의 보존을 용이하게 하는 유용한 방법으로도 활용 될 수 있을 것으로 해석된다.
- 현재 숙련도 검사를 위한 정도관리 표준시료로 이용되고 있는 상업적 제품뿐 아니라 본 연구를 통해 제작된 표준시료를 이용한다면 다양한 개체수를 갖는 미지의 시료에 대한 참값을 검출할 수 있는가에 대한 정량적인 정도관리를 이행 할 수 있을 것이다. 따라서 정도관리용 미생물 표준시료를 신속히 마련하여 국내 측정기관의 정도관리 및 정도보증에 활용하여야 한다.
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