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문제 정의
- . 보호종으로 지정된 갯방풍을 각 지새지별로 수집하여 ITS 염기서열과 RAPD 분석을 통해 이들의 자생지별 유전적 변이양상을 파악하고 진화경향성 및 유전다양성 분석을 통해 계통분류학적 유연관계와 유전 특성을 연구하여 보존 및 복원에 활용할 수 있는 유용한 정보와 관리상 중요지침 설정을 위한 유전학적인 정보를 제공하고자 하였다.
제안 방법
- -70℃에 보관 중인 생체시료를 액체질소와 막자사발을 이용하여 분말상태가 되도록 마쇄한 후, Plant Genomic DNA Prep Kit(SolGent, Korea)을 이용하여 추출 . 정제하였다.
- ITS 염기서열 분석을 통한 갯방풍의 지역별 유전변이 및 유선 다양성 분석에서 이들이 변이가 적고 안정적인 유전 특성을 보임에 따라, 보다 정확한 유전다양성과 분자 진화적 유연관계 분석을 위하여 RAPD 분석을 통한 전체 genome 의 polymoTiehism 분석을 실시하였다. 국내·외 14개 지역에서 수집한 갯방풍(표 1)의 집단 간 RAPD 분식을 동한 유연관계 분석을 위하여 4개의 OPA, 10개의 OPB, 4개의 OPC 및 6개의 OPD primer(표 2)를 포함하는 총 24개의 random 10-mer primer를 이용하여 PCR 증폭하였다.
- ITS부위 PCR 증폭산물은 1.5% agarose gel상에서 1 kb plus DNA ladder(Solgent. Korea)와 함께 전기영동 하여 EtBr로 염색하여 관찰하였다 확인된 증폭산물을 agarose gel 로부터 회수하여 PCR & Gel Purification Kit (SolGent, Korea)를 이용하여 분리 . 정제한 뒤, pGEM-T Easy Vector Systems(Promega, USA) 에 삽입하였다.
- 이들 14개의 primer에 의해 증폭된 RAPD 증폭 산물들은 150 bp에서 2, 500 bp 시-이의 구간에서 2-8개로 다양하게 존재함을 알 수 있었디<Figure 2). Polymorphism을 보이는 14개 primer로부터 얻은 모든 RAPD 증폭 산물들을 GeneTools program(SynGene, UTC)을 이용하여 각 지역별 갯방풍 시료의 DNA band들을 비교 . 분석한 결괴; 지역별로 특이한 polymorphic pattern을 관찰할 수는 없었지만 일부 지역에서 공통적인 차이점을 보임을 알 수 있었다.
- RAPD DNA fingerprinting 패턴 분석에 의한 지역별 유연관계는 각각의 RAPD 10-mer primer를 이용하여 증폭한 산물을 1.5% agarose gel 에 1 kb plus DNA ladder(Solgent, Korea)와 힘께 전기영동 후, EtBr 염색을 통해 image analysis system( SynGene, UK) 으로 촬영하여 image를 확보하였다. 확보된 각 primer별 RAPD 증폭 결과를 GeneTools program(SynGene, UK) 으로분석하여 지역별 시료의 증폭 패턴을 분석한 후 primer별분석결과를 GeneDirctory program을 이용하여 지역별 polymorphism에 대한 library를 구축하고 지역별 libraty 간의 비교를 통하여 유전적 유사도와 UPGMA 유연관계를 분석하였다.
- RAPD 분석을 위한 PCR 증폭은 William의 방법(1990) 을8) 수정하여 Operon사의 RAPD 10-mer Kits 중 4종의 RAPD kit(OPA, OPB, OPC, 및 OPDX 이용하여 수행하였다.표 2). 으F 20 ng의 total DNA와 30 pmole의 RAPD primer 및 2 uit 의 DNA polymerase 를 30 ㎕의 lx반응용액(75 mM Tris-HCL(pH 8.
- 동정 자문회의를 거쳐 기원을 확정한 후 사용하였다(표 1). Total DNA 추출에 사용된 갯방풍은 이들 지역에서 수집한 생체시료의 지상부(잎과 줄기)를 -70℃에 보관하여 total DNA 를 추출하고 특정부위 증폭 및 RAPD 분석에 사용하였다
- polymoTiehism 분석을 실시하였다. 국내·외 14개 지역에서 수집한 갯방풍(표 1)의 집단 간 RAPD 분식을 동한 유연관계 분석을 위하여 4개의 OPA, 10개의 OPB, 4개의 OPC 및 6개의 OPD primer(표 2)를 포함하는 총 24개의 random 10-mer primer를 이용하여 PCR 증폭하였다. 증폭 산물을 1.
- 멸종위기 보호종의 효율적인 보전이나 이용에 있어서 개체군의 유전학저 생태학적 특성을 파악하고 멸종위기 . 보호종의 개체군 집딘의 변화를 예측하는 것은 중요한 일이라고 할 수 있겠다 개체군의 보존에 있어 생태적 .
- 보다 징확한 지역별 분자진화적 유연관계를 확인하기 위하여 14개 primer에 의해 증폭된 지역별 선체 RAPD polymorphic 증폭산불들의 분석결괴를 GeneDirectory pro- gram(SynGene, UK)을 이용하여 각 지 역별 polymorphic library 를 구축하고 각각의 지역별 library 의 비교를 통하여 지역 간의 유전적 유사도와 분자진화적 유인 관계를 분석하였다(Figure 3). 지역별 유전적 유사도에 있어서는 중국 1(CN 1)과 영광(YG)의 유전유사도가 0.
- 본 연구는 해방풍의 기원식물이며 멸종위기 보호종으로 지정되어있는 갯방풍을 국내·외 14개 자생지로부터 확보하여 ITS 염기서열 분석과 유전체 RAPD 분석으로 지역별 유전변이와 유전다양성 및 분자진화적 유연관계를 분석하여 다음과 같은 결론을 얻었다
- 정제하였다. 분말상태의 생체시료 약 50 mg을 1.5 ml E-tube 에 분취하고 Cell Lysis Solution 500 ㎖를 넣고 잘 섞어준 다음, Protease-K(20 mg/ml) 8 ㎖를 넣고 가볍게 vortexing 한 뒤, 65℃에서 30분간 incubation하여 lysis 시켰다 Lysis 시킨 시료를 얼음에서 5분간 냉각시킨 뒤 Protein Precipitation Solution 200 ㎖를 첨가하여 잘 섞어 13, 000 rpm에서 10분간 원심분리 하였다 원심분리 후상층엑 600 ㎖를 취하여 제조사의 사용자 지침에 따라 분리하여 최종 50 ㎖(45 ng/㎖)의 정제된 total DNA를 확보하였다
- 삽입된 ITS부위 증폭산물은 XLl-Blue MRF' competent cell(Stratagene, USA)에 형질전환한 뒤, ampicilline X-gMPTG가 첨가된 LB agar 배지에 도말하여 약 16시간 배양하였다. 선별된 white colony를 LB broth에 배양하여 Plasmid mini preparation kit(Sol Gent, Korea)를 이용하여 plasmid DNA를 분리하고, EcoRI 제한효로로 절단하여 증폭산물의 삽입유무를 확인하였다 ITS 부위의 염기서열 분석을 위해 증폭산물이 삽입된 plasmid DNA를 T7과 SP6 primer로 ABI3730 automatic DNA sequencer (Applied Biosystems, USA) 를이용하여 염기서열을 분석하고 긱각의 ITS부위 염기서열을 확정하였다
- 표 2). 으F 20 ng의 total DNA와 30 pmole의 RAPD primer 및 2 uit 의 DNA polymerase 를 30 ㎕의 lx반응용액(75 mM Tris-HCL(pH 8.8), 20 mM (NH4)SO4, 0.1%(v/v) Tween 20, 20 pM dNTP, 200 liM MgC12) 에 각각 첨가하여 DNA Engine Dyad Thermal Cycler(MJ research, USAX 이용하여 증폭하얏1 다. 반응조건은 95℃에서 5분간 predenaturation한 후 95 ℃ 에서 30초 denaturation, 46 ℃ 에서 30초 annealing, 72℃에서 45초 extension을 30회 수행하고 마지막으로 7 2 ℃에서 5분간 extension 시켰다.
- 의 20 ng 의 total DNA와 20 pmole의 ITS1 과 ITS4 primer 및 2 uiit의 DNA polymerase를 30 ㎕의 IX반응용액(75 mM Tris-HCL(pH 8.8), 20 mM (NI-I4)SO4, 0.1%(v/v) Tween 20, 20 pM dNTP, 200 pM MgC12) 에 각각 첨가하여 DNA Engine Dyad Thermal Cycler(MJ research, USA)를 이용하여 증폭하였다. 반응조건은 95℃에서 5분간 predenaturation한 후 95℃ 에서 30초 denaturation, 51℃ 에서 40초 annealing, 72℃에서 1분 extension을 30회 수행하고 마지막으로 72℃ 에서 10분간 extension 시켰다.
대상 데이터
- 지역별 유전특성 분석에 사용된 시료로는 갯방풍 국내 12 개 자생지와 2개 중국 자생지에서 수집하여 분류 . 동정 자문회의를 거쳐 기원을 확정한 후 사용하였다(표 1).
데이터처리
- 5% agarose gel 에 1 kb plus DNA ladder(Solgent, Korea)와 힘께 전기영동 후, EtBr 염색을 통해 image analysis system( SynGene, UK) 으로 촬영하여 image를 확보하였다. 확보된 각 primer별 RAPD 증폭 결과를 GeneTools program(SynGene, UK) 으로분석하여 지역별 시료의 증폭 패턴을 분석한 후 primer별분석결과를 GeneDirctory program을 이용하여 지역별 polymorphism에 대한 library를 구축하고 지역별 libraty 간의 비교를 통하여 유전적 유사도와 UPGMA 유연관계를 분석하였다.
이론/모형
- ITS 부위 PCR 증폭은 White 등(1990)을8) 이용한 nSl(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG-3')고]- ITS4(5Z-TCC TCC GCT GAT TGA TAT G>3)를사용하였다. 의 20 ng 의 total DNA와 20 pmole의 ITS1 과 ITS4 primer 및 2 uiit의 DNA polymerase를 30 ㎕의 IX반응용액(75 mM Tris-HCL(pH 8.
성능/효과
- 1. ITS 염기서열 분석을 통한 갯방풍의 유전변이 탐색 결과, ITS2 부위는 유전변이가 전혀 발생하지 않았으며, ITS1 부위는 27번째와 178번째 염기에서 변이가 발행함을 알 수 있었다. 하지만 두 염기의 변이는 지역적인 특성을 나타내지는 않았다.
- 2. 10-mer random ptimer를 이용한 14개 지역의 갯방풍 유전체 지문분석으로 polymorphism을 분석한 결과, 갯방풍은 비교적 높은 유전적 유사도를 보이며 유전적으로 안정된 진화의 경향을 보이지만 분자진화적 유연관계 분석에서 인접지역과 밀접한 연관성을 보이지 않았을 뿐만 아니라, 전체적으로 서해권 남해권 동해권으로 나눈 권역과 남부권 중부권으로 나눈 권역에서 유집을 형성하지 않음을 알 수 있었다.
- 3. 이상의 결과로부터 갯방풍의 유전적 특성을 결정짓는 것은 기후적인 요건이나 토양과 같은 요소보다는 서식지 내의 개체수, 서식지의 식생구조 등과 같은 요소들이 더 중요한 요소로 작용할 수 있음을 유추할 수 있었다
- ITS 염기서열 분석에 의한 유전변이 및 유전체 RAPD 분석을 통한 갯방풍 14개 자생지의 지역별 유연관계 분석 결과를 종합하면, 갯방풍은 변이가 쉽게 발생하지 않으며, 전체적으로 높은 유전적 유사도를 보이면서 각각의 유 집을 형성하는 분자진화적 유연관계를 보이는 것으로 보아 세대를 거치면서 안정적으로 진화하는 유전특징을 가지는 식물 종으로 판단된다.
- 이와는 달리 OPCI primer의 경우에는 고성 영덕, 영굉; 부안 및 중국 시료에서 약 400 bp 크기의 band가 증폭되지 않았다(Figure 2). RAPD 분석 결과로부터 얻은 polymorphic 증폭산물의 지역별 pattern을 분석한 결과, 갯방풍은 이전에 보고한 천문농과는 다르게 인접한 자생지와 비슷한 양상을 보이지 않았다.
- 확인하였다. 각 지역별 ITS1과 ITS2 염기서열을 비교한 결과, ITS1의 경우는 27번째 염기와 178번째 염기가 일부지역에서 변이가 발생함을 관찰하였으나 전체 99 % 이상의 높은 유사도를 보였다. ITS2의 경우는 모든 지역별 시료에서 유전변이가 전혀 발생하지 않아 전 지역의 염기서열이 100% 일치하였다(Figure 1).
- 국내·외 14개 지역에서 수집한 갯방풍의(표 1) ITS 염기서열 분석을 통한 지역별 유전변이 탐색을 위해 ITS1 primer 와 ITS4 primer를 이용하여 증폭한 PCR 증폭 산물의 nucleic acid 염기서열을 해석한 결과, 갯방풍의 rDNA-ITS 유전자 부위는 총 629 bp의 염기로 구성되어있음을 확인하였다. 각 지역별 ITS1과 ITS2 염기서열을 비교한 결과, ITS1의 경우는 27번째 염기와 178번째 염기가 일부지역에서 변이가 발생함을 관찰하였으나 전체 99 % 이상의 높은 유사도를 보였다.
- 본 연구에서 갯방풍 ITS 염기서열의 변이가 해안가에서 자생하지 않는 중국의 2개 지역과 해안가에서 자생하는 국내 12개 지역의 갯방풍이 특징적인 차이를 보이지 않는 것을 볼 때, 갯방풍의 유전변이는 서식지의 토양이나 기후 등의 영향을 받아 발생하는 것이 아니라 각 개체들이 세대를 거치며 발생하는 것으로 추측된다. 하지만 이러한 유전변이가 ITS 부위의 염기서열 전체에 걸쳐 임의로 발생하지 않고 특정한 부위ITS1의 27번째와 178번째 염기)에서 특징적으로 나타나는 것으로 보아 일정한 변이의 특징을 가짐을 알 수 있었다.
- Polymorphism을 보이는 14개 primer로부터 얻은 모든 RAPD 증폭 산물들을 GeneTools program(SynGene, UTC)을 이용하여 각 지역별 갯방풍 시료의 DNA band들을 비교 . 분석한 결괴; 지역별로 특이한 polymorphic pattern을 관찰할 수는 없었지만 일부 지역에서 공통적인 차이점을 보임을 알 수 있었다. OPA2 primer의 경우는 부안과 태안1 시료가 약 550 bp 크기의 band가 증폭되지 않는 반면, 양양, 영광 및 울진에서는 약 300 bp 크기의 band가 증폭되지 않았음을 알 수 있었다(Figure 2).
- ITS2의 경우는 모든 지역별 시료에서 유전변이가 전혀 발생하지 않아 전 지역의 염기서열이 100% 일치하였다(Figure 1). 뿐만 아니라, ITS1 부위에 발생한 2개의 염기서열 변이가 지역적인 특성을 가지고 나타나는 것이 아니라 일부지역에서만 일어남을 알 수 있었다. 이러한 결과는 Soltis와 Kuzoff(1993)에 의해 보고된 산형과 식물 Lomatium grayi 8개 집단의 ITS 염기서열 변이 연구에서도 2개의 염기에서만 변이가 발생히는것과 비슷한 양상을 보였다2d 하지만 앞서 보고된 천문동이나 제주도 황근 집단의 ITS 염기서일의 경우는 많은 수의 염기서열 변이와 길이 변이가 발견되어 갯방풍과는 대조적인 양상을 보였다.
- 지역별 library를 이용한 UPGMA 방식의 phylogenetic tree를 작성하여 분자진화적 유연관계 분석 결과, 양양(YY)과 고성2(GS 2), 중국 1(CN 1)과 중국 2(CN 2), 해님(HN)과 제주(JJ), 태안 1(TA 1)과 부안 (BA) 그리고 울진(UJ)과 강릉(KN)이 유전적으로 가까운 것으로 나타났으나, 영덕(YD)과 영광(YG) 그리고 태안 2(TA 2)의 경우는 인접지역과의 밀접한 연관관계를 보이지 않았다(Figure 3). 뿐만 아니라, 전체적으로 서해권, 남해권 그리고 동해권으로 권역을 나누거나 위도를 기준으로 권역을 나누었을 경우에도 특징적인 group의 형성이나 유연관계를 보이지 않았다 이러한 결과는 ITS 염기서열 분석에서 지역적인 특징을 보이지 않은 것과 비슷한 결과로 갯방풍의 유전적 특성을 나타내는 하나의 결과로 추측할 수 있다.
- 국내·외 14개 지역에서 수집한 갯방풍(표 1)의 집단 간 RAPD 분식을 동한 유연관계 분석을 위하여 4개의 OPA, 10개의 OPB, 4개의 OPC 및 6개의 OPD primer(표 2)를 포함하는 총 24개의 random 10-mer primer를 이용하여 PCR 증폭하였다. 증폭 산물을 1.5% agarose gel에 전기영동하여 polymo- rphism을 분석한 결고}, 6개의 primer는 일정한 pattern의 증폭 산물을 확인할 수 없었으며 4개의 primer는 monomorphic band들만 증폭됨을 알 수 있었다(Figure 2A). 반면 이들 10개의 primer를 제외한 14개 primer의 중폭 산물은 polymorphic band들을 확인할 수 있었다.
- 82로 가장 높게 나타났다. 지역별 library를 이용한 UPGMA 방식의 phylogenetic tree를 작성하여 분자진화적 유연관계 분석 결과, 양양(YY)과 고성2(GS 2), 중국 1(CN 1)과 중국 2(CN 2), 해님(HN)과 제주(JJ), 태안 1(TA 1)과 부안 (BA) 그리고 울진(UJ)과 강릉(KN)이 유전적으로 가까운 것으로 나타났으나, 영덕(YD)과 영광(YG) 그리고 태안 2(TA 2)의 경우는 인접지역과의 밀접한 연관관계를 보이지 않았다(Figure 3). 뿐만 아니라, 전체적으로 서해권, 남해권 그리고 동해권으로 권역을 나누거나 위도를 기준으로 권역을 나누었을 경우에도 특징적인 group의 형성이나 유연관계를 보이지 않았다 이러한 결과는 ITS 염기서열 분석에서 지역적인 특징을 보이지 않은 것과 비슷한 결과로 갯방풍의 유전적 특성을 나타내는 하나의 결과로 추측할 수 있다.
- 발생하는 것으로 추측된다. 하지만 이러한 유전변이가 ITS 부위의 염기서열 전체에 걸쳐 임의로 발생하지 않고 특정한 부위ITS1의 27번째와 178번째 염기)에서 특징적으로 나타나는 것으로 보아 일정한 변이의 특징을 가짐을 알 수 있었다. 이러한 결과는 갯방풍이 기후나 토양 등과 같은 생육조건이 이들의 유전적 다양성이나 특성에 중요한 영향을 미치는 요소가 아닐 수도 있다는 암시하는 것이다.
후속연구
- 판단된다. 이러한 연구는 앞으로 멸종위기 약용식물인 갯방풍의 보다 정확하고 객관적인 유전특성을 이해하고 보존은 물론, 나아가서는 한의학적 유용 생물자원인 갯방풍의 현지외 복원 및 재배에 유용한 자료를 제공할 것이다.
- 하지만 갯방풍의 보다 정확한 유전변이와 유전 다양성을 파악하기 위해서는 각 서식지별로 보다 많은 개체를 이용한 서식 지내 개체별 ITS 염기서열 분석을 통한 유전변이의 확인과 이를 토대로 한 개체군 상호간의 ITS 염기서열 비교가 필요하며, RAPD 분석에 있어서도 서식지별로 15-20개의 개체를 무작위로 수집하여 각 지역별로 일정한 특성을 보이지 않고 나타나는 polymorphic pattern들이 서식 지내 개체 간에도 발생하는지에 대한 보다 폭넓은 확인이 필요한 것으로 판단된다. 이러한 연구는 앞으로 멸종위기 약용식물인 갯방풍의 보다 정확하고 객관적인 유전특성을 이해하고 보존은 물론, 나아가서는 한의학적 유용 생물자원인 갯방풍의 현지외 복원 및 재배에 유용한 자료를 제공할 것이다.
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