Stem cells have self-renewal capacity, long-term viability, and multiline age potential. Adult bone marrow contains mesenchymal stem cells. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) are progenitors of skeletal tissue components and can differentiate into adipocytes, chondrocytes, osteoblast...
Stem cells have self-renewal capacity, long-term viability, and multiline age potential. Adult bone marrow contains mesenchymal stem cells. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) are progenitors of skeletal tissue components and can differentiate into adipocytes, chondrocytes, osteoblasts, and myoblasts in vitro and undergo differentiation in vivo. However, the clinical use of BMSCs has presented problems, including pain, morbidity, and low cell number upon harvest. Recent studies have identified a putative stem cell population within the adipose tissue. Human adipose tissue contains pluripotent stem cells simillar to bone marrow-derived stem cells that can differentiate toward the osteogenic, adipogenic, myogenic, and chondrogenic lineages. Human adipose tissue-derived stem cells (ATSCs) could be proposed as an alternative source of adult bone marrow stem cells, and could be obtained in large quantities, under local anesthesia, with minimal discomfort. Human adipose tissue obtained by liposuction was processed to obtain ATSCs. In this study, we compared the osteogenic differentiation of ATSCs in a specific osteogenic induction medium with that in a non-osteogenic medium. ATSCs were incubated in an osteogenic medium for 28 days to induce osteogenesis respectively. Osteogenic differentiation was assessed by von Kossa and alkaline phosphatase staining. Expression of osteocyte specific bone sialoprotein, osteocalcin, collagen type I and alkaline phosphatase, bone morphogenic protein 2, bone morphogenic protein 6 was confirmed by RT-PCR. ATSCs incubated in the osteogenic medium were stained positively for von Kossa and alkaline phosphatase staining. Expression of osteocyte specific genes was also detected. Since this cell population can be easily identified through fluorescence microscopy, it may be an ideal source of ATSCs for further experiments on stem cell biology and tissue engineering. The present results show that ADSCs have an ability to differentiate into osteoblasts. In the present study, we extend this approach to characterize adipose tissue-derived stem cells.
Stem cells have self-renewal capacity, long-term viability, and multiline age potential. Adult bone marrow contains mesenchymal stem cells. Bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs) are progenitors of skeletal tissue components and can differentiate into adipocytes, chondrocytes, osteoblasts, and myoblasts in vitro and undergo differentiation in vivo. However, the clinical use of BMSCs has presented problems, including pain, morbidity, and low cell number upon harvest. Recent studies have identified a putative stem cell population within the adipose tissue. Human adipose tissue contains pluripotent stem cells simillar to bone marrow-derived stem cells that can differentiate toward the osteogenic, adipogenic, myogenic, and chondrogenic lineages. Human adipose tissue-derived stem cells (ATSCs) could be proposed as an alternative source of adult bone marrow stem cells, and could be obtained in large quantities, under local anesthesia, with minimal discomfort. Human adipose tissue obtained by liposuction was processed to obtain ATSCs. In this study, we compared the osteogenic differentiation of ATSCs in a specific osteogenic induction medium with that in a non-osteogenic medium. ATSCs were incubated in an osteogenic medium for 28 days to induce osteogenesis respectively. Osteogenic differentiation was assessed by von Kossa and alkaline phosphatase staining. Expression of osteocyte specific bone sialoprotein, osteocalcin, collagen type I and alkaline phosphatase, bone morphogenic protein 2, bone morphogenic protein 6 was confirmed by RT-PCR. ATSCs incubated in the osteogenic medium were stained positively for von Kossa and alkaline phosphatase staining. Expression of osteocyte specific genes was also detected. Since this cell population can be easily identified through fluorescence microscopy, it may be an ideal source of ATSCs for further experiments on stem cell biology and tissue engineering. The present results show that ADSCs have an ability to differentiate into osteoblasts. In the present study, we extend this approach to characterize adipose tissue-derived stem cells.
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문제 정의
본 연구에서는 지방조직에서 줄기세포를 추출하여 조골세포로의 분화를 확인하여 골조직 재생을 위한 조골세포 줄기세포의 대체채취원으로 지방세포를 이용하는 것이 가능한지 알아보고자 하였다. 골수조직 간엽 줄기세포에 대한다양한 연구가 이루어지고 있으며, 골수 간 엽 줄기세포는실험실 내에서 조골세포로 분화하여 골형성 과정을 거치는것으로 알려져 있다.
Reaction, RT-PCR)을 통하여 비교. 분석하여 , 지방세포의 조골세포로의 분화 유도가 가능함을 확인하고자 하였다.
제안 방법
지방조직에서 Hal.,orsen 등의 방법에 의하여 지방 줄기세포를 분리하고, 10% FBS* 포함한 DMEM-F12 배지에 10nM dexamethasone, ascorbate 2-phosphate(50 ug/mL) 와 100 mM /^-glycerol phosphate# 투여하여 28일간 배양하여 염색, ALP staining과 von Kossa staining을 시행하고 BMP-2, BMP-6, osteocalcin, osteopontin, bone sialoprotein, collagen I 등의 골형성 단백 유전자의 발현을 역전사-중합 효소 연쇄 반응을 통하여 비교. 분석한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
)와 oligo(dT) 16 primer를 이용하여 first strand cDNA를 합성하였다. 100 ul 용액을 제조하고 합성된 cDNA의 1/10을 사용하여 PCR을 시행하였다. BMP-2와 BMP-6는 30 cycle(95℃ 에서 1분간 denaturation-^ 시행하고 cycle을 증가시키면서 95℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃에서 2분간)을 시행하고, actin과 collagen Ie 40 cycle(94℃에서 3분간 초기 denaturation, cycle을 증가시키면서 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 7才。에서 1분)을, bone sialoproteine 40 cycleSIP에서 3분간 초기 denaturation, cycle을 증가시키면서 94℃에서 1분, 56.
24개의 배양용기에 줄기세포를 3주 동안 배양하고, 제 1, 3, 5, 7, 14, 21일째에 cold PBS(Sigma)로 세포층을 2 회 세척한 후 배양세포층을 AGP mix (acetone:citrate solution:37% paraformaldehyde=65:25:8)를 이용하여 고정하고 Sigma Diagnostics 회사의 ALP staining kit를 이용하여 alkaline phosphatase activity를 측정하였다. von Kossa staininge 역시 제1, 3, 5, 7, 14, 21일째에 배양 세포증을 실온에서 60분간 4% paraformaldehydee.
BMP-2, BMP-6, osteopontin, osteocalcin, bone sialoprotein과 collagen I등의 골 형성 관련 단백의 유전자발현을 역전사-중합 효소 연쇄반응으로 분석하였다. 모든 결과는 #-actin과 상 대 비교를 시행하였으며 이때 사용한 primer는 table 1에 나타나 있다.
100 ul 용액을 제조하고 합성된 cDNA의 1/10을 사용하여 PCR을 시행하였다. BMP-2와 BMP-6는 30 cycle(95℃ 에서 1분간 denaturation-^ 시행하고 cycle을 증가시키면서 95℃에서 45초, 60℃에서 45초, 72℃에서 2분간)을 시행하고, actin과 collagen Ie 40 cycle(94℃에서 3분간 초기 denaturation, cycle을 증가시키면서 94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 7才。에서 1분)을, bone sialoproteine 40 cycleSIP에서 3분간 초기 denaturation, cycle을 증가시키면서 94℃에서 1분, 56.5℃에서 1분, 72℃에서 1분), osteocalcine 40 cycle (94 ℃ 에서 3분간 초기 denaturation, cycle을 증가시키면서 94℃에서 1분, 6CVC에서 1분, 72℃에서 1 분)의 조건으로 PCR을 시행하였다. 이 중 10 ul 를 이용하여 ethidium bromide로 염색된 1, 5% agarose gel을 UV transillumination으로 관찰하고 digital camera로 촬영하고 Scion image analysis software* 이용하여 분석을 시행하였다.
모든 결과는 #-actin과 상 대 비교를 시행하였으며 이때 사용한 primer는 table 1에 나타나 있다. Tri-reagent(Sigma) 를이용하여 Chomczynski와 Sacchi의 single-step method 에 따라 total RNA를 주줄하고 UV spectrophotometry (Phamacia, Gene Quant, LKB Biochrom, England)로 농도를 즉정하고 이 중 3.5ug으로 Superscriptreverse transcriptase (Life Technologies Inc.)와 oligo(dT) 16 primer를 이용하여 first strand cDNA를 합성하였다. 100 ul 용액을 제조하고 합성된 cDNA의 1/10을 사용하여 PCR을 시행하였다.
이 중 10 ul 를 이용하여 ethidium bromide로 염색된 1, 5% agarose gel을 UV transillumination으로 관찰하고 digital camera로 촬영하고 Scion image analysis software* 이용하여 분석을 시행하였다. μ-actin에 대한 상대적인 intensity 를 구하여 RT-PCR 결과를 분석하였다.
von Kossa staininge 역시 제1, 3, 5, 7, 14, 21일째에 배양 세포증을 실온에서 60분간 4% paraformaldehydee. 고정하고, 증류수로 세척한 후, 빛을 차단한 상태로 1% (wt/vol) silver nitrite solution에 30분간 고정하고 다시 몇 차례 증류수로 세척한 후 60분간 UV light를 조사하였다. 위와 같은 alkaline phosphatase staining과 von Kossa staining을 시행한 24개의 배양용기를 digital camera로 촬영하고 염색도를 Scionic PC image analysis software를 이용하여 분석하였다.
본 연구에서는 골수줄기세포에 비하여 쉽게 채취할 수 있는 성인의 피하지방조직에서 줄기세포를 추출하여 세포배양을 통하여 골형성 유도 배양액(osteogenic induction medium)을 투여한 실험군과 투여하지 않은 대조군간에 alkaline phosphatase (ALP) staining과 von Kossa staining을 시행 하고 BMP-2 (bone morphogenic protein-2) , BMP-6(bone morphogenic protein-6), Osteocalcin, Osteopontin, Bone sialoprotein(Bsp), Collagen I 등의 골 형성 단백 유전자의 발현을 역전사-중합 효소 연쇄 반응 (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)을 통하여 비교. 분석하여 , 지방세포의 조골세포로의 분화 유도가 가능함을 확인하고자 하였다.
지방조직 과 혈관조직 을 원심분리 하고 plastic adherence를 이용하여 단핵 구 성분을 분리하였다. 분리한 세포를 10%(v/v) fetal bovine serum(FBS, Gibco) 를 포함하는 Dulbecco's modified Eaole's medi-um-Ham's nutrient broth F12 (DMEM-F12, 1:1, v/v, Gibco)을 maintenance medium으로 하여, R&D systems (Minneapolis, MN) 으로부터 구입한 transforming growth factor B(TGF-g, 0.25 ug/mL), human epidermal growth factor(EGF, 5ug/mL)와 human basic fibroblastic growth factor (bFGF, lug/mL) 를 이용하여 culture expansion을 시행하였다. 실험군에서는 지방 줄기세포의 조골세포로의 분화를 유도하기 위하여 10% FBS를포함한 DMEM-F12 배지에 10 μM dexamethasone (Sigma), ascorbate 2-phosphate(50 ug/mL, Sigma) 와 100 mM ^-glycerol phosphate (Sigma) 를 투여하여 배양을 시행하였으며, 대조군에서는 골 형성 유도배양액을 투여하지 않고 10% FBS를 포함한 DMEM-F12 배지에 배양을 시행하였다.
25 ug/mL), human epidermal growth factor(EGF, 5ug/mL)와 human basic fibroblastic growth factor (bFGF, lug/mL) 를 이용하여 culture expansion을 시행하였다. 실험군에서는 지방 줄기세포의 조골세포로의 분화를 유도하기 위하여 10% FBS를포함한 DMEM-F12 배지에 10 μM dexamethasone (Sigma), ascorbate 2-phosphate(50 ug/mL, Sigma) 와 100 mM ^-glycerol phosphate (Sigma) 를 투여하여 배양을 시행하였으며, 대조군에서는 골 형성 유도배양액을 투여하지 않고 10% FBS를 포함한 DMEM-F12 배지에 배양을 시행하였다.
고정하고, 증류수로 세척한 후, 빛을 차단한 상태로 1% (wt/vol) silver nitrite solution에 30분간 고정하고 다시 몇 차례 증류수로 세척한 후 60분간 UV light를 조사하였다. 위와 같은 alkaline phosphatase staining과 von Kossa staining을 시행한 24개의 배양용기를 digital camera로 촬영하고 염색도를 Scionic PC image analysis software를 이용하여 분석하였다.
5℃에서 1분, 72℃에서 1분), osteocalcine 40 cycle (94 ℃ 에서 3분간 초기 denaturation, cycle을 증가시키면서 94℃에서 1분, 6CVC에서 1분, 72℃에서 1 분)의 조건으로 PCR을 시행하였다. 이 중 10 ul 를 이용하여 ethidium bromide로 염색된 1, 5% agarose gel을 UV transillumination으로 관찰하고 digital camera로 촬영하고 Scion image analysis software* 이용하여 분석을 시행하였다. μ-actin에 대한 상대적인 intensity 를 구하여 RT-PCR 결과를 분석하였다.
,orsen 등의 방법에 의하여 줄기세 포를 분리하였다. 지방조직 과 혈관조직 을 원심분리 하고 plastic adherence를 이용하여 단핵 구 성분을 분리하였다. 분리한 세포를 10%(v/v) fetal bovine serum(FBS, Gibco) 를 포함하는 Dulbecco's modified Eaole's medi-um-Ham's nutrient broth F12 (DMEM-F12, 1:1, v/v, Gibco)을 maintenance medium으로 하여, R&D systems (Minneapolis, MN) 으로부터 구입한 transforming growth factor B(TGF-g, 0.
성능/효과
확인하여 피하지 방조직에서 Hal.,orsen 등의 방법에의하여 추출한 세포가 간엽줄기세포임을 확인하였다(Fig. 1-2).
1.지 방조직으로부터 추출한 성인 중간엽줄기세포는 조골세포로 분화가 가능하였다.
2.지방조직 유래 줄기세포는 골 형성 유도배양액을 투여하면 조골세포로 분화되고 시간 경과에 따라 mineralization을 보인다.
3.골 기질 단백 관련 유전자 발현에서 BMP-2와 BMP-6 는 1주 경과 후, BSP는 2주 경과 후, Osteocalcine 3 주 경과후에 그 발현이 증가되어 있고 Collagen Ie 전 기간에서 그 발현이 증가되어 있었다.
vd의 골 형성 유도 효과에 따른 골형성 정도를 평가하기 위하여 지방줄기 세포의 분화 과정에서AP 효소 활성도와 matrix mineralization정도를 측정한 결과, VD의 골형성 유도배양액을 사용한 경우 AP활성도가 2-3 주사이에 현저하게 높게 나타났다고 하였다. ALP활성도는 골수줄기 세포의 경우에서 1주 먼저 나타나기 시작하였으나 6주 동안 최대한의 발현 없이 변화가 없었으며, dexamethasone을 사용한 경우에서는 VD를 사용한 경우보다 ALP 활성도가 현저하게 저하되어 나타났다고 하였다. 흥미로운 것은 골수줄기 세포의 경우에는 dexamethasone 을 사용한 경우에서 VD를 사용한 경우보다 ALP 활성도가증가되었으며 , 이는 골수줄기세포와 지방 줄기세포의 배양유도 상황에 따른 서로 다른 반응으로 인한 것으로 보인다고 하였다 % 또한 줄기세포의 분화연구에서 transforming growth factor(TGF)-/5, tumor necrosis factor-a, inter-leukin(IL)-l, retinoic acid등의 물질들은 조골세포 분화를 촉진시키고 지방세포 분화를 억제하며, indomethacin, isobutyl-methylxanthin (IBMX), insulin, glucocorticoids, thiazolidinediones (TZD) 등은 지방세포 분화를 촉진시키고 조골세포 분화를 억제한다고 하였다.
보였다. 골형성 유도배양액을 넣지 않고 28일간 배양한 대조군의 경우, BMP-2의 발현이 실험군과 유사하게 7일부터 21일 사이에 가장 높게 나타났으나 실험군과 비교하여 상대적으로 발현의 정도가 미약함을 알 수 있었다 (Fig. 7).
발현을 나타내었다. 대조군에서는 실험군과 비교하여발현의 정도가 상당히 미약하였으며 점차로 증가하여 28일에서 가장 높은 발현을 나타내었다 (Fig. 11).
상기연구 결과와 본 연구 결과를 토대로 하여 지방조직으로부터 유래된 줄기세포는 다양한 세포로 분화가 가능함을 할 수 있고, 조골세포로 분화됨을 확인하였다. 또한 골수줄기세포에 대한 실험과 비교하여보았을 때, 골기질 단백 유전자의 발현이 골수 줄기세포와유사한 양상이나 미세하게 지연되어 있었음을 알 수 있었다.
5에 나타나 있다. 모든 결과는 8-actin에 대한 상대적인 intensity를 구하여 분석하였으며, B-actin유전자 발현 양상은 실험군 과대조군 모두 전 과정에 걸쳐 고루 나타났다(Fig. 6). 실험군에서는 조골세포 분화 배양액을 적용하지 않은 대조군에 비하여 현저한 골기질 단백 유전자의 발현을 보였다.
본 연구에서 지방조직 유래 줄기세포의 조골세포로의 분화를 확인하기 위하여 지방조직 유래 줄기세포를 배양하여 골 기질 단백 유전자 발현 양상을 살펴본 결과, #-actin 유전자 발현은 골 형성 유도배양액을 사용한 실험군과 골 형성유도 배양액을 적용하지 않은 대조군 모두 전 과정에 걸쳐 고루 나타났으며, 실험군에서는 대조군에 비하여 BMP-2, BMP-6, osteopontin, osteocalcin, bone sialoprotein 등의 골기질 단백 유전자의 발현이 현저하게 높게 나타났다. Collagen I의 발현은 배양 전 기간에 걸쳐 일정하였으며, 실험군과 대조군의 차이가 없이 같은 정도의 발현을 보였다.
흥미로운 것은 골수줄기 세포의 경우에는 dexamethasone 을 사용한 경우에서 VD를 사용한 경우보다 ALP 활성도가증가되었으며 , 이는 골수줄기세포와 지방 줄기세포의 배양유도 상황에 따른 서로 다른 반응으로 인한 것으로 보인다고 하였다 % 또한 줄기세포의 분화연구에서 transforming growth factor(TGF)-/5, tumor necrosis factor-a, inter-leukin(IL)-l, retinoic acid등의 물질들은 조골세포 분화를 촉진시키고 지방세포 분화를 억제하며, indomethacin, isobutyl-methylxanthin (IBMX), insulin, glucocorticoids, thiazolidinediones (TZD) 등은 지방세포 분화를 촉진시키고 조골세포 분화를 억제한다고 하였다. 본 연구에서는 골 형성 유도배양액으로 10% FBS를 포함한 DMEM-F12 배지에 10 p-M dexamethasone, ascorbate 2-phosphate(50 ug/mL) 와 100 mM /5-glycerol phosphate를 투여하여 배양을 시행하여 , 지방조직 유래 줄기세포의 골 세포의 분화능을 확인할 수 있는 ALP 염색, von Kossa 염색결과를 보면, 골 형성 유도배양액을 넣고 28일간 배양한 결과, 시간이 지남에 따라 염색도가 현저히증가됨을 확인하였다. 따라서 골수줄기세포와 지방 줄기세포에 있어서 dexamethasone과 VD의 세포 분화 유도 능력에 대한연구가 필요하다고 할 수 있다.
본 연구의 결과, 지방조직 유래 줄기세포는 조골세포로 분화 되었고, 골 형성 유도배양액을 첨가한 경우 조골세포로의 분화능력이 높게 나타났으며 , 골형성 유도배양액을 첨가하지 않은 경우보다 골기질 단백 유전자의 발현이 높게나타났다. 이는 Hal.
지방조직은 골수에 비하여양이 풍부하며 쉽게 채취할 수 있는 장점이 있으므로, 골수줄기세포의 대체 채취원으로 이용할수 있다는 것을 알 수 있다. 상기연구 결과와 본 연구 결과를 토대로 하여 지방조직으로부터 유래된 줄기세포는 다양한 세포로 분화가 가능함을 할 수 있고, 조골세포로 분화됨을 확인하였다. 또한 골수줄기세포에 대한 실험과 비교하여보았을 때, 골기질 단백 유전자의 발현이 골수 줄기세포와유사한 양상이나 미세하게 지연되어 있었음을 알 수 있었다.
실험군에서 Osteocalcin의 발현은 14일에서부터 시작하여 28일까지 현저히 증가되는 양상이었고 28일에서 가장높은 발현을 나타내었다. 대조군에서는 실험군과 비교하여발현의 정도가 상당히 미약하였으며 점차로 증가하여 28일에서 가장 높은 발현을 나타내었다 (Fig.
6). 실험군에서는 조골세포 분화 배양액을 적용하지 않은 대조군에 비하여 현저한 골기질 단백 유전자의 발현을 보였다.
실험군의 경우 BMP-6는 7일부터 증가하기 시작하여 14 일에 가장 현저히 높게 발현되었으며 이후 점차 로 감소하는양상을 보이고 있으며, 대조군의 경우 21일에 가장 높은 발현을 보이고 있으며 28일까지 발현이 관찰되었다 (Fig. 8).
지방조직 유래 줄기세포를 배양하였을 때, BMP-2의 발현이 7일부터 현저히 높게 관찰되었으며 14일에 가장 높게 발현되었다가 21일 이후로 점차 감소하는 양상을 보였다. 골형성 유도배양액을 넣지 않고 28일간 배양한 대조군의 경우, BMP-2의 발현이 실험군과 유사하게 7일부터 21일 사이에 가장 높게 나타났으나 실험군과 비교하여 상대적으로 발현의 정도가 미약함을 알 수 있었다 (Fig.
지방조직 유래 줄기세포의 골세포의 분화능을 확인할 수 있는 ALP 염색, von Kossa 염색결과를 보면, 골 형성 유도 배양액을 넣고 28일간 배양한 결과, 시간이 지남에 따라 염색 도가 현저히 증가됨을 확인하였다. 지방조직 유래 간엽 줄기세포에 골형성 유도배양액을 넣지 않고 28일간 배양한 결과, 시간이 지남에 따라 각각의 염색도가 증가되지 않음을 알 수 있다 (Fig.
,orsen 등, Zuk 등, Huang 등 의연구 결과와 유사한 것으로, 지방조직에서 유래한 줄기세포를 이용하여 조골세포로 분화가 가능함을 나타낸다. 지방조직은 골수에 비하여양이 풍부하며 쉽게 채취할 수 있는 장점이 있으므로, 골수줄기세포의 대체 채취원으로 이용할수 있다는 것을 알 수 있다. 상기연구 결과와 본 연구 결과를 토대로 하여 지방조직으로부터 유래된 줄기세포는 다양한 세포로 분화가 가능함을 할 수 있고, 조골세포로 분화됨을 확인하였다.
후속연구
본 연구를 통하여 지방조직 유래 줄기세포를 이용한 골 결손부의 치유 및 다양한 조직 재생을 위한 조직공학의 기법을 적용하여 골결손 부위의 재건을 도모한다면 훌륭한 골재생 결과를 얻을 수 있는 골이식재료 및 방법의 개발에 도움이 될 것이라 생각한다. 향후 지방 유래 줄기세포와 다양한 scaffold와의 적용을 통하여 골결손 부위의 치료에 적용하는 연구가 필요하며, 일반적인 골조직이식 방법과 상호비교, 분석함이 필요하다고 생각한다.
위의 연구결과를 통하여, 지방조직에서 유래한 줄기세포는 배양조건의 조절을 통해 조골세포로의 분화가 가능함을확인할 수 있었으며, 지방조직 유래 줄기세포를 이용한 조직 공학적 기법에 의 응용이 가능하리라 사료된다.
될 것이라 생각한다. 향후 지방 유래 줄기세포와 다양한 scaffold와의 적용을 통하여 골결손 부위의 치료에 적용하는 연구가 필요하며, 일반적인 골조직이식 방법과 상호비교, 분석함이 필요하다고 생각한다.
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