문제 정의

• 이를 통해 1:5 비율의 가장 효율적으로 DNA를 전달하는 것으로 확인되었다. DNA 대 DOTAP 비율선정 후, 다음으로는 1:5 비율을 고정하고 DNA 농도와 transfection 횟수에 따른 효율이 어떻게 달라지는지를 평가해 보았다. Figure 2C에서 보듯이, DNA 농도와 transfection 횟수에 따라 GFP의 발현이 증가함을 형광단백질의 발현으로 확인할 수 있었고, 이를 정량화한 FACS결과에서 보듯이(Figure 2D) 형광이미지 사진의 결과 경향과 유사하게 GFP의 수치가 DNA 농도 및 회수에 따라 증가하는 것을 정량적으로 확인할 수 있었다.
• 따라서, 본 연구는 효율적인 유전자 전달체를 이용하여 줄기세포 내로 도입된 CEACAM 6가 oxidative stress 조건 하에서 줄기세포의 생존능에 어떠한 영향을 미치는지를 평가하여 CEACAM 6가 줄기세포의 단점을 극복할 수 있는지를 평가하고자 하였다.
• ">있다[7]. 따라서, 우리는 이 유전자를 이용하여 줄기세포의 단점을 극복할 수 있는지를 평가해보고자 하였다.
• 후)있다 [17,">있다[17, 21]. 따라서, 우리는 이러한 기능이 있는 이 단백질 유전자를 역이용하여 줄기세포에서의 단점을 극복하기 위한 단백질로서의 기능을 CEACAM 6가 할 수 있는지를 검증해 보고자 하였다.
• 본 연구는 이러한 관점에서 줄기세포의 단점을 극복할 수 있는 단백질의 발현을 유도하고자 하였다. 이전 우리 연구를 통해 우리의 연구는 줄기세포에서의 CEACAM 6 유전자의 생물학적 기능을 평가한 첫 보고이다. 아무리 우수한 이를 토대로 우리는 ADSC에 CEACAM 6가 암세포에서의 기능 중 anti-apoptosis 및 세포증식 촉진을 유도한다는 사실을 역설적으로 ADSC에 이용하여 ADSC의 단점을 극복할 수 있는지를 평가해 보기로 하였다. 앞선 연구자들은 단백질 발현을 통한 효과를 후)줄기세포치료법에">줄기세포 치료법에 있어 혈액공급이 원활하지 않은 허혈 환경에 노출된 줄기세포는 산화적 스트레스로 인해 세포대사와 생리기능을 감소시켜 세포사멸을 초래하게 되는데 anti-oxidative stress와 anti-apoptosis기능을 갖는 CEACAM 6가 발현될 때, 산화적 조건에서 세포사멸을 극복할 수 있는지를 평가해 보았다. 먼저, H₂O₂에 대한 ADSC의 민감도 및 IC₅₀을 선정하고자 다양한 농도의 H₂O₂를 처리하였다(Figure 3A,

  제안 방법

  • 1차 항체 (CEACAM 6, 1:1,250, Thermo Scientific; β-actin, 1:5,000, Santa Cruz, CA)로 4°C에서 16∼18시간 반응시킨 후 TBST로 3번 세척 하였고 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG, 1:5,000, Invitrogen)로 실온에서 1시간 반응시킨 후 세척 하였다.
  • ADSC에 CEACAM 6 발현 벡터를 전달하기 위해 먼저, transfection 조건을 선정하고자 liposome인 DOTAP을 이용한 transfection조건을 평가해 보았다. 유전자의 전달 확인을 위해서는 GFP 우리의 이전 연구를 통해 유방암 암줄기세포인 BCSC에서 이 단백질이 발현된다는 사실을 바탕으로 본 연구의 positive control세포로 사용하였다. BCSC와 폐암 세포인A549, 줄기세포인ADSC에서의 CEACAM 6의 발현을 확인해 보고자 western blot과 FACS를 사용하여 단백질의 발현을 비교하였다. 그 결과 Figure 1A에서 볼 수 있듯이, western blot실험을 통해서는 Transfection에 사용하기 위한 양이온 liposome은 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane (DOTAP) (Avanti, USA)와 cholesterol (Avanti)를 사용하며, DOTAP: cholesterol을 1:1 (50:50, % M)의 M비율로 제조하였으며, liposome의 최종 지질 농도는 1 mg/mL가 되도록 하였다. Liposome은 각각의 지질을 가장 먼저, 사용한 줄기세포에서 실질적으로 단백체 단계에서 CEACAM 6가 발현되고 있는지를 확인하였다. Figure 1A에서 보듯이 단백질 각 세포들을 수거하여 RIPA buffer (ATTO, Japan)로 용해하였고, 용해된 세포액을 원심 분리시켜 상층액을 Pierce BCA protein assay kit (Thermo Scientific, USA)로 측정하였다. 따라서, CEACAM 6 발현 벡터를 줄기세포에 전달하여 단백질의 발현을 유도한 뒤 기능평가를 위해 transfection을 수행하기로 하였다. 하지만, 다른 연구들에서 보고된 바에 따르면 줄기세포는 낮은 transfection 효율을 갖는 것으로 알려져 있다 ">확인 하였다. 또한, transfection 1회를 한 뒤, 24시간 째에 한번 더 진행한 것을 transfection 2회로 진행하였고 이후 1일과 2일째 결과를 관찰하여 transfection 효율 및 GFP의 발현을 비교하였다. 이후 CEACAM 6 expression vector (Origene, USA)을 통하여 ADSC에 transfection하였다.
  • 후)발현벡터인">발현 벡터인 gWiz-GFP를 사용하였다. 먼저 pDNA:DOTAP 비율에 따른 GFP DNA 전달 효율을 확인해 보고자 1:5에서 1:15까지의 비율로 ADSC에 처리해 보았다. 그 결과, Figure 2A에서 보듯이 1:5에서 가장 높은 GFP DNA 후)세포 사멸을">세포사멸을 극복할 수 있는지를 평가해 보았다. 먼저, H₂O₂에 대한 ADSC의 민감도 및 IC₅₀을 선정하고자 다양한 농도의 H₂O₂를 처리하였다(Figure 3A, 3B). 선정된 농도에서의 실질적인 CEACAM 6의 후)유방암 유래">유방암유래 암줄기세포인 BCSC에서만 발현이 됨을 확인할 수 있었고 다른 암세포나 줄기세포에서는 발현이 되지 않음을 확인할 수 있었다. 발현을 좀더 정량적으로 확인해 보고자 세포표면에 발현되는 CEACAM 6의 특징을 이용하여 세포별 세포표면에 발현된 CEACAM 6를 확인하고자 FACS를 수행하였다. 그 결과, Figure 1B에서의 FACS histogram 결과에서 볼 수 있듯, 대조군 세포인 BCSC에서의 control peak과 CEACAM 6의 peak이 오른쪽으로 이동한 것을 cells 으로 분주 후 하루 배양하였다. 본 실험에 transfection 조건을 찾기 위해 gWiz-GFP plasmid DNA을 800 ng, 1000 ng으로 고정하여 1:5, 1:10, 1:15 (pDNA:DOTAP) 비율로 실험을 진행하였다. 모든 transfection은 free DMEM에서 4시간 반응 후 혈청이 함유된 본 실험은 [5]의 방법을 기준으로 진행하였으며 H₂O₂의 농도는 0, 20, 40, 60, 80, 100 mM로, 노출 시간은 3시간 시행하였다.
  • ">세척 하였다. 세척 후 Pierce enhanced chemiluminescence detection substrate (Thermo Scientific)을 처리한 후, Fusion SL (Vilber Lourmat, France)을 이용하여 단백질 밴드를 확인하였다.
  • 후)세포 형태">세포형태 및 형광발현 관찰은 ZOE fluorescent microscope (Bio-Rad, USA)로 관찰하였다.
  • )를 사용하였다. 실험 전 세포살상을 유도하는 적정 H₂O₂의 농도를 선정하기 위하여 다양한 농도로 ADSC에 처리하여 보았다. 그 결과, Figure 3A에서 보듯이 줄기세포에 CEACAM 6의 도입을 유도하여 생물학적 기능을 평가하기 전에 세포별 CEACAM 6의 발현을 실질적인 단백체 단계에서 확인하였다. 우리의 이전 연구를 통해 유방암 암줄기세포인 BCSC에서 이 단백질이 발현된다는 사실을 바탕으로 본 연구의 positive control세포로 사용하였다. BCSC와 폐암 유방암유래 암줄기세포인 BCSC는 10% (v/v) FBS (Hyclone, USA)와, 1% (v/v) penicillin G-streptomycin solution (Gibco, USA), 5 μg/mL insulin (Invitrogen, USA), 20 ng/mL EGF (Gibco), 20 ng/mL b-FGF (Gibco), and 2% B27 (Invitrogen)이 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s Medium/F12 medium(DMEM/F12) (Gibco)배지에, A549는 10% (v/v) FBS와 1% (v/v) penicillin/streptomycin (Hyclone)가 함유된 Dulbecco’s modified Eagles Medium (DMEM) (Hyclone) 배지에, ADSC는 20% (v/v) FBS와 1% (v/v) penicillin/streptomycin (Hyclone)가 함유된 DMEM 배지에 37°C, 5% CO2의 배양기에서 배양하였다.
  • 후)6발현">6 발현 벡터를 전달하기 위해 먼저, transfection 조건을 선정하고자 liposome인 DOTAP을 이용한 transfection조건을 평가해 보았다. 유전자의 전달 확인을 위해서는 GFP 발현 벡터인 gWiz-GFP를 사용하였다. 먼저 pDNA:DOTAP 비율에 따른 GFP DNA 전달 효율을 이">17]. 이 단백질이 발현되는 위치를 통해 세포표면에 발현되는지를 FACS를 통해 세포주 별로 CEACAM 6의 발현을 확인해 보았다. 실질적인 이러한">33]. 이러한 문제를 해결하기 위해 줄기세포에 직접 transfection을 하기 전, 우리는 GFP 단백질을 발현하는 gWiz-GFP DNA를 이용하여 적정 pDNA:DOTAP의 비율을 선정하였다. 다양한 비율로 Transfection의 다양한 비율 선정 후 진행한 결과, 1:5 비율이 가장 높은 세포 생존율(89.
  • 이러한">28-30]. 이러한 문제점을 해결하기 위해 지질 성분으로 이루어진 liposome을 사용하였다. DOTAP은 cationic lipid의 일종으로 ammonium salt를 포함하고 있으며 transfection 본 연구는 이러한 관점에서 줄기세포의 단점을 극복할 수 있는 단백질의 발현을 유도하고자 하였다. 이전 우리 연구를 통해 유방암유래 암줄기세포에서 검증된 CEACAM 6의 유전자를 줄기세포에 적용하여 그 효과를 평가해 보았다. CEACAM 6는 CEA family 중의 한 후)한 번">한번 더 진행한 것을 transfection 2회로 진행하였고 이후 1일과 2일째 결과를 관찰하여 transfection 효율 및 GFP의 발현을 비교하였다. 이후 CEACAM 6 expression vector (Origene, USA)을 통하여 ADSC에 transfection하였다. ">용해 하였다. 제조된 liposome용액은 입자의 크기를 조절하기 위해 가압압출기로 800, 400, 200 nm의 공극을 갖는 폴리카보네이트 분리막(Whatman, USA)을 이용하여 각각 10 회 이상 가압 압출하여 200 nm까지 크기조절을 하였다.
  • 줄기세포에 CEACAM 6의 도입을 유도하여 생물학적 기능을 평가하기 전에 세포별 CEACAM 6의 발현을 실질적인 단백체 단계에서 확인하였다. 우리의 이전 연구를 통해 유방암 암줄기세포인 BCSC에서 이 단백질이 발현된다는 사실을 바탕으로 본 연구의 positive control세포로 사용하였다.
  • 총 단백질 20 μg을 10% SDS-PAGE에 전기영동 하였고 그 후 nitrocellulose 막으로 이전하였다.
  • 5 μg/mL final concentration)로 4°C에서 90 min 반응시킨 후 DPBS로 세척하였고 2차 항체 (goat anti-mouse IgG (H+L) Alexa fluor Plus 488, 4 μg/mL final concentration, Thermo Scientific)로 4°C에서 30분 반응시킨 후 DPBS로 세척하였다. 최종적으로 항체를 반응 시킨 세포들과 gWiz-GFP가 발현된 ADSC는 FITC 필터를 사용하여 flow cytometer (FACS) (Novocyte 2000, ACEA Biosciences, USA)로 측정하였다. 분석은 FACS 프로그램(Novo Express 1.

  대상 데이터

  • BCSC, A549, ADSC를 각각 2×105 cells 씩 single cell로각 tube에 준비하였다.
  • 본 실험에 사용된 지방유래 줄기세포인 ADSC는 서울대학교 수의과대학에서 분양 받아 사용하였다[5]. 생체 내 투여된 줄기세포의 환경을 모방하기 위해 과산화수소(H₂O₂)를 사용하였다. 실험 유전자">필요하다[8]. 유전자 전달을 위한 전달체로는 바이러스성과 비바이러스성 전달체로 크게 구분할 수 있는데 바이러스 사용에 대한 안전성의 문제와 면역원성의 유발 등의 단점으로 비바이러스성 전달체 중 liposome을 사용하였다. Liposome 은 세포막 성분과 유사하여 세포독성을

    데이터처리

    • 각 실험의 유의성 검정은 대조군과 비교하여 one-way ANOVA를 이용하여 **P<0.02, ***P<0.01값을 통계적으로 유의성 있는 결과로 판독하였다.
    • 후)반응시킨">반응 시킨 세포들과 gWiz-GFP가 발현된 ADSC는 FITC 필터를 사용하여 flow cytometer (FACS) (Novocyte 2000, ACEA Biosciences, USA)로 측정하였다. 분석은 FACS 프로그램(Novo Express 1.2.5 Software, ACEA Biosciences)으로 수행하였다.
    • 통계처리를 위하여 모든 실험은 3회 이상의 독립적 반복 실험을 수행하였으며, 측정한 모든 데이터는 평균과 표준오차를 계산하여 그래프로 나타내었다. 각 실험의

      성능/효과

      • 후)세포 사멸">세포사멸 능이 현저히 줄어들어 있음을 확인할 수 있었다. H₂O₂처리 하에서의 CEACAM 6가 발현되지 않는 ADSC의 생존능은 40.61%, CEACAM 6를 발현하는 세포에서는 72.54%로 생존능이 향상되는 것을 확인하였다.
      • 후)확인해보고자">확인해 보고자 western blot과 FACS를 사용하여 단백질의 발현을 비교하였다. 그 결과 Figure 1A에서 볼 수 있듯이, western blot실험을 통해서는 유방암유래 암줄기세포인 BCSC에서만 발현이 됨을 확인할 수 있었고 다른 암세포나 줄기세포에서는 발현이 되지 않음을 확인할 수 있었다. 발현을 후)세포 표면에">세포표면에 발현된 CEACAM 6를 확인하고자 FACS를 수행하였다. 그 결과, Figure 1B에서의 FACS histogram 결과에서 볼 수 있듯, 대조군 세포인 BCSC에서의 control peak과 CEACAM 6의 peak이 오른쪽으로 이동한 것을 확인 할 수 있는데 비해, 다른 두 세포주인 A549 및 ADSC에서는 각 control peak에 비해 CEACAM 6의 peak에 변화가 없는 것을 확인할 수 있었다. 이 단백질의 발현을 정량적으로 분석한 Figure 1C의 그래프에서도 BCSC에서의 37.
      • 후)확인해보고자">확인해 보고자 1:5에서 1:15까지의 비율로 ADSC에 처리해 보았다. 그 결과, Figure 2A에서 보듯이 1:5에서 가장 높은 GFP DNA 전달효율이 나타나는 것을 확인할 수 있었고 유전자의 발현 시간을 2일까지 관찰하였을 때도 1:5 비율이 가장 높은 유전자 전달효율을 보였다. 또한, 유전자 후)전세포살상을">전 세포살상을 유도하는 적정 H₂O₂의 농도를 선정하기 위하여 다양한 농도로 ADSC에 처리하여 보았다. 그 결과, Figure 3A에서 보듯이 농도 의존적으로 농도가 높아짐에 따라 세포사멸 또한 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 이 때 처리된 대표적 H₂O₂의 농도별 세포사멸능은 40 mM에서 18.4%, 60 mM에서 55.8% 였다(Figure 3B). 따라서, H₂O₂ 60 mM을 선정하여 CEACAM 6가 발현되는 ADSC에 처리한 결과, Figure 3C에서 보듯이 CEACAM 6가 발현되지 않고 H₂O₂가 처리된 세포에서는 CEACAM 6를 발현하는 세포에 비해 현저히 세포독성이 유도되었음을 관찰할 수 있었다.
      • 후)적정pDNA:DOTAP의">적정 pDNA:DOTAP의 비율을 선정하였다. 다양한 비율로 Transfection의 다양한 비율 선정 후 진행한 결과, 1:5 비율이 가장 높은 세포 생존율(89.86%)을 보였고, 이 초과비율에서는 세포독성이 현격히 유도됨을 확인하였다, 유전자 전달 후 오히려 GFP의 발현률은 2, 3일차 1:10 비율에서 감소하는 경향이 관찰되었다(Figure 2A, 2B). 이 실험을 바탕으로, DNA 농도와 8% 였다(Figure 3B). 따라서, H₂O₂ 60 mM을 선정하여 CEACAM 6가 발현되는 ADSC에 처리한 결과, Figure 3C에서 보듯이 CEACAM 6가 발현되지 않고 H₂O₂가 처리된 세포에서는 CEACAM 6를 발현하는 세포에 비해 현저히 세포독성이 유도되었음을 관찰할 수 있었다. 이를 정량적으로 분석한 Figure 3D의 결과는 Figure 3C에서 관찰된 경향과 일치되게 CEACAM 6를 발현하고 있을 때 후)전달 효율을">전달효율을 보였다. 또한, 유전자 전달효율에 따른 세포독성이 발생되는지를 평가한 실험 결과에서는 2일째 어느 정도 1:5 비율의 조건에서도 세포가 사멸된 것이 확인되었지만(1일차: 89.85%, 2일차: 68.44%) 1:10부터는(1일차: 63.61%, 2일차 : 56.08%) transfection 1일차부터 급격하게 세포독성이 유발되는 것을 Figure 2B를 통해 확인할 수 있었다. 이를 통해 1:5 비율의 가장 효율적으로 DNA를 전달하는 것으로 확인되었다.
      • Figure 2C에서 보듯이, DNA 농도와 transfection 횟수에 따라 GFP의 발현이 증가함을 형광단백질의 발현으로 확인할 수 있었고, 이를 정량화한 FACS결과에서 보듯이(Figure 2D) 형광이미지 사진의 결과 경향과 유사하게 GFP의 수치가 DNA 농도 및 회수에 따라 증가하는 것을 정량적으로 확인할 수 있었다. 또한, 이 때의 세포독성 정도를 평가한 Figure 2E에서의 결과에서는 DNA농도와 transfection 회수에 따라 GFP의 발현이 증가하지만 세포독성 또한 증가하는 것을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 transfection 조건은 선정된">3B). 선정된 농도에서의 실질적인 CEACAM 6의 세포사멸 예방을 평가한 결과, 산화적 조건 하에서 이 단백질이 발현되고 있을 때는 현저하게 줄기세포의 생존능이 유지되고 있음을 확인할 수 있었다(Figure 3C, 3D). 하지만, 줄기세포에 후)세포주별로">세포주 별로 CEACAM 6의 발현을 확인해 보았다. 실질적인 막 단백질로서의 발현 유무를 분석한 FACS 결과, 세포 표면에서의 발현 또한 BCSC에 비해 ADSC에서 되지 않고 있음을 확인하였고, 결국 단백체 단계에서는 CEACAM 6의 단백질이 ADSC에서 발현되지 않는 것을 확인하여 줄기세포에서 이 CEACAM 6의 기능을 평가할 수 있음을 확인하였다(Figure 1B, 1C). 또 다른 대조군 세포로 사용된 A549 폐암 세포주의 경우에는 다양한 암에서는 CEACAM 후)2E에서 의">2E에서의 결과에서는 DNA농도와 transfection 회수에 따라 GFP의 발현이 증가하지만 세포독성 또한 증가하는 것을 확인하였다. 이 결과를 바탕으로 transfection 조건은 1:5비율로 800 ng의 DNA를 2회 transfection 하는 것으로 결정하였고 이 때, 실질적으로 CEACAM 6 벡터가 사용되었을 때 발현이 유도됨을 Figure 2F를 통해 확인할 수 있었다.
      • 이">2B). 이 실험을 바탕으로, DNA 농도와 외래 유전자의 발현을 높이기 위한 transfection 횟수 실험을 실시하여, 최종적으로 DNA 800 ng사용 시 1:5 비율로 2번 transfection 시켰을 때 CEACAM 6 유전자의 발현이 잘 유도됨을 확인할 수 있었다(Figure 2F).
      • 이러한 관점에서 우리는 이전 연구를 통해 유방암 유래 암줄기세포(breast cancer stem cells, BCSC)에서 carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6(CEACAM 6)의 생물학적 기능을 연구한 적이 있다(under submission). 이 연구에서 이 단백질은 암줄기세포의 증가된 anti-apoptosis 및 oxidative stress에 대한 내성과 세포 부착능을 강화시킨다는 사실을 밝혀냈다. CEACAM 6는 세포 부착(cell adhesion)과 연관된 중요한 단백질로 알려져 있으며, 08%) transfection 1일차부터 급격하게 세포독성이 유발되는 것을 Figure 2B를 통해 확인할 수 있었다. 이를 통해 1:5 비율의 가장 효율적으로 DNA를 전달하는 것으로 확인되었다. DNA 대 DOTAP

        후속연구

        • ">있다[10]. 우리는 이를 극복해보고자 암세포에서 많이 발현된다고 알려진 CEACAM 6를 역설적으로 ADSC에 적용하였고, 산화적 조건하에서 이 유전자는 줄기세포의 생존능을 향상시키는 결과를 유도하여 향후 줄기세포의 치료부위에서의 낮은 생존률을 극복하기 위한 보조 단백질로서 줄기세포 치료제 개발에 이용될 수 있을 것으로 사료된다.