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문제 정의
- 본 연구에서는 NFAT5가 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포 에서 골세포로의 분화에 관여하는 것으로 알려져 있는 전사인 자인 NF-κB의 활성을 조절 한다는 것을 확인 하였다.
- 이에 본 연구에서는 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포의 체외배양에서, 골분화 과정에서 NFAT5 의 역할을 규명하고자 일련의 실험들을 수행 하였으며, TNF-α에 의한 NFAT5의 조절 기작에 대한 연구 결과를 얻었기에 이에 보고하고자 한다.
제안 방법
- PCR 반응은 2 μl의 cDNA와 NFAT5 또는 GAPDH에 특이적인 primer를 이용하여 PCR를 수행하였다.
- PCR 산물은 2 X SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 사용하여 증폭하였다.
- 05 compared with the data of control cells. Prolifeation of siNFAT5 transfected hADSC was determined by direct cell counting at 2, 3, and 4 days after plating. Data represent the mean SEM of three independent experiments (C).
- TNF-α에 의한 NF-κB 활성화 과정 중 NFAT5의 역할을 확인하기 위하여 TNF-α에 의한 IκB 분해에 대한 NFAT5 siRNA의 작용을 확인 하였다.
- TNF-α에 의해 촉진 되는 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포의 골세포 분화에 NFAT5가 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 NFAT5가 억제된 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포의 골세포 분화를 유도하였으며, 이때 TNF-α를 농도별로 처리 하였다.
- Transfection 1-2일 후에 세포를 reporter lysis buffer (Promega, WI, USA)를 사용하여 lysate를 만든 후, lysate를 원심분리하여 상등액을 취하고 luciferin 기질(Luciferase Assay System, Promega corporation, Madison, WI, USA)을 이용하여 luciferase activity를 측정하였으며, β-galactosidase 활성은 β-Galactosidase Enzyme Assay System (Promega corporation, Madison, WI, USA)을 이용하여 측정 하였고 이 값을 luciferase 활성 수치를 보정하는데 사용하였다.
- pNF-κB-Luc, pCMV-β-Gal plasmid (Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA, USA)를 중간엽 줄기세포에 Lipofectamine Plus Reagent (Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA)를 이용하여 transfection하였다.
- 5 mM ascorbate-2-phosphate 를 포함 하는 α-MEM에서 2주간 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 고정 및 세척 후 Alizarin Red S (Sigma) 용액으로 세포를 염색하였으며 광학 현미경하에서 석회화 결절 형성을 관찰하였다.
- 5 mM IBMX, 200 μl indomethacin 을 포함 하는 α-MEM에서 7일간 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 고정 및 세척 후 Oil Red O (Sigma) 용액으로 세포를 염색하였으며 광학 현미경하에서 지질적화 형성을 관찰하였다.
- 그리고 96 well plate에 calcium이 추출된 용액 5 μl와 측정시약(BioAssay Systems, Hayward, CA) 200 μl를 상온에서 3분간 반응시킨후, 612 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였다.
- 25% trypsin을 이용하여 배양용기에서 떼어낸 후 여러번 pipetting 하여 단일 세포로 만들었다. 단일 세포와 0.4% trypan blue dye (Sigma)을 섞은 후 배양 2, 3, 4일 째 되는 날에 혈구계산판을 이용하여 세포 수를 측정하였다.
- 따라서 TNF-α에 의해 유도 되는 NF-κB promoter 활성화에 NFAT5가 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포에 NF-κB promoter를 포함한 luciferase벡터를 transfection 한 후 luciferase 활성을 측정하였다.
- 줄기세포는 자가증식과 같은 증식력을 가질 뿐만 아니라 다양한 세포로 분화할 수 있는 분화능 등의 특징을 가지고 있으며 이는 다양한 세포 조절 기전에 의해서 조절 되는 것으로 알려져 있다[6, 16, 24, 25, 28, 29]. 따라서 이러한 줄기세포의 특징 중 하나인 증식에 NFAT5가 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 NFAT5가 억제 된 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포를 1x104 개로 seeding한 후 2, 3, 4 일 째 각 day 별로 세포를 회수 하여 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포의 수를 hematocytometer를 이용하여 측정하였다. 그 결과 NFAT5가 억제 된 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포와 siCont이 transfection된 세포의 증식에는 큰 차이가 없는 것을 확인 할 수 있었다(Fig.
- 이를 바탕으로 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 TNF-α에 의한 지방 분화 억제과정에 NFAT5가 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 NFAT5가 억제 된 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포에 TNF-α (10 ng/ml)를 처리하여 지방세포로의 분화를 유도하여 보았다.
- 이를 위하여 TNF-α를 시간 의존적으로 처리한 후, 세포를 회수하여 protein lysis buffer로 용해시킨 후 IκB 발현을 western blot을 통하여 확인하였다.
- 인체 NFAT5 5’-ATGCCCTGATGACTCC ACTC-3’, 5’-CTGCAATAGTGCATCGCTGT-3’, 인체 GAPDH 5’-TCCATGACAACTTTGGTATCG-3’, 5’-TGTAGCCAAAT TCGTTGTCA-3’로써 각각의 PCR 산물을 1.5% agarose gel 상에서 확인하였다.
- 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포의 기능에 NFAT5가 미치는 영향을 확인하기 위해 siRNA를 이용하여 transfection 시킨 뒤, 3일 후 세포를 회수하고 trizol을 이용하여 RNA를 분리한 후 RT-PCR과 real time PCR을 통하여 NFAT5의 mRNA 발현을 확인 하였다. 그 결과 siNFAT5가 transfection 된 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 NFAT5의 mRNA 발현이 siCont이 transfection된 세포와 비교 하였을 때 현저히 감소됨을 확인 하였다(Fig.
- 중간엽 줄기세포 1×104 개를 6 well plate에 분주하고 2 ml 의 배양액(10% FBS, 100 units/ml penicillin과 100 μg/ml streptomycin을 포함 하는 α-MEM으로 2-3일에 한 번씩 배양액을 교체하여 3, 4, 5일 동안 배양하였다.
- 중간엽 줄기세포에서 Trizol (Invitrogen, Gaithersburg, MD, USA)을 이용, total RNA를 분리하여 2 μg의 RNA와 2.5 mM dNTP, oligo dT primer, 5X first strand buffer, RNase inhibitor, M-MLV reverstanscriptase (Promega corporation, Madison, WI, USA)를 사용해서 역전사해서 cDNA를 얻었다.
- 중간엽 줄기세포에서 siRNA transfection은 비특이적 siRNA (On-Target plus non targeting siRNA, Dharmacon, Inc, CO, USA)와 NFAT5에 특이적인 siRNA (NFAT5 onTARGET plus SMART pool, Dharmacon, Inc, CO, USA)를 이용하여 DharmaFECT Transfection Reagent로 시행하였다.
대상 데이터
- Dexamethasone, β-glycerophosphate, ascorbate-2-phosphate, IBMX, indomethacin은 Sigma사에서 구입하였다.
- 세포 배양액인 α-minimal essential medium (α-MEM)은 Sigma사( St Louis, MO, USA)에서 fetal bovine serum (FBS), penicillin-streptomycin 등의 세포배양용 시약들은 GibcoBRL (Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- 실험에 사용 된 사이토카인 Tumor necrosis factor-α (Recombinant Human TNF-α, 10 ng/ml)는 R&D system (Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다.
- 중간엽 줄기세포의 분리를 위해 공여자로부터 지방을 공여 받아 실험에 사용하였다. 지방조직을 잘게 쪼갠 후 0.
데이터처리
- 결과들은 평균 ± 표준오차로 표시하고, 변수의 분석들은 Student’s t-test와 분산분석 후 사후검증으로 Duncan test를 사용하였다. P 값이 0.05 미만인 경우에 통계적으로 유의 하다는 판정을 하였으며, 모든 실험은 독립적으로 3회 이상 실시하여 통계 처리를 하였다.
- 결과들은 평균 ± 표준오차로 표시하고, 변수의 분석들은 Student’s t-test와 분산분석 후 사후검증으로 Duncan test를 사용하였다.
성능/효과
- 따라서 이러한 줄기세포의 특징 중 하나인 증식에 NFAT5가 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 NFAT5가 억제 된 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포를 1x104 개로 seeding한 후 2, 3, 4 일 째 각 day 별로 세포를 회수 하여 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포의 수를 hematocytometer를 이용하여 측정하였다. 그 결과 NFAT5가 억제 된 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포와 siCont이 transfection된 세포의 증식에는 큰 차이가 없는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 1C).
- 그 결과 TNF-α를 처리 하지 않아도 NFAT5가 감소된 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 NF-κB promoter활성이 siCont이 transfection된 세포 보다 감소 되는 것을 확인 하였다.
- 그 결과 TNF-α에 의해서 유도 되는 IκB 분해분해가 siCont이 transfection된 세포와 비교하여 NFAT5의 발현 억제에 의하여 유의하게 방지되지 못하였다(Fig. 5).
- 이를 바탕으로 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 TNF-α에 의한 지방 분화 억제과정에 NFAT5가 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 NFAT5가 억제 된 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포에 TNF-α (10 ng/ml)를 처리하여 지방세포로의 분화를 유도하여 보았다. 그 결과 siCont 세포와 NFAT5를 억제 시킨 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포 에서 지방세포로의 분화에는 큰 차이가 없는 것을 확인 하였다. 뿐만 아니라 siCont이 transfection된 세포와 NFAT5를 억제 시킨 세포에 TNF-α를 처리했을 때에는 TNF-α에 의한 지방 분화 억제효과가 영향을 받지 않았다(Fig.
- 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포의 기능에 NFAT5가 미치는 영향을 확인하기 위해 siRNA를 이용하여 transfection 시킨 뒤, 3일 후 세포를 회수하고 trizol을 이용하여 RNA를 분리한 후 RT-PCR과 real time PCR을 통하여 NFAT5의 mRNA 발현을 확인 하였다. 그 결과 siNFAT5가 transfection 된 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 NFAT5의 mRNA 발현이 siCont이 transfection된 세포와 비교 하였을 때 현저히 감소됨을 확인 하였다(Fig. 1A, B).
- 우선 siCont이 transfection세포에서 TNF-α를 농도별로 처리 하였을 때 골세포로의 분화가 TNF-α의 농도에 비례하여 증가 됨을 확인 하였다. 그러나 NFAT5를 억제 시킨 세포에서 골세포로의 분화가 siCont이 transfection된 세포 보다 현저히 저해 되는 것을 확인하였다. 뿐만 아니라 NFAT5를 억제시킨 세포에 TNF-α를 처리했을 때 TNF-α에 의한 골분화 증가가 억제 됨을 확인하였다(Fig.
- 그리고 TNF-α를 처리 하였을 때 NFAT5가 억제된 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화가 다시 회복 되었으나, TNF-α를 처리한 siCont 세포의 골세포 분화 증가 보다는 억제됨을 확인 하였다.
- 본 연구에서는 NFAT5가 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포 에서 골세포로의 분화에 관여하는 것으로 알려져 있는 전사인 자인 NF-κB의 활성을 조절 한다는 것을 확인 하였다. 또한 NFAT5를 억제 시킨 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화가 siCont 세포의 골세포 분화보다 현저히 감소되는 것을 확인 하였다. 그리고 TNF-α를 처리 하였을 때 NFAT5가 억제된 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포의 골세포로의 분화가 다시 회복 되었으나, TNF-α를 처리한 siCont 세포의 골세포 분화 증가 보다는 억제됨을 확인 하였다.
- 본 실험에서 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포에 NFAT5를 억제시켰을 때 TNF-α에 의한 지방 분화억제효과에는 영향을 미치지 않았다. 이는 TNF-α에 의한 지방 분화의 억제가 NF-κ B 활성 경로와 다른 경로를 통해서 작용함을 시사한다.
- 뿐만 아니라 NFAT5를 억제시킨 세포에 TNF-α를 처리했을 때 TNF-α에 의한 골분화 증가가 억제 됨을 확인하였다(Fig. 3A).
- 뿐만 아니라 TNF-α에 의해서 증가 되었던 NF-κB promoter활성화가 NFAT5를 감소 시킨 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포에서 감소 됨을 확인하였다(Fig. 4).
- 우선 siCont이 transfection세포에서 TNF-α를 농도별로 처리 하였을 때 골세포로의 분화가 TNF-α의 농도에 비례하여 증가 됨을 확인 하였다.
- 이상의 결과를 종합하여 볼 때 인체 지방 유래 중간엽 줄기 세포가 골세포로 분화하는데 있어서 NFAT5가 NF-κB의 활성화를 조절하고 이를 통해서 인체 지방 유래 중간엽 줄기세포의 골분화에 중요한 작용을 미치는 것으로 사료된다.
후속연구
- 실제로 NF-κB의 전사조절작용이 다양한 경로에 의해 조절됨이 알려져 있으므로[10, 17, 20], NFAT5가 NF-κB에 의한 전사조절작용을 조절할 가능성이 있으며, 이를 확인하기 위해서는 추가실험이 필요하다.
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