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문제 정의
- 본 연구에서는 저산소증을 유발한 흰쥐 대뇌피질세포 배양에서 황련이 신경세포의 생존율에 미치는 영향을 조사하고, 그 기전으로 ROS의 생성 억제에 미치는 영향을 형광 색소인 2', 7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA)를 사용하여 경시적으로 관찰하였다.
제안 방법
- 조직을 1 ml Hank's용액으로 옮기고, 끝을 불에 달구어 구멍을 작게 한 pasteur pipette으로 6〜7회 통과시켜 신경세포를 분산시켰다. 이 후 분산된 세포를 모으고 세포수를 측정한 다음 약 1, 500 cells/mn?가 되도록 B27을 첨가한 plating neurobasal media (Invitrogen Life Technology) (100 ml neurobasal, 2 ml B27 supplement, 0.25 ml glutamax I, 0.1 ml 25mM glutamate, 0.1 ml 25 mM 2-mercaptoethanol)에 접종하여 5% CCh 배양조에서 배양한 다음 2〜3일 간격으로 배 양액을 feeding neurobasal media (100 ml neurobasal, 2 ml B27 supplement, 0.25 ml glutamax I)로 1/3씩 교환하였다.
- Culture plate 를 CO2 Water Jacketed Incubator (Forma Scientific Inc., Maretta, OH, USA)를 이용하여 2% O”5% CO2 환경에서 3시간 처리하여 저산소증을 유도하였다. 저산소 처리가 끝나면 배양세포를 정상산소 환경 배양조에 옮기고 계속 배양하였다.
- 저산소 처리가 끝나면 배양세포를 정상산소 환경 배양조에 옮기고 계속 배 양한 다음 3일째에 각각 배양액 20 "를 96-well plate 에 옮기고 pyruvate substrate (NADH 1 mg/ml)를 20 卩1 씩 가한 다음, 상온에서 2분간 흔든 후 37。(2에서 30분간 더 흔들었다. 발색시약(color reagent, Sigma 505-2)을 20 卩1씩 가하고 상온에서 20분간 흔든 후, 0.4 N NaOH를 100 成씩 가하고 상온에서 15분간 더 흔든 다음 ELISA reader로 흡광도 (OD450)를 측정하였다.
- ROS 생성세포는 형광 색소인 H2DCF-DA (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)를 사용하여 관찰하였다. DIV 10 에 황련 1.
- Eugene, OR, USA)를 사용하여 관찰하였다. DIV 10 에 황련 1.0 昭/ml로 처리하고 3일간 배 양한 후 저산소증을 유발하기 직 전, 유발 후 1시간과 유발 후 1, 3일에 각각 염색하였다. H2DCF-DA 처리 전에 세포를 feeding neurobasal media로 씻어주었다, H2DCF-DA를 최종 농도 1。nM이 되도록 배양액에 넣고 如분 동안 CO2 배양조에서 배양시킨 후 feeding neurobasal media로 두 번 씻어준 다음 형광현미경으로 관찰하였다.
- 0 昭/ml로 처리하고 3일간 배 양한 후 저산소증을 유발하기 직 전, 유발 후 1시간과 유발 후 1, 3일에 각각 염색하였다. H2DCF-DA 처리 전에 세포를 feeding neurobasal media로 씻어주었다, H2DCF-DA를 최종 농도 1。nM이 되도록 배양액에 넣고 如분 동안 CO2 배양조에서 배양시킨 후 feeding neurobasal media로 두 번 씻어준 다음 형광현미경으로 관찰하였다. H2DCF-DA는 dimethylsulfoxide (DMSO) 로 5 mM의 머ock을 만들고 이를 feeding neurobasal media 로 50。배 희석하여(최종농도 10 nM) 세포에 처리하였다.
- 모든 실험은 최소 8배수로 시행하였고, 세포의 생존율은 대조군에 대한 백분율(% of control)로 표시하였다. 통계학적유의성은 Mann-Whitney U test로 검증하였다.
- 추출물이 저산소증을 유도한 신경세포를 보호하는 효능을 조사하기 위하여 흰쥐 E18 대뇌신경세포를 뉴로베이잘 배지에 배양하고 DIV 10에 황련 1.0 昭/ml를 처리하고 3일간 더 배양한 후, DIV 13에 배양용기를 특수 이산화탄소 배양조(CO2 Water Jacketed Incubator, Forma Scientific Inc.)를 이 용하여 2% 6/5% CO2 환경에서 3시간 처리하여 저산소증을 유도하였다. 저산소 처리가 끝나면 배양세포를 정상산소 환경 배양조에 옮기고 계속 배양하면서 세포의 생존율을 LDH 방법으로 조사한 결과, 대조군에 비하여 황련을 첨가하기 직 전(DIV 10)에는 100.
- HzDCF-DA 염색을 이용하여 황련이 ROS 생성에 미치는 영향을 조사하였다. DIV 10에 황련 1.
- 조사하였다. DIV 10에 황련 1.0 昭/ml를 처 리하고 3 일간 배양한 후 저산소증을 유발하기 직전(DIV 13)에 HzDCF-DA로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다(Fig. 3). 황련을 첨가하지 않은 대조군의 경우 ROS를 생성하는 세포가 흔히 발견되었으며 그 강도도 높았다(Fig.
- DIV 10에 황련 1.0 卩g/ml를 처 리하고 3일간 배 양한 후 저산소증을 유발하고 H2DCF-DA로 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다. 저산소증 처리 후 1시간 후에 관찰한 사진을 Fig.
- 황련이 ROS 생성에 미치는 영향을 H2DCF-DA [3]를 이용하여 조사하였다. 정상산소환경에서 H2DCF-DA에 염색되는 세포가 전체 세포 가운데 15%였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 황련은 대한약전 및 대한약전 외 한약 규격주해[18]에 근거하여 동국대학교 경주 한방병원에서 구입하였다. 황련(2 g)에 20 ml의 증류수를 넣어 균질화하고 상온에서 4시간, 4。(2에서 18시간 진탕하였다.
- 임신 18 일 (embryonic day 18: 琅)의 Spmgue-DaMey 계 흰쥐 대뇌피질신경세포를 Brewer 등[기의 방법에 따라 배양하였다. 즉, &8의 흰쥐를 dry ice가 들어 있는 통 속에 3〜5분간 넣어 마취하고, 자궁을 가른 후 흰쥐 태아를 취하고 뇌를 잘라내었다.
데이터처리
- 통계학적유의성은 Mann-Whitney U test로 검증하였다.
성능/효과
- )를 이 용하여 2% 6/5% CO2 환경에서 3시간 처리하여 저산소증을 유도하였다. 저산소 처리가 끝나면 배양세포를 정상산소 환경 배양조에 옮기고 계속 배양하면서 세포의 생존율을 LDH 방법으로 조사한 결과, 대조군에 비하여 황련을 첨가하기 직 전(DIV 10)에는 100.8±2.01%, 저산소증을 유발하기 직전(DIV 13), 유발 후 1일 (DIV 14), 3일 (DIV 16), 5일 (DIV 18)에 각각 98.16± 4.62, 108.98±4.24, 122.74±4.60(p<0.01), 128.8812.64% (p<0.01)의 생존율을 나타내었다(Fig. 1). 이는 황련 물추출물이 저산소증에서 신경세포 사망 억제 효능이 있음을 의미한다.
- 2에 나타내었다. 초록형광을 내는세포들(asterisk)은 그렇지 않은 세포(arrow)에 비하여 세포체가 팽윤되어 있는 것이 분명히 나타났다. 이는 세포가 손상을 받아 ROS를 많이 생성하고 있는 것으로 해석된다.
- 반하사심탕(半夏瀉心湯), 삼황사심탕(三黃瀉心湯), 황련해독탕(黃連解毒湯), 회춘양격산(回春凉膈散) 등의 처방이 황련의 특징을 잘 나타내준다. 본 연구에서는 황련의 물추출액이 저산소증을 유도한 대뇌 신경세포의 세포사 억제효능을 LDH방법으로 조사한 결과추출액을 첨가한 실험군은 대조군에 비하여 저산소증 유도 1, 3, 5일 후에 각각 8.98±4.24, 22.74±4.60(p<0.01), 28.88± 2.64%(p<0.01)2] 생존율 증가를 나타내었다. 이는 황련 물추출물이 저산소증에서 신경세포 사망 억제 효능이 있음을 의미한다.
- 이 사실은 ROS의 주된 생성이 미토콘드리아임을 재확인한다. 배지에 황련 물추출물을 첨가한 경우 ROS를 생성하는 세포가 7%로 줄어들었으며, 형광의 강도에 있어서도 현저한 차이가 있었는데, 이는 ROS 을 생성하는 세포의 수 뿐 아니라 세포 당 생성하는 량도 대조군에서 유의하게 많음을 의미한다.
- 흰쥐의 허혈-재관류 실험에서 황련추출물은 콩팥 (kidney)의 손상을 줄였는데, 이 경우 glutathione/gluta thione disulfide 비율 및 항산화 효소들인 superoxide dis- mutase와 catalase의 활성 이 황련추출물을 경구 투여한 쥐에서 증가하였다卩이. 또한 콩팥세포의 DNA 분절이 황련추출물을 경구 투여한 쥐에서 현저히 감소하였다. 이는 황련 물추출물이 산화스트레스에 의 한 세포자연사로부터 콩팥세포를 보호함을 시사한다.
후속연구
- 저산소 등과 같은 흥분독성(excitotoxicity) 상황에서는 ROS의 생성이 촉진되어 방어체계의 한계를 넘는 산화스트레스를 유발하여 신경세포 사멸을 야기한다[8]. 따라서 홍분독성 상태에서 ROS 생성을 억제하면 세포사를 억제할 수 있을 것으로 기대된다.
- 그리고 흰쥐 알츠하이머병 모델에서 berberine의 위내투여(intragastric administration)는 공간기억손상을 현저히 호전시키 몌42]/ human neuroglioma H4 cell에서 berberine은 Ap의 수준을 낮춘다. 본 연구를 포함한 이러한 결과들은 황련을 알츠하이머병 치료제 및 항산화제로 개발할 수 있음을 시사한다⑵.
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