폐기물로 버려지는 식품가공 부산물의 부가가치를 높여 포도 유래 기능성 소재를 생산하기 위한 목적으로 포도 송이가지로부터 레스베라트롤의 추출 조건을 최적화하였고 포도 송이가지 추출물(grape fruit stem extract, GFSE)의 생리활성을 평가하였다. 총 폴리페놀 및 레스베라트롤의 추출 조건으로서 추출 용매(메탄올과 에탄올), 시료와 용매의 처리 비율(w/v), 추출 온도 및 추출 시간이 레스베라트롤 추출 수율에 미치는 영향을 실험적으로 검토하고 통계프로그램을 이용하여 유의성을 평가하였다. 포도 송이가지로부터의 레스베라트롤 추출 조건을 최적화 한 결과, 80%의 에탄올에서 1:lO(w/v)의 용매의 비로 $60^{\circ}C$에서 90분을 추출하는 것이 가장 높은 추출수율을 나타냈다. 또한 포도 송이가지 추출물(GFSE)과 다른 항산화 물질의 생리활성 비교분석을 실시하였다. DPPH법에 의한 전지공여능과 SOD 유사활성으로 측정한 항산화 활성분석결과, 포도 송이가지 추출물은 비교물질로 사용된 항산화 물질들에 비해 높은 항산화능을 보였다. 결과적으로 본 연구에서 제조된 포도 송이가지 추출물은 항산화능이 높은 건강기능식품 및 화장품 소재로 주목받고 있는 레스베라트롤 소재로서 사용할 수 있음을 확인하였다.
폐기물로 버려지는 식품가공 부산물의 부가가치를 높여 포도 유래 기능성 소재를 생산하기 위한 목적으로 포도 송이가지로부터 레스베라트롤의 추출 조건을 최적화하였고 포도 송이가지 추출물(grape fruit stem extract, GFSE)의 생리활성을 평가하였다. 총 폴리페놀 및 레스베라트롤의 추출 조건으로서 추출 용매(메탄올과 에탄올), 시료와 용매의 처리 비율(w/v), 추출 온도 및 추출 시간이 레스베라트롤 추출 수율에 미치는 영향을 실험적으로 검토하고 통계프로그램을 이용하여 유의성을 평가하였다. 포도 송이가지로부터의 레스베라트롤 추출 조건을 최적화 한 결과, 80%의 에탄올에서 1:lO(w/v)의 용매의 비로 $60^{\circ}C$에서 90분을 추출하는 것이 가장 높은 추출수율을 나타냈다. 또한 포도 송이가지 추출물(GFSE)과 다른 항산화 물질의 생리활성 비교분석을 실시하였다. DPPH법에 의한 전지공여능과 SOD 유사활성으로 측정한 항산화 활성분석결과, 포도 송이가지 추출물은 비교물질로 사용된 항산화 물질들에 비해 높은 항산화능을 보였다. 결과적으로 본 연구에서 제조된 포도 송이가지 추출물은 항산화능이 높은 건강기능식품 및 화장품 소재로 주목받고 있는 레스베라트롤 소재로서 사용할 수 있음을 확인하였다.
The extraction conditions for resveratrol production from grape fruit stem, which is a by-product of grape processing, were optimized to develop high-functional grape-based products. Additionally, the bioefficacy of grape fruit stem extract (GFSE) as an antioxidant agent was evaluated. Resveratrol w...
The extraction conditions for resveratrol production from grape fruit stem, which is a by-product of grape processing, were optimized to develop high-functional grape-based products. Additionally, the bioefficacy of grape fruit stem extract (GFSE) as an antioxidant agent was evaluated. Resveratrol was extracted using various experimental conditions such as extractant type, extractant concentration, raw material-extractant ratio, extraction time and temperature, and the results were analyzed using a statistical program (SPSS). The resveratrol yield was the highest when 80% ethanol with a raw-material-extractant ratio of 1:10 (w/v) was used. In addition, the optimal temperature and time were selected as $60^{\circ}C$ and 90 min, respectively. When the antioxidant activity was analyzed and expressed as DPPH radical scavenging activity and SOD-like activity, the antioxidant activity of GFSE was higher than that of BHT, BHA and L-ascorbic acid. Finally, it was found that GFSE could be used as a raw material for the production of high antioxidant agents.
The extraction conditions for resveratrol production from grape fruit stem, which is a by-product of grape processing, were optimized to develop high-functional grape-based products. Additionally, the bioefficacy of grape fruit stem extract (GFSE) as an antioxidant agent was evaluated. Resveratrol was extracted using various experimental conditions such as extractant type, extractant concentration, raw material-extractant ratio, extraction time and temperature, and the results were analyzed using a statistical program (SPSS). The resveratrol yield was the highest when 80% ethanol with a raw-material-extractant ratio of 1:10 (w/v) was used. In addition, the optimal temperature and time were selected as $60^{\circ}C$ and 90 min, respectively. When the antioxidant activity was analyzed and expressed as DPPH radical scavenging activity and SOD-like activity, the antioxidant activity of GFSE was higher than that of BHT, BHA and L-ascorbic acid. Finally, it was found that GFSE could be used as a raw material for the production of high antioxidant agents.
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문제 정의
본 연구에서는 포도 송이가지로부터 레스베라트롤을 순수분리하여 그 특성을 검토하는 대신 레스베라트롤 이외에도 다른 항산화성 물질을 복합적으로 함유하는 포도 송이가지 추출물(GFSE)의 특성을 조사하고 산업적 활용 가능성을 검토하고자 하였다. 따라서 생리활성 분석을 위해 조제된 모든 시료의 농도는 GFSE에 함유된 레스베라트롤을 기준으로 mg/ml으로 표시했으며, 희석시에는 80% 에탄올을 이용하였다.
본 연구에서는 포도 송이가지의 부가가치를 높여 고기능성 포도 가공제품의 개발을 위하여 포도 송이가지로부터의 레스베라트롤 추출 조건을 최적화하고 추출물의 항산화 활성을 평가하였다.
가설 설정
17) 레스베라트롤의 주요 공급원은 포도와 땅콩 및 그들의 가공품 등이다.10,18) 최근 생리활성을 나타내는 트랜스 레스베라트롤(trans- resveratrol)이 포도에 함유되어 있는 것으로 알려진 이후 이에 관한 관심이 높아졌다.
제안 방법
9,10,12) 본 연구에서도 추출 용매에 따른 총 폴리페놀 수율에 미치는 영향을 검토하기 위해 용매의 종류(에탄올, 메탄올)와 용매의 농도(70, 80, 90, 100%)를 달리하여 포도송이 가지의 추출실험을 실시하였다. 포도 송이가지로부터 폴리페놀을 서로 다른 조건에서 추출하고, Folin-Denis방법을 이용하여 총 폴리페놀 함량을 측정하여 포도 송이가지 단위 g당 추출된 총 폴리페놀 함량(mg/g)으로 추출율을 환산하였다(Fig.
2 ml)를 가하여 혼합하고 상온에서 30분간 방치시킨 후, microplate reader(VERSAmax, Molecular Device, CA, USA)를 이용하여 750nm에서 흡광도를 측정하였다. Chlorogenic acid를 표준물질로 이용하여 검량선을 작성하여 총폴리페놀 함량을 계산하였다.
:12 :23, v/v/v)의 혼합용매를 사용하였다. TLC에서 전개한 후, 5% 황산으로 발색시켜 UV-lamp로 spot을 확인하였다. 레스베라트롤의 정량 분석은 HPLC 시스템(Agilent 1100, Agilent Technologies Inc.
검토하고자 하였다. 따라서 생리활성 분석을 위해 조제된 모든 시료의 농도는 GFSE에 함유된 레스베라트롤을 기준으로 mg/ml으로 표시했으며, 희석시에는 80% 에탄올을 이용하였다. 먼저, DPPH 라디칼 소거능으로 레스베라트롤 추출물의 항산화 활성을 조사하였다.
판단되었다. 따라서, 분석방법이 간단하고 분석 소요시간이 HPLC 분석보다 짧은 정량 분석방법으로서 분광광도계를 이용한 발색 정량법을 검토하였고, HPLC 분석결과와의 상관관계를 검토하였다. 총 폴리페놀 함량 측정시 표준물질로 사용되는 chlorogenic acid와 레스베라트롤 표준물질을 이용하여 Folin-Dewis방법27)에 따라 비색 정량하여 레스베라트롤을 분석하였다.
레스베라트롤 추출시 포도 송이가지와 용매인 에탄올 투입 비율(w/v)을 1:3, 1:5, 1:10, 1:20 으로 조정하여 최적의 용매 비율을 탐색하였다. 시료와 용매의 비율에 따른 레스베라트롤의 추출율은 Fig.
TLC에서 전개한 후, 5% 황산으로 발색시켜 UV-lamp로 spot을 확인하였다. 레스베라트롤의 정량 분석은 HPLC 시스템(Agilent 1100, Agilent Technologies Inc., CA, USA)을 사용하였으며, 분석에 사용된 컬럼은 ZORBAX Eclipse XDB-C18(5 μm, 4.6 × 150 mm, Agilent Technologies Inc., CA, USA)을 사용하였다. 용리제로 사용한 용매는 Rho 등(2005)의 방법을 참고하여 acetonitrile 과 증류수를 gradient 조건으로 사용하였고, 유속은 0.
따라서 생리활성 분석을 위해 조제된 모든 시료의 농도는 GFSE에 함유된 레스베라트롤을 기준으로 mg/ml으로 표시했으며, 희석시에는 80% 에탄올을 이용하였다. 먼저, DPPH 라디칼 소거능으로 레스베라트롤 추출물의 항산화 활성을 조사하였다. Fig.
따라서 에탄올을 추출용매로 선정하였다. 에탄올의 농도가 80%과 90%에서 각각 추출하였을 때, 레스베라트롤의 추출율에 큰 차이가 없었으므로 용매의 농도는 대량생산시 원가 절감을 위해 80% 에탄올을 레스베라트롤 추출 용매로 선정하였다.
이를 기본조건으로 하여 추출용매, 용매의 농도, 원료의 투입 비율(w/v)과 추출 시간 및 온도를 변화시켜 추출하였다. 포도 송이가지를 80% 에탄올로 추출하여 얻은 추출물을 포도 송이가지 주출물 (grape fruit stem extract, GFSE)이라 칭하고 생리활성 분석의 시료로 사용하였다.
3분인 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 레스베라트롤 표준물질로 검량선을 작성하였으며, 검량선으로부터 추출물의 레스베라트롤의 함량을 산출하였다.
그 결과 chlorogenic acid를 사용하여 작성한 표준곡선이 레스베라트롤을 사용한 표준곡선 결과보다 표준오차가 작고 직선성(R2)이 높게 나타났다(데이터 제시 생략). 이를 바탕으로 총 폴리페놀 함량은 chlorogenic acid를 표준물질로 이용하여 측정하였으며, 레스베라트롤은 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.
추출물의 레스베라트롤 함량은 HPLC 분석 후, 포도 송이가지 단위 g당 추출된 레스베라트롤 함량(μg/g)으로 환산하여 산출하였다(Fig. IB). 총 폴리페놀 추출실험과 마찬가지로 용매와 농도간의 상호작용은 없었으나(p = 0.
이를 기본조건으로 하여 추출용매, 용매의 농도, 원료의 투입 비율(w/v)과 추출 시간 및 온도를 변화시켜 추출하였다. 포도 송이가지를 80% 에탄올로 추출하여 얻은 추출물을 포도 송이가지 주출물 (grape fruit stem extract, GFSE)이라 칭하고 생리활성 분석의 시료로 사용하였다. 시료의 농도는 GFSE의 레스베라트롤의 함량(μg/ml)으로 표시하였다.
대상 데이터
12) 메탄올은 의약품에 대한 국제조화회의 가이드(International Conference on Harmonisation, ICH)에 그 잔류농도가 규제되어있고, 특히 식품의 제조과정에서는 사용이 제한되어 있는 용매이다. 따라서 에탄올을 추출용매로 선정하였다. 에탄올의 농도가 80%과 90%에서 각각 추출하였을 때, 레스베라트롤의 추출율에 큰 차이가 없었으므로 용매의 농도는 대량생산시 원가 절감을 위해 80% 에탄올을 레스베라트롤 추출 용매로 선정하였다.
사용하였다. 레스베라트롤 분석 및 생리 활성 분석에 사용된 시약은 모두 특급시약을 사용하였으며, 레스베라트롤 표준물질은 Sigma사(MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
레스베라트롤의 정성 분석을 위한 thin layer chromatography(TLC)의 전개용매는 클로로포름 : 헥산 : 메탄올(65 :12 :23, v/v/v)의 혼합용매를 사용하였다. TLC에서 전개한 후, 5% 황산으로 발색시켜 UV-lamp로 spot을 확인하였다.
총 폴리페놀 함량 측정시 표준물질로 사용되는 chlorogenic acid와 레스베라트롤 표준물질을 이용하여 Folin-Dewis방법27)에 따라 비색 정량하여 레스베라트롤을 분석하였다. 비색법으로 총 폴리페놀 함량 분석시보다 정확한 분석 값을 얻기 위한 지표 물질을 검량선의 경향으로부터 선정하였다. 그 결과 chlorogenic acid를 사용하여 작성한 표준곡선이 레스베라트롤을 사용한 표준곡선 결과보다 표준오차가 작고 직선성(R2)이 높게 나타났다(데이터 제시 생략).
포도 송이가지 (grape fruit stem)는 탕정그린영농조합법인(아산, 한국)으로부터 제공받았으며, 상온에서 건조한 후에 분쇄기(HM2500, 현대가전업(주), 한국)를 이용하여 분쇄 후 실험에 사용하였다. 레스베라트롤 분석 및 생리 활성 분석에 사용된 시약은 모두 특급시약을 사용하였으며, 레스베라트롤 표준물질은 Sigma사(MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
25℃; -O-, 45℃; -▼-,60℃; -▽-, 80℃. *Values with same alphabet were not significantly different α<0.05, determined by Duncan's multiple range test (p<O.OOl. a-dSignificantly different with regard to temperature.
실험결과의 통계처리는 SPSS 12.0(SPSS Inc, Ⅱ., USA)을 사용하여 ANOVA법에 의해 유의성을 검증하였으며, Duncan's multiple range test(p = 0.05)를 실시하여 통계적 유의성을 검증하였다.
이론/모형
레스베라트롤 추출물 중의 레스베라트롤의 확인은 TLC 분석법을 이용하였다. 클로로포름 : 헥산 : 메탄올(65:12:23, v/v/v)을 전개용매로 사용하여 실험한 후에, spot을 확인하였으며 레스베라트롤 표준물질과 에탄올 추출물 모두로부터 동일 위치에서 spot이 확인되었으며, Rf값은 0.
, CA, USA)을 사용하였다. 용리제로 사용한 용매는 Rho 등(2005)의 방법을 참고하여 acetonitrile 과 증류수를 gradient 조건으로 사용하였고, 유속은 0.6ml/min 로 하였다.26) 검출기로 UV 검출기를 사용하였고, 306nm에서 분석하였다.
따라서, 분석방법이 간단하고 분석 소요시간이 HPLC 분석보다 짧은 정량 분석방법으로서 분광광도계를 이용한 발색 정량법을 검토하였고, HPLC 분석결과와의 상관관계를 검토하였다. 총 폴리페놀 함량 측정시 표준물질로 사용되는 chlorogenic acid와 레스베라트롤 표준물질을 이용하여 Folin-Dewis방법27)에 따라 비색 정량하여 레스베라트롤을 분석하였다. 비색법으로 총 폴리페놀 함량 분석시보다 정확한 분석 값을 얻기 위한 지표 물질을 검량선의 경향으로부터 선정하였다.
총 폴리페놀 함량(total phenol content)은 Folin-Denis법27)을 이용하여 분석하였다. 추출액(0.
9,10,12) 본 연구에서도 추출 용매에 따른 총 폴리페놀 수율에 미치는 영향을 검토하기 위해 용매의 종류(에탄올, 메탄올)와 용매의 농도(70, 80, 90, 100%)를 달리하여 포도송이 가지의 추출실험을 실시하였다. 포도 송이가지로부터 폴리페놀을 서로 다른 조건에서 추출하고, Folin-Denis방법을 이용하여 총 폴리페놀 함량을 측정하여 포도 송이가지 단위 g당 추출된 총 폴리페놀 함량(mg/g)으로 추출율을 환산하였다(Fig. 1A). 실험데이터를 통계적으로 분석한 결과, 모든 실험군에서 추출 용매의 종류와 농도간의 상호 영향은 없으며(p = 0.
성능/효과
80% 에탄올을 추출 용매로 하여 25, 45, 60, 80℃의 온도에서 각각 25, 45, 60, 90, 120분 시간 간격으로 추출하였을 때, Fig. 3에서 보는 바와 같이, 추출 온도와 시간은 레스베라트롤 수율에 대한 상호작용을 갖고 있음을 확인하였고(p = 0.001), 추출 온도와 시간이 모두 유의한 인자임을 확인하였다. 레스베라트롤 추출율은 추출 시간에 따라 차이가 있었으며, 동일시간 내 추출 온도에 의해서도 차이가 있음을 알 수 있었다.
87 μg/ml)을 갖는 것으로 보고된 바 있으며,24) 본 실험에서도 유사한 결과를 확인하였다. GFSE는 1.7, 3.4, 6.8, 13.6 μg/ml의 농도에서 모두 90% 이상의 소거능을 보였으며, 레스베라트롤 표준물질보다 높은 라디칼 소거능을 나타냈다. 이는 레스베라트롤 이외에 다른 폴리페놀의 혼합물로 존재하는 GFSE의 특성을 반영한 결과로 판단되었다.
SOD 유사활성으로 측정한 항산화능은 Fig. 5에서 보는 바와 같이 GFSE가 L-ascorbic acid와 BHA보다 낮은 농도에서 높은 SOD 유사활성을 나타났으며, 농도 의존적으로 활성을 나타냈다. 항산화 실험에서 GFSE는 비교물질로 사용된 L-ascorbic acid와 BHA에 비해 높은 활성을 나타냈고, SOD 유사활성보다 DPPH 전자공여능에 더 높은 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
Trans형 레스베라트롤을 에탄올에 용해하여 HPLC로 분석한 결과, 머무름 시간이 9.7분대임을 확인하였다. Trans형 레스베라트롤은 열과 자외선에 의해 cis형 형으로 전환되어진다.
비색법으로 총 폴리페놀 함량 분석시보다 정확한 분석 값을 얻기 위한 지표 물질을 검량선의 경향으로부터 선정하였다. 그 결과 chlorogenic acid를 사용하여 작성한 표준곡선이 레스베라트롤을 사용한 표준곡선 결과보다 표준오차가 작고 직선성(R2)이 높게 나타났다(데이터 제시 생략). 이를 바탕으로 총 폴리페놀 함량은 chlorogenic acid를 표준물질로 이용하여 측정하였으며, 레스베라트롤은 HPLC를 이용하여 정량 분석하였다.
Trans형 레스베라트롤은 열과 자외선에 의해 cis형 형으로 전환되어진다. 따라서 cis형 레스베라트롤의 확인은 Lee의 방법을 이용하여 trans형 레스베라트롤 표준물질을 빛에 12시간 노출 후 측정하였으며,12) 머무름 시간이 10.3분인 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 레스베라트롤 표준물질로 검량선을 작성하였으며, 검량선으로부터 추출물의 레스베라트롤의 함량을 산출하였다.
001), 추출 온도와 시간이 모두 유의한 인자임을 확인하였다. 레스베라트롤 추출율은 추출 시간에 따라 차이가 있었으며, 동일시간 내 추출 온도에 의해서도 차이가 있음을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 레스베라트롤은 60℃에서 90분 추출하였을 때, 추출되는 레스베라트롤 수율이 가장 높은 것을 확인하였다.
조정하여 최적의 용매 비율을 탐색하였다. 시료와 용매의 비율에 따른 레스베라트롤의 추출율은 Fig. 2와 같았으며, 시료와 용매간의 비율은 레스베라트롤 추출수율에 유의적인 영향을 보였다 (p = 0.001). 시료와 추출 용매의 비가 1:3이나 1:5일 때보다 1 :10(w/v)의 비율일 때 레스베라트롤 추출율이 높은 것을 확인하였다.
001). 시료와 추출 용매의 비가 1:3이나 1:5일 때보다 1 :10(w/v)의 비율일 때 레스베라트롤 추출율이 높은 것을 확인하였다. 원료대비 용매의 사용량이 1 : 10(w/v)과 같이 용매 투입량이 높은 것은 천연물로부터 기능성 소재를 용매추출 방법으로 추출할 때 직면하는 일반적인 문제점으로 특히 식품용 소재를 생산하는 경우 사용할 수 있는 용매가 제한되어 있어 용매의 초기투입 비용과 추출용매의 재회수 비용 등 경제성을 크게 낮추는 요인이 되고 있다.
1A). 실험데이터를 통계적으로 분석한 결과, 모든 실험군에서 추출 용매의 종류와 농도간의 상호 영향은 없으며(p = 0.978), 용매(p = 0.423)와 농도(p = 0.408)에 따른 총 폴리페놀 추출 함량에는 차이가 없음을 확인하였다. 포도 송이가지로부터 추출되는 총 폴리페놀은 용매의 종류(메탄올과 에탄올)와 용매의 농도와 상관없이 비슷한 추출율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
레스베라트롤 추출율은 추출 시간에 따라 차이가 있었으며, 동일시간 내 추출 온도에 의해서도 차이가 있음을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 레스베라트롤은 60℃에서 90분 추출하였을 때, 추출되는 레스베라트롤 수율이 가장 높은 것을 확인하였다.
항산화 실험에서 GFSE는 비교물질로 사용된 L-ascorbic acid와 BHA에 비해 높은 활성을 나타냈고, SOD 유사활성보다 DPPH 전자공여능에 더 높은 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이상으로 폐기물로 버려지는 포도 송이가지로부터 레스베라트롤이 함유된 복합 항산화물을 제조하거나 고순도 레스베라트롤을 생산하기 위한 원료로 사용할 수 있음을 확인하였다. 단 포도 송이가지를 식품용도로 사용하기에는 농약의 잔류문제와 부산물 처리 등의 규제와 관련된 이슈를 선결해야 할 것으로 사료된다.
IB). 총 폴리페놀 추출실험과 마찬가지로 용매와 농도간의 상호작용은 없었으나(p = 0.450), 에탄올 추출물이 메탄올 추출물보다 레스베라트롤 함량이 높은 것을 확인할 수 있었다(p = 0.010). 이것은 레스베라트롤이 안토시아닌, 이소플라본, 루틴 등의 다른 폴리페놀 화합물보다 더 극성인 구조를 갖는 물질이므로 극성이 다소 높은 에탄올에서 추출율이 높은 것으로 설명된다.
408)에 따른 총 폴리페놀 추출 함량에는 차이가 없음을 확인하였다. 포도 송이가지로부터 추출되는 총 폴리페놀은 용매의 종류(메탄올과 에탄올)와 용매의 농도와 상관없이 비슷한 추출율을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. Jang 등은 70% 에탄올을 추줄 용매로 사용했을 때 폴리페놀 추출수율이 가장 높음을 보고하였고8) Jayaprakasha 등은 메탄올이 가장 높은 폴리페놀 추출수율을 나타낸다고 보고하였다.
5에서 보는 바와 같이 GFSE가 L-ascorbic acid와 BHA보다 낮은 농도에서 높은 SOD 유사활성을 나타났으며, 농도 의존적으로 활성을 나타냈다. 항산화 실험에서 GFSE는 비교물질로 사용된 L-ascorbic acid와 BHA에 비해 높은 활성을 나타냈고, SOD 유사활성보다 DPPH 전자공여능에 더 높은 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 이상으로 폐기물로 버려지는 포도 송이가지로부터 레스베라트롤이 함유된 복합 항산화물을 제조하거나 고순도 레스베라트롤을 생산하기 위한 원료로 사용할 수 있음을 확인하였다.
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