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문제 정의
- 이를 이용하여 resveratrol 강화 포도즙을 생산하기 전에 우선 시중에 판매되는 대표적인 포도즙 및 포도쥬스의 제조사별 resveratrol 함량을 조사하였다. Table 2에서 보는 바와 같이 대부분 시판 제품의 resveratrol 함량은 1 ppm 미만으로 분석되었으며 추후 관능시험분석의 결과를 토대로 기존의 resveratrob을 2~10배의 농도로 조절하여 기능성을 향상시키고자 하였다.
- 즉 resveratrol을 첨가하였을 경우 색도와 당도에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 결과로 나타났다. 기존 포도즙에 resveratr이추출물을 첨가했을 경우 관능검사실험의 결과를 살펴보았다. 정제된 resveratr아 추출물을 1, 5, 10 ppm 첨가한 포도즙과 80%에탄올만으로 추출한 resveratrol 추출물을 1 ppm 농도로 포도즙에 첨가한 후 추출물을 포함하지 않은 대조구와 비교하여 관능평가한 결과는 Table 4에 나타내었다.
- 부가가치를 향상시키는 것을 목표로 하였다. 우선 포도송이 가지에서 resveratrol> 추출하여 분리 정제하는 방법을 최적화하고, 이 추출물을 기존의 포도즙에 적용하여 관능검사를 수행하여 기능성 성분이 강화된 제품의 개발에 응용하고자 한다.
- 이에 본 연구는 포도착즙 공장에서 얻어지는 포도송이 가지 부산물로부터 기능성 물질인 resveratrol을 추출 정제하여 건강보조식품 및 향장품 재료로 사용함으로서 제품의 부가가치를 향상시키는 것을 목표로 하였다. 우선 포도송이 가지에서 resveratrol> 추출하여 분리 정제하는 방법을 최적화하고, 이 추출물을 기존의 포도즙에 적용하여 관능검사를 수행하여 기능성 성분이 강화된 제품의 개발에 응용하고자 한다.
제안 방법
- 100 mL의 ethyiacetate로 100 mL의 시료를 3회 추출하여 농축 후 최종부피를 10 mL로 보관하였으며, HPLC로 정량분석하였다
- 80% 에탄올 2.4 L에 송이가지 파쇄물 240 g을 잘 혼합한 후 초음파 추출 (401, 1 h)을 2회 실시하여 호일로 빛을 차단하고 냉각한 후 원심분리기를 이용해 4000 rpm, 15 min 동안 원심분리 후 상등액만 취하여 감압농축기로 4 0℃ 에서 농축해서 500 mL 2차 증류수에 희석하여 0.45 11m filter를 이용해 필터한 후 1/100로 희석하여 HPLC로 분석하였다. 송이가지 추출물 농축시 240 g의 건조물에서 18.
- 3), 80% 이상이 함유된 에탄올은 추출된 함량의 차이가 근소하여 80% 에탄올을 추출용매로 하여 1회 추출한 후 HPLC로 추출시간에 따른 함량 분석을 하였다. Fig- 3에서와 같이 초음파 추출결과, 추출 시간이 증가할수록 추출률이 증가함을 확인할 수 있었으며 60분 이후에는 시간에 따른 수율변화가 미미하여 향후 실험은 본 조건으로 추출하였다. 포도송이가지에 함유한 resveTatrolel 추출함량을 분석한 결과 resveratrol 함량은 183 mg으로 계산되었다.
- Resveratrol 추출물의 용액 내에서 안정성을 살펴보기 위하여 저장온도를 4℃, 25℃ 및 40℃로 하여 45 day동안 24 h 간격으로 HPLC로 분석하여 Fig. 4와 같은 결과를 얻었다. 4℃에서는 50 day까지 80% 정도는 안정하다고 볼 수 있고, 반감기로 보았을 경우 3 month 정도까지 안정하다고 볼 수 있다.
- HPLC 용매 조건은 acetonitrile : water = 30 : 70으로 하여 분석하였다. Resveratrole 100 ppm, 50 ppm, 10 ppm을 표준으로 하여검량선을 작성하고 이를 이용하여 정량분석을 실시하였다.
- Resveratrol의 정량분석을 위해 표준물질인 trans-resveratol 을 사용한 표준검량선을 작성하였다. 표준물질의 농도는 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 50 ppm로 하여 HPLC에 주입하여 얻은 검량선의 correlation coefficient (R2) 값이 0.
- 비 극성물질을 제거하기위하여 을 50 mL 첨가 후 10 min 간 흔들어주고 24 h 방치 후 분리된 용액에서 물층을 모아 3회 반복하여 동결 건조하였다. 건조된 시료 0.1 g을취해 acetonitrile:water (50 : 50) 50 mL에 1/5로 희석하여 HPLC로 분석하였다.
- 이렇게 나온 시료를 silica gel Merck #7734로 제조된 open c이umn에 분말형태로 시료를 로딩하였다. 그 후 ghexane과 ethylacet저e 용매 조성을 변경하면서 resveratrol을 분리 정제하였다(Fig. 2).
- 순도를 높이고자 ehexane으로 추출하여 비극성 물질을 제거한 추출물과 resveratrol 함량 (%)을 비교한 결과 지방 제거과정에서 resveratr이이 "-hexane층으로 상당량 이동되는 것을 알 수 있다. 따라서 추후 실험에서는 廿hexane을 이용한 추출과정을 배제하였다.
- 상기 방법을 이용하여 포도송이가지에서 추출, 분리 및 정제된 resveratrol 추출물을 첨가한 제품을 기존의 제품과 비교하여 건강보조식품 상품화의 가능성을 진단하여 보기 위하여 80% 에탄올추출물, 위의 방법으로 정제된 resveratrol을 첨가한 포도즙을 대조군과 비교하여 색도와 당도를 측정하였다(Table 3). 색차계를 이용하여 각 L (명도) 값, a (적색도)값, b (황색도) 값을 확인한 결과, 포도즙 군에 비해 L값은 증가하였지만 a값과 b값 모두 미미한 차이를 보였다.
- 결과 추출액 530 mL을 얻었다. 이 시료를 감압농축 후 증류수 50 mL에 희 석하여 0.45 ym Hltei로 필터한 후 산화 방지를 위해 vial에 가득 채워 1 day에 한번 1/10 증류수로 다시 희석하여 5℃, 25℃, 40'C에서 온도별로 보관하면서 안정성 연구를 수행하였다.
- 999이었匸> (data not shown). 이를 이용하여 resveratrol 강화 포도즙을 생산하기 전에 우선 시중에 판매되는 대표적인 포도즙 및 포도쥬스의 제조사별 resveratrol 함량을 조사하였다. Table 2에서 보는 바와 같이 대부분 시판 제품의 resveratrol 함량은 1 ppm 미만으로 분석되었으며 추후 관능시험분석의 결과를 토대로 기존의 resveratrob을 2~10배의 농도로 조절하여 기능성을 향상시키고자 하였다.
- 파쇄시킨 포도송이가지 10 g을 초음파 추출기를 이용해 20%, 40%, 60%, 80%의 에탄올을 이용하여 추출시간 20, 40, 60, 80, 100 min으로 40℃에서 각기 1회 추출하였다' 추출된 용액은 빛을 차단하기 위해 추출용기를 호일로 잘 씌워서 냉장고에서 냉각 후 원심분리기를 이용해 4000 rpm, 15 min 원심분리하여 상등액만 취하여 0.45 μm filter 를 이용해 필터한 후 HPLC로 분석하였다. HPLC 용매 조건은 acetonitrile : water = 30 : 70으로 하여 분석하였다.
- 포도 송이가지에 함유한 resveratrol의 추출수율을 알아보기 위하여 40℃ 에서 추출용매 조성변화에 따른 수율을 비교한 결과 에탄올의 함량이 증가할수록 주줄수율이 증가하였으나(Fig. 3), 80% 이상이 함유된 에탄올은 추출된 함량의 차이가 근소하여 80% 에탄올을 추출용매로 하여 1회 추출한 후 HPLC로 추출시간에 따른 함량 분석을 하였다. Fig- 3에서와 같이 초음파 추출결과, 추출 시간이 증가할수록 추출률이 증가함을 확인할 수 있었으며 60분 이후에는 시간에 따른 수율변화가 미미하여 향후 실험은 본 조건으로 추출하였다.
- 포도즙 착즙 후 폐기되는 포도송이가지를 재활용하여 항산화 물질로 잘 알려진 resveratrol을 80% 에탄올로 초음파 추출기를 이용하여 60분 동안 추출한 후 실리카겔 컬럼을 적용시켜 99% 이상의 순도로 정제하였다. 정제된 resveratrol의 안정성은 가℃에서는 반감기가 90일이었으며, 25℃에서는 60일로 조사되었다.
대상 데이터
- 본 실험에서 사용된 시약은 HPLC 분석용 용매로는 acetonitrile (HPLC 100% J.T Baker in USA, CH3CN), water (HPLC 100% J.T Baker in USA, 也0)를 사용하였다. 분석을 위한 표준물질인 trans-resveratrol (approx.
- 본 실험에서 사용한 장비로는, 동결 건조기 (일신랩, 모델 -PVTED 100R), 초음파 세척기 (성동, 모델 SD-35OH, 전류 3.2A, 전압 50-60 HZ, 정격시간-30분), HPLC (WATERS, 모델 Alliance 2695XZ, UV type 996PDA, LC type W2690/5, USA), prep-HPLC (WATERS, Delta prep 4000, USA), 가정용 믹서기 (LG전자, CM-9000, 정격시간 3분, 용량 500 ml), Dry-Oven (Doug-A, 모델」)A-00-SP, 220V/2.5KW), memberane filter (Pull GELMAN LAB, USA, pore size 0.45 ㎛1, diameter 4 mm), Rotary evaporator (EYELA SB-1000, Japan), 원심분리기 (Eppendorf, 5415R, Germany) 가 사용되었다.
- T Baker in USA, 也0)를 사용하였다. 분석을 위한 표준물질인 trans-resveratrol (approx. 99%, Sigma, USA, G4H12O3)은 초저온냉장고 -40℃에서 보관하여 사용하였다.
- 충북 영동에 위치한 옥천농협 농산물가공공장에서 캠벨포도로 포도즙을 착즙하고 남은 부산물인 포도송이 가지를 입수하여 세척 후 (송이가지에 송이껍질이 붙어 있지 않게 40℃ dry oven에서 수분이 완전히 없어질 때까지 잘 말려 파쇄기를 이용해 파쇄한 후 냉동실에 보관하여 사용하였다.
데이터처리
- 관능검사는 비훈련된 패널 21명을 대상으로 추출 정제된 resveratrol 1 ppm, 5 ppm, 10 ppm, 정제하지 않은 80% 에탄올 포도송이가지 추출물 1 ppm을 제조해 첨가하지 않은 일반 포도즙과 유의차 검정을 하기 위해 SAS 프로그램을 이용하여 통계 분석하였다.
이론/모형
- 포도에 함유되어 있는 trans-resveratrol의 함량은 high performance liquid choromatography (HPLC)법으로 정량하였다' 자세한 분석조건은 Table 1과 같다.
성능/효과
- 42%로 계산되었다. 순도를 높이고자 ehexane으로 추출하여 비극성 물질을 제거한 추출물과 resveratrol 함량 (%)을 비교한 결과 지방 제거과정에서 resveratr이이 "-hexane층으로 상당량 이동되는 것을 알 수 있다. 따라서 추후 실험에서는 廿hexane을 이용한 추출과정을 배제하였다.
- 정제된 resveratrol의 안정성은 가℃에서는 반감기가 90일이었으며, 25℃에서는 60일로 조사되었다. 또한 고순도 resveratrol 추출물을 적용하여 기존의 식품에 포함된 양의 2~10배 정도 강화시킨 포도즙의 관능평가를 수행한 결과 전반적인 기호도가 높았으며, 색, 향 및 당도는 일반 포도즙에 비해 유의적인 차이가 없었다. 앞으로 포도착즙의 부산물인 포도송이 가지에서 추출된 resveratrole 건강보조식품, 기능성향장품 소재 등으로 활용가치가 높을 것으로 사료된다.
- 정제된 resveratr아 추출물을 1, 5, 10 ppm 첨가한 포도즙과 80%에탄올만으로 추출한 resveratrol 추출물을 1 ppm 농도로 포도즙에 첨가한 후 추출물을 포함하지 않은 대조구와 비교하여 관능평가한 결과는 Table 4에 나타내었다. 색과 냄새는 모든 처리구에서 시료 간에 유의적 차이가 없었고, 맛과 전반적인 기호도는 유의수준 0.1%에서 시료간에 유의적 차이를 보였다. 맛에 있어서는 crude한 resveratrol 추출물 1 ppm을 첨가한 처리 구가 쓴맛이 강조되어 가장 낮은 점수를 받았고, 5 ppm의 순수 resveratrol 첨가 처리구가 가장 좋은 맛의 점수를 보였다, 전반적인 기호도에는 대조구에 비해 에탄올 추출 resveratrol 1 ppm 첨가 처리구의 점수가 가장 낮았고, 순도가 높은 resveratrol의 1, 5, 10 ppm 처리구 모두 높은 점수를 받았다.
- 포도송이가지에 함유한 resveTatrolel 추출함량을 분석한 결과 resveratrol 함량은 183 mg으로 계산되었다. 에탄올 추출물의 총 resveratrol 함량 (%)은 183 mg/18.4 g (추출물)이므로 0, 99%가 함유되어 있고, 포도송이 가지를 M-hexane 처리하여 동결건조하여 얻은 시료를 묽힌 후 분석된 resveratrol 함량 (%)은 0.42%로 계산되었다. 순도를 높이고자 ehexane으로 추출하여 비극성 물질을 제거한 추출물과 resveratrol 함량 (%)을 비교한 결과 지방 제거과정에서 resveratr이이 "-hexane층으로 상당량 이동되는 것을 알 수 있다.
- 9^ F9에 합하였고, sftUOe F10에 합하여, F1 에서 F10까지의 분획물을 분취하여 건조하여 보관하였다. 이때 분취된 resveratrol> HPLC로 분석한 결과 99% 이상의 고순도로 정제되었음을 알 수 있었다.
- 57로 가장 높은 기호도를 보였다. 이상의 관능검사 결과를 보면 resveratrole] 첨가시 색과 냄새는 시료간의 유의적 차이를 보이지 않았고, 맛과 전반적인 기호도에 있어서는 고순도의 resveratrol 추출물을 첨가한 포도즙의 기호도가 높게 나타났다.
- 색차계를 이용하여 각 L (명도) 값, a (적색도)값, b (황색도) 값을 확인한 결과, 포도즙 군에 비해 L값은 증가하였지만 a값과 b값 모두 미미한 차이를 보였다. 즉 resveratrol을 첨가하였을 경우 색도와 당도에는 큰 영향을 미치지 않는 것으로 결과로 나타났다. 기존 포도즙에 resveratr이추출물을 첨가했을 경우 관능검사실험의 결과를 살펴보았다.
- Fig- 3에서와 같이 초음파 추출결과, 추출 시간이 증가할수록 추출률이 증가함을 확인할 수 있었으며 60분 이후에는 시간에 따른 수율변화가 미미하여 향후 실험은 본 조건으로 추출하였다. 포도송이가지에 함유한 resveTatrolel 추출함량을 분석한 결과 resveratrol 함량은 183 mg으로 계산되었다. 에탄올 추출물의 총 resveratrol 함량 (%)은 183 mg/18.
후속연구
- 결론적으로 본 실험을 통해 포도즙 착즙 후 폐기되는 포도송이가 지로부터 고순도의 resveratrol> 분리 정제하여 기존 포도즙에 첨가하여 관능검사를 실시한 결과 맛, 색도, 당도 등의 차이가 미미하거나 오히려 향상되었으며 향후 적절한 scale-up 공정을 확립한다면 resveratrol 강화 포도즙 생산에 무리가 없을 것으로 판단되며, 향장제품을 포함한 기능성 바이오소재로 다양하게 응용될 수 있는 가능성이 있으며 포도부산물의 부가가치 제고에 상당히 이바지 할 것으로 사료된다.
- Resveratrole 빛, 온도, 산소에 매우 불안정한 물질이라서 이 3가지 요소는 가공함에 있어서 매우 조심해야할 요소로 판단된다. 상기한 3가지 요소만 차단해 준다면, 가공 상의 안정성 부분에서는 resveratrol 자체 안정성을 보완해 가공할 수 있을 것으로 사료된다.
- 또한 고순도 resveratrol 추출물을 적용하여 기존의 식품에 포함된 양의 2~10배 정도 강화시킨 포도즙의 관능평가를 수행한 결과 전반적인 기호도가 높았으며, 색, 향 및 당도는 일반 포도즙에 비해 유의적인 차이가 없었다. 앞으로 포도착즙의 부산물인 포도송이 가지에서 추출된 resveratrole 건강보조식품, 기능성향장품 소재 등으로 활용가치가 높을 것으로 사료된다.
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