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문제 정의
- 약리 성분은 잎에 함유된 epifriedelanol, quercetin, 종자유에 함유된 oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, caproic acid16) 등이며 혈관 이완에 대한 연구는 아직 보고된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 귀 전우의 혈관 이완효과와 그 기전을 연구하였다.
- 본 연구는 귀전우 부탄올 추출물이 백서에서 적출한 흉부대동맥의 phenylephrine에 의한 혈관 수축을 이완하는 효과가 있음을 보여준다. 혈관 내피세포를 제거한 후 귀전우 부탄올 추출물의 혈관 이완효과가 차단된 것은 귀전우의 혈관 이완 효과가 혈관 내피세포 (endothelium) 의존적임을 의미한다.
제안 방법
- , San Diego, CA, USA)와 125I 가 결합된 cGMP (10000 cpm per 100 l, specific activity 2200 Ci Mm, Dupont-New England Nuclear, Wilmington, DE, USA)를 함께 넣은 후 4C 에서 24시간 반응시켰다. 결합형과 비 결합형은 charcoal을 이용하여 분리하였으며 -counter 를 이용하여 방사능을 측정하였다.
- 귀전우 부탄올 추출물의 혈관 이완효과가 cGMP 와 관련이 있는지를 관찰하기 위하여 세포질 guanylate cyclase 억제제인 1 x 10-5 M ODQ 를 전 처리한 후 혈관 이완효과를 측정하였다. 그 결과 귀전우 부탄올 추출물의 혈관 이완효과가 완전히 억제되었다 (Fig.
- 귀전우 부탄올 추출물이 phenylephrine 에 의한 혈관 수축에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 귀전우 부탄올 추출물을 각각 1 x 10-6 g/ ml, 1 x 10-5 g/ ml 처리한 毛 phenylephrine (1 x 10-8 M - 1 x 10-5 M)을 투여하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 phenylephrine 으로 인한 혈관 수축이 귀전우 부탄올 추출물 농도 의존적으로 현저히 감소되었다 (Fig.
- 혈관 조직은 바로 액체질소에 넣어 반응을 정지시킨 후 -76C 에 보관한 후 cGMP 의 농도를 측정하였다. 무게 (wet wei아it)를 측정한 혈관 조직을 6% trichloroacetic acid 존재 하에서 균질화한 후 13, 000 g 에서 15분간 원심 분리하여 얻은 상층 액을 물에 포화된 diethylether 를 이용하여 4회 추출하였다. 추출액은 Speed-vac 농축기를 이용하여 농축하고 cGMP의 측정은 방사면역 측정법을 이용하여 분석하였다.
- 약물 실험을 하기 전 흉부 대동맥 절편에 1 g 의 기저 긴장도를 부하하고, 10분 간격으로 Krebs 용액을 갈아주면서 90분간 평형을유지시켰다. 일정한 기저선이 유지되면 1x10-6 M의 phenylephrine 으로 수축시키고 5분후 1 x 10-6 M의 ACh으로 이완시켜 이완률이 90%이상이었을 경우 혈관 내피세포가 손상받지 않은 것으로 판정하였다.
- 그 후 Krebs 용액으로 3회 세척하고 실험을 수행하였다. 여러가지 약물들에 의한 귀전우 부탄올 추출물의 혈관 이완 효과의 변화 측정은 약물을 20분간 전 처리하고 phenylephrine 으로 수축시킨 후, 귀전우 부탄올 추출물에 의한 이완반응을 농도 의존적으로 관찰하는 방법으로 측정하였다. 혈관 내피세포 비의존형 실험을 시행할 때에는 혈관 내피세포를 작은 면봉을 사용하여 제거한 후, phenylephrine 으로 수축시키고 ACh으로 이완시켜 혈관내피세포의 제거를 확인 후 실험을 수행하였다.
- 14%). 이를 다시물에 녹인 후 hexane, ethyl acetate, butanol, 물을 용매로 이용하여 차례로 분획하여 추출하였다. 탐색 결과 혈관 이완효과가 가장 뛰어난 butan이층 추출물 (1.
- 이완률은 phenylephrine 에 의한 수축에 대해 백분율로 계산하였다.
- 이를 다시물에 녹인 후 hexane, ethyl acetate, butanol, 물을 용매로 이용하여 차례로 분획하여 추출하였다. 탐색 결과 혈관 이완효과가 가장 뛰어난 butan이층 추출물 (1.8 g, 수율 0.18%)을 10% dimethylsulfoxide (DMSO) 에 녹여서 사용하였다.
- 여러가지 약물들에 의한 귀전우 부탄올 추출물의 혈관 이완 효과의 변화 측정은 약물을 20분간 전 처리하고 phenylephrine 으로 수축시킨 후, 귀전우 부탄올 추출물에 의한 이완반응을 농도 의존적으로 관찰하는 방법으로 측정하였다. 혈관 내피세포 비의존형 실험을 시행할 때에는 혈관 내피세포를 작은 면봉을 사용하여 제거한 후, phenylephrine 으로 수축시키고 ACh으로 이완시켜 혈관내피세포의 제거를 확인 후 실험을 수행하였다.
- 1 x 10-6 M 의 phenylephrine 을 넣어 10분간 더 평형을 유지시킨 후 농도별로 귀전우 부탄올 추출물 (3 x 10-4 5, 1 x 10-4, 3 x 10세 g/ml) 과 함께 3분간 반응시켰다. 혈관 조직은 바로 액체질소에 넣어 반응을 정지시킨 후 -76C 에 보관한 후 cGMP 의 농도를 측정하였다. 무게 (wet wei아it)를 측정한 혈관 조직을 6% trichloroacetic acid 존재 하에서 균질화한 후 13, 000 g 에서 15분간 원심 분리하여 얻은 상층 액을 물에 포화된 diethylether 를 이용하여 4회 추출하였다.
- 흉부 대동맥 절편을 95% O2, 5% CO2 혼합가스로 포화시킨 37C의 Krebs 용액이 들어있는 organ bath의 저부에 한쪽 끝을고정시키고, 다른 쪽 끝은 force-displacement transducer (Grass FT 03, GRASS Instrument, MA, USA) 에 연결하여 고정시킨 후 isometric tension을 생리 기록계 (Grass Model 7E, Grass Instrument, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 이완률은 phenylephrine 에 의한 수축에 대해 백분율로 계산하였다.
- 흉부 대동맥 절편을 95% O2, 5% CO2 혼합가스를 공급해 주면서 Krebs 용액에서 30분간 평형을 유지시킨 후 1 x 10세 M 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)을 넣어 주었다. 1 x 10-6 M 의 phenylephrine 을 넣어 10분간 더 평형을 유지시킨 후 농도별로 귀전우 부탄올 추출물 (3 x 10-4 5, 1 x 10-4, 3 x 10세 g/ml) 과 함께 3분간 반응시켰다.
대상 데이터
- 혈관 평활근의 이완은 혈관 내피세포에서 분비되는 여러 종류의 혈관 활성인자(vasoactive factor)에 의해 조절되는데, 이러한 혈관활성 인자에는 산화질소(NO), prostacyclin, 내피세포 유래 과분극 인자 (endothelium-dependent hyperpolarizing factor, EDHF) 등이 알려져 있다17). 또한 내피세포 유래 혈관 이완 인자들과 귀전우 부탄올 추출물의 혈관 이완효과와의 관련성을 알아보기 위하여 자율신경계, 칼슘 이온통로, 칼륨 이온통로, cyclooxygenase, 산화질소 생성 차단제와 같은 여러가지 약물들이 실험에 사용되었다. 내피세포 유래 혈관 이완 인자의 본체인 산화질소 (NO) 가 귀 전우 부탄올 추출물의 혈관 이완효과에 관여하는지를 알아보고자 먼저 산화질소 합성 억제제인 L-NAME 를 전 처리한 후 측정한 결과, 귀전우의 혈관 이완효과가 완전히 차단되었다.
- 몸무게 약 250~300 g 의 건강한 수컷 Sprague-Dawley 계 백서를 사용하였다. 경추를 탈골시켜 희생시킨 후, 즉시 복강을 열고 흉부 대동맥을 분리하였다.
- 이 연구에 사용된 ACh, phenylephrine, HCl, N-nitroarginine methyl ester (L-NAME), 1 H-[1, 2, 4]-oxadiazole-[4, 3- ]-quinoxalin-1-one (ODQ), indomethacin, glibenclamide, tetraethylammonium (TEA), verapamil, diltiazem, atropine, propranolol 등은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)으로부터 구입하여 사용하였다.
- 혈관 평활근의 정상적인 생리활성 유지를 위해 Krebs 용액 (Krebs-Henseleit Solution) 을 사용하였으며, 그 조성은 118 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.1 mM MgSO4, 1.2 mM KH2PO4, 1.5 mM CaCl2, 25 mM N* aHCO 10 mM glucose 이고, pH는 7.4 로 보정하였다.
데이터처리
- 실험 결과의 유의성 검증은 Si잉ma Plot 2000 프로그램을 이용하여 처리하였으며, 실험결과를 Students t-test나 one-way ANOVA test를 통하여 p가 0.05 이하인 경우 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 무게 (wet wei아it)를 측정한 혈관 조직을 6% trichloroacetic acid 존재 하에서 균질화한 후 13, 000 g 에서 15분간 원심 분리하여 얻은 상층 액을 물에 포화된 diethylether 를 이용하여 4회 추출하였다. 추출액은 Speed-vac 농축기를 이용하여 농축하고 cGMP의 측정은 방사면역 측정법을 이용하여 분석하였다. 간단히 설명하면, 시료와 표준물질을 50 mM sodium acetate 완충용액 (pH 4.
성능/효과
- Ca2+ 통로 차단이 귀전우 부탄올 추출물에 의한 혈관 이완 효과에 미치는 영향을 측정하기 위하여 Ca2+ 통로 차단제인 verapamil 1 x 10-5 M 과 diltiazem 1 x 10-6 M 을 각각 전 처리한 후 귀전우 부탄올 추출물에 의한 이완 정도를 측정한 결과 verapamil 과 diltiazem 를 전 처리하지 않은 군과 유의한 차이가 없었다 (Fig. 5).
- K+ 통로 차단이 귀전우 부탄올 추출물의 혈관 이완 효과에 영향을 주는지를 측정하기 위하여 ATP-감수성 K+ 통로 억제제인 1 x 10-5 M glibenclamide 과 비 선택적 K+ 통로 억제제인 1 x 10-5 M tetraethylammonium (TEA)를 각각 전 처리한 후 귀전우부탄올 추출물의 이완효과를 측정한 결과 glibenclamide 와 TEA 를 전 처리하지 않은 군과 유의한 차이가 없었다 (Fig. 6).
- NO/cGMP 계가 귀전우 부탄올 추출물에 의한 혈관 이완 효과에 관여한다면 산화질소에 의하여 활성화되는 가용성 구아닐산 고리화효소 또한 귀전우 부탄올 추출물에 의한 혈관 이완 효과에 관여할 것으로 사료되어 가용성 구아닐산 고리화효소 억제제인 ODQ를 전 처리 한 후 혈관이완효과를 측정한 결과, 귀 전우에 부탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과가 억제되었다. 따라서 이 연구 결과 귀전우 부탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과는 NO/cGMP 계를 경유하여 일어나는 것을 의미한다.
- 귀전우 부탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과가 prostacyclin 과 연관이 있는지를 관찰하기 위하여 비 선택성 cyclooxygenase 억제제인 1 x 10-5 M imdomethacin 전 처리 후 귀전우 부탄올추출물의 혈관 이완효과를 측정한 결과, indomethacin 전 처리하지 않은 군과 유의한 차이가 없었다 (Fig. 3).
- 귀전우 부탄올 추출물은 내피세포 의존적으로 혈관 평활근을 이완시켰고, 이와 같은 효과는 농도 의존적으로 나타났으며, NO/cGMP 신호전달계를 차단하면 완전히 억제되었다. 더욱이 혈관 조직을 귀전우 부탄올 추출물과 반응시키면 cGMP 의 생성이 증가하였고, 이러한 증가는 혈관 내피세포의 제거나 산화질소 합성 효소나 세포질 구아닐산 고리화 효소 차단 시 나타나지 않았다.
- 귀전우 부탄올 추출물의 이완효과가 산화 질소계와 관련이 있는지를 관찰하기 위하여 비 특이적인 산화질소 억제제인 L-NAME (1 x 10-5 M )를 전 처리하고 혈관 이완효과를 측정한 결과, 혈관 이완효과가 완전히 억제되었다(Fig. 2).
- K+통로에 대한 억제제로는 KCa 을 차단하는 TEA 와 sulfonylurea 계 약물인 glibenclamide 로 후자는 혈관 평활근에서 KCa 통로에는 영향을 미치지 않고 KATP 만을 차단한다. 귀전우 부탄올 추출물의 혈관 이완효과가 KCa 또는 KATP 를 경유하여 일어나는지 알아보기 위하여 KCa 차단제인 TEA 와 KATP 차단제인 glibenclamide 를 전 처리한 후 혈관 이완 효과를 측정한 결과, TEA 와 glibenclamide 를 전 처리하지 않은 군과 비교하여 귀전우의 혈관 이완효과에 영향이 없었다. 이러한 결과로 볼 때 귀전우의 혈관 이완효과는 K+ 통로와 무관한 것으로 사료 Prostacycline arachidonic acid로부터 cyclooxygenase에 의하여 생성되고, 이때 생성된 prostacycline 혈관 이완 작용을 갖는다. 귀전우 부탄올 추출물의 혈관 이완효과가 prostacyclin 의 생성과 관련이 있는지를 알아보기 위하여 cyclooxygenase 억제제인 indomethacin을 전 처리하고 귀전우 이완효과를 측정한 결과 indomethacin 을 전 처리하지 않은 군과 비교하여 차이가 없었다. 이와 같은 결과로 볼 때 prostacyclin 계는 귀전우 부탄올 추출물의 혈관 이완 작용과는 무관한 것으로 사료 된다26, 27).
- 귀전우 부탄올 추출물이 혈관 조직에서 cGMP 의 생성에 영향을 미치는지를 관찰하기 위하여 귀전우 부탄올 추출물을 흉부대동맥 절편에 직접 투여한 후 cGMP 의 생성량을 측정한 결과, 귀전우 부탄올 추출물을 투여하지 않은 군에 비해 귀전우 부탄올 추출물을 투여한 군이 농도 의존적으로 cGMP 의 생성량을 증가시킴을 관찰할 수 있었다 (Fig. 7).
- 세포 내 Ca2+ 농도가 증가하면 calmodulin 과 결합하여 myosine light 사lain (MLC)의 인산화를 촉진시켜 평활근을 수축시킨다. 귀전우 부탄올의 혈관 이완효과가 Ca2+ 통로와 연관이 있는지 알아보기 위하여 L-type Ca2+ 차단제인 verapamil 과 diltiazem을 전 처리 한 후 혈관 이완효과를 측정한 결과, verapamil과 diltiazem 전 처리하지 않은 군과 비교하여 귀전우부탄올 추출물의 혈관 이완효과에 영향이 없었다. 이러한 결과로 볼 때 귀전우의 혈관 이완효과는 Ca2+ 통로와 무관한 것으로 사료된다.
- 그 결과 귀전우 부탄올 추출물의 혈관 이완효과가 완전히 억제되었다 (Fig. 2).
- - 1 x 10-5 M)을 투여하였다. 그 결과 대조군과 비교하여 phenylephrine 으로 인한 혈관 수축이 귀전우 부탄올 추출물 농도 의존적으로 현저히 감소되었다 (Fig. 8).
- 또한 내피세포 유래 혈관 이완 인자들과 귀전우 부탄올 추출물의 혈관 이완효과와의 관련성을 알아보기 위하여 자율신경계, 칼슘 이온통로, 칼륨 이온통로, cyclooxygenase, 산화질소 생성 차단제와 같은 여러가지 약물들이 실험에 사용되었다. 내피세포 유래 혈관 이완 인자의 본체인 산화질소 (NO) 가 귀 전우 부탄올 추출물의 혈관 이완효과에 관여하는지를 알아보고자 먼저 산화질소 합성 억제제인 L-NAME 를 전 처리한 후 측정한 결과, 귀전우의 혈관 이완효과가 완전히 차단되었다.
- 따라서 이 연구 결과 귀전우 부탄올 추출물에 의한 혈관 이완효과는 NO/cGMP 계를 경유하여 일어나는 것을 의미한다. 이러한 결과로 볼 때, 귀전우 부탄올 추출물은 혈관 내피세포에서 산화질소의 합성을 증가시키고 가용성 구아닐산 고리화효소를 활성화시켜 cGMP 의 생성을 증가시킴으로써 혈관을 이완시키는 것으로 사료 된다24, 25).
- 또한 본 실험에서 귀전우 부탄올 추출물의 전 처리 후, phenylephrine 에 의한 혈관 수축이 현저하게 억제되는 것을 알 수 있었다. 흉부 대동맥에서 선택적 ill 효능제인 phenylephrine 에 의한 수축은 Ca2+ 통로를 통한 세포 내 Ca2+ 농도 증가에 의해 유지되므로 귀전우 부탄올 추출물은 부분적으로 아드레날린성 ■■ 1-수용체에 대하여 직접 길항하는 효과를 갖거나 1 수용체를 통한 세포 내의 Ca2+ 유입을 억제할 것으로 사료 된다.
- 본 연구결과를 종합해보면, 귀전우 부탄올 추출물은 NO/cGMP 계를 경유해 혈관 내피세포 의존적인 이완효과를 나타내며, 이러한 결과는 심혈관계 질환의 유용한 치료제가 될 수 있음을 시사한다.
- 이 연구에서는 귀전우 부탄올 추출물이 자율 신경계의 수용체를 경유하여 혈관을 이완시키는지 여부를 알아보기 위하여 콜린성 수용체 중에서 무스카린성 수용체를 선택적으로 차단하는 atropine 과 수용체를 선택적으로 차단하는 항 아드레날린성 약물인 propranol이과 atropine 을 처리한 경우, propranolol 과 atropine 을 전 처리하지 않은 군과 유의한 차이가 없었다. 이와 같은 결과로 볼 때, 귀전우의 혈관 이완효과는 교감 신경계와 무관한 것으로 사료 된다30, 31).
- 세 번째 동위 효소는 혈관 내피세포에 주로 분포하면서 혈관을 이완시키는데 작용하는 혈관 내피세포형 산화질소 합성효소 (ecNOS, eNOS, NOS 田)로써 acetylcholine에 의하여 활성화되어 혈관을 이완시킨다 19). 이러한 산화질소는 세포질의 guanylate cyclase를활성화시켜 cGMP 의 생성을 증가시켜 신호 전달체계를 통해 혈관 평활근을 이완 시킨다씨 본 연구에서 L-NAME 의 전 처리에 의해 귀전우의 이완효과가 억제되는 것으로 보아 귀전우 부탄올추출물에 의한 혈관 이완효과는 산화질소계를 경유하여 일어나는 것으로 사료된다.
- 이와 같은 결과로 볼 때, 귀전우 부탄올 추출물의 혈관 평활근 이완 기전은 내피세포에서의 NO/cGMP 경로를 활성화시켜나타나는 것으로 사료된다.
- 일정한 기저선이 유지되면 1x10-6 M의 phenylephrine 으로 수축시키고 5분후 1 x 10-6 M의 ACh으로 이완시켜 이완률이 90%이상이었을 경우 혈관 내피세포가 손상받지 않은 것으로 판정하였다. 그 후 Krebs 용액으로 3회 세척하고 실험을 수행하였다.
- 있었다. 흉부 대동맥에서 선택적 ill 효능제인 phenylephrine 에 의한 수축은 Ca2+ 통로를 통한 세포 내 Ca2+ 농도 증가에 의해 유지되므로 귀전우 부탄올 추출물은 부분적으로 아드레날린성 ■■ 1-수용체에 대하여 직접 길항하는 효과를 갖거나 1 수용체를 통한 세포 내의 Ca2+ 유입을 억제할 것으로 사료 된다.
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