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문제 정의
- 12 PLA와 PLGA 는 높은 생체적합성, 생분해성, 가공성을 가지고 있으며, 단량체량을조절함으로써 분해기간을 조절할 수 있으나 생체활성물질의 결여와 소수성으로 인해 세포의 부착에 다소 어려움을 가지는 단점이 있다.5 이에 본 연구에서는 글루탐산 알기닌, 시스틴 등의 친수성 아미노산으로 구성된 케라틴과 PLGA를 혼합하여 PLGA 지지체의 단점을 보안하고자 하였다. 이에 케라틴이 함유된 PLGA 지지체를 제조하고 케라틴 함유량에 따른 물성 및 특성을 분석하고 골수간엽줄기세포 (BMSC)를 파종하여 세포의 증식 정도를 측정하였다.
- 본 연구에서는 생분해성 고분자인 PLGA와 사람의 머리카락에서 유래된 케라틴을 각 함량에 따라 다공성 지지체를 제조하고, 이를 조직공학적으로 응용하고자 하였다.
제안 방법
- 5 이에 본 연구에서는 글루탐산 알기닌, 시스틴 등의 친수성 아미노산으로 구성된 케라틴과 PLGA를 혼합하여 PLGA 지지체의 단점을 보안하고자 하였다. 이에 케라틴이 함유된 PLGA 지지체를 제조하고 케라틴 함유량에 따른 물성 및 특성을 분석하고 골수간엽줄기세포 (BMSC)를 파종하여 세포의 증식 정도를 측정하였다.
- 케라틴/PLGA 다공성 지지체는 용매 캐스팅/염 추출법을 이용하여 제조하였다.13.14 0.5 g의 PLGA를 2 mL의 MC에 용해한 후, PLGA 양의 10, 20 및 50 wt%가 되도록 0.05, 0.1, 및 0.25 g의 케라틴을 첨가하였다. 그 후, 다공형성물질인 NaCl은 PLGA의 9배가 되도록 4.
- 지지체의 표면 관찰 및 다공도 분석 . 상기의 방법들을 사용하여 제조한 다공성 지지체의 표면, 내부의 다공형태를 주사전자현미경 (SEM, JSM-6400, JEOL, Japan)으로 관찰하였다.
- 지지체의 표면 관찰 및 다공도 분석 . 상기의 방법들을 사용하여 제조한 다공성 지지체의 표면, 내부의 다공형태를 주사전자현미경 (SEM, JSM-6400, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 면도칼로 5X5XI mm 의 크기로 절단하고 플라즈마 스퍼터를 이용하여 코팅하여 촬영한 사진으로 다공의 형태를 확인하였다?6 그리고 수은 다공도계 (Micromeri- tics Co.
- 상기의 방법들을 사용하여 제조한 다공성 지지체의 표면, 내부의 다공형태를 주사전자현미경 (SEM, JSM-6400, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 면도칼로 5X5XI mm 의 크기로 절단하고 플라즈마 스퍼터를 이용하여 코팅하여 촬영한 사진으로 다공의 형태를 확인하였다?6 그리고 수은 다공도계 (Micromeri- tics Co., Model AutoPore II 9220, USA) 를 이용하여 제조된 다공성 지지체의 다공 크기와 분포, 평균 다공직경 및 다공도를 측정하였斗.
- 상기의 방법들을 사용하여 제조한 다공성 지지체의 표면, 내부의 다공형태를 주사전자현미경 (SEM, JSM-6400, JEOL, Japan)으로 관찰하였다. 면도칼로 5X5XI mm 의 크기로 절단하고 플라즈마 스퍼터를 이용하여 코팅하여 촬영한 사진으로 다공의 형태를 확인하였다?6 그리고 수은 다공도계 (Micromeri- tics Co., Model AutoPore II 9220, USA) 를 이용하여 제조된 다공성 지지체의 다공 크기와 분포, 평균 다공직경 및 다공도를 측정하였斗.I,
- 주사열량계 측정. 케라틴 함량게 따른 지지체의 열적 거동을 관찰하기 위해 시차 주사열량계 (TA Instrument, DSC 2910, USA) 를 측정하였다. 상온에서부터 100°C까지 케라틴ELGA 지지체에 열을 가하며 열적 성질 변화를 측정하였다.
- 케라틴 함량게 따른 지지체의 열적 거동을 관찰하기 위해 시차 주사열량계 (TA Instrument, DSC 2910, USA) 를 측정하였다. 상온에서부터 100°C까지 케라틴ELGA 지지체에 열을 가하며 열적 성질 변화를 측정하였다. 분석 조건으로 승온 속도는 분당 10°C로 하였으며 질소기류 하에서 측정하였다.
- 친수성 측정. 케라틴 함량에 따른 다공성 지지체의 친수성 효과를 살펴보기 위하여 지지체 위에 트리판블루 염료를 떨어뜨리고 시간에 따른 흡수 정도를 관찰하였다16 트리판블루 염료를 떨어뜨리고 20, 40, 60, 80, 그리고 100분 후의 염료 침투 효과를 사진을 찍어 관찰하였다.
- 제조된 지지체의 물 흡수능력을 측정하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다. 먼저 지지체의 초기 무게( # )를측정하고 10 mL의 물에서 3, 5, 7 및 10일 동안 상온에서 방치하였다 물을 흡수한 지지체의 표면의 수분을 제거한 후 무게 (# 를 측정하여 식 #에 대입함으로써 물 흡수율을 측정하였다18 모든 실험은 동일 조건에서 세 번씩 수행하였다.
- ) 분석법을 이용하여 확인하였다. 세포가 파종된 지지체에 1, 3, 7 그리고 14일째에 MTT 용액(50 mg/mL)을 100 ㎕씩 넣고 4시간 동안 37 °C 인큐베이터에서 배양하였다 보라색 결정이 생성되면 PBS 로 결정이 떨어지지 않게 3번 세척하고 디메틸설폭사이드(Sigma Co.) 용액을 1 mL 넣어 결정이 완전히 녹을 때까지 초음파세척기로 1시간 동안 결정을 용해하였다. 그 후 96웰 플레이트에 샘플을 100 gL씩 분주하고 ELISA 플레이트 리더 (E-max, Molecular Device, USA)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다 20
- 케라틴/PLGA 지지체에서 BMSCs의 독성 평가. 골수간엽 줄기세포를 다양한 케라틴 함량에 따른 지지체 내에서의 세포 성장을 MTT 분석을 통해 비교하여 보았다. Figure 7에 나타낸 바와 같이, PLGA 지지체보다 케라틴을 함유한 지지체에서 높은 세포생존율을 확인할 수 있었으며 특히 케라틴이 10, 20 wt% 함유된 케라틴/PLGA 지지체에서 다른 지지체보다 높은 세포생존 정도를 보였다.
대상 데이터
- 시약 및 재료 케라틴은 인간 머리에서 유래된 것으로 미국의 Wake Forest 의 대 (Wake Forest University School of Medicine, winston-salem, USA) 에서 제공 받았다. PLGA(락타이드/글라이콜라이드 몰비 75/25, Resomer® RG 756, Boehringer Ingelheim Chem.
- , Germany)는 평균분자량이 90000 g/mole인 것을 사용하였다. 또한 염화나트륨(NaCl, Orient Chem. Co., Korea) 은 다공 생성물질로 사용하였는데 분자체를 사용하여 입자의 크기를 180-250㎛으로 조절하였다 메틸렌클로라이드(methylene chloride, MC, Tedia Co. Inc., USA) 및 이외의 모든 유기용매는 HPLC 등급을 사용하였다.
- 케라틴을 함유한 PLGA 다공성 지지체 제조. 케라틴/PLGA 다공성 지지체는 용매 캐스팅/염 추출법을 이용하여 제조하였다.
- 염의 추출은 3차 증류수를 6시간마다 교체하여, 48시간 동안 용출하였고, 5 mTorr, -80 °C 조건에서 24 시간 동안 동결건조하였다. 잔류용매인 MC를 제거하기 위해서 최소 1주일 이상 25 °C 진공오븐에서 건조시킨 후 실험에 사용하였다" 이들의 제조 모식도를 Figure 1에 나타내었다.
- 초대배양 골수줄기세포는 이미 잘 알려진 방법을 이용하여 분리 및 배양하였다.15 Fischer 쥐 (암컷 3주령)의 대퇴부를 절단하여 18게이지의 바늘과 PBS 수용액이 든 주사기를 사용하여 2~3 mL의 골수를 채취한 다음 배양액으로 2 배 희석하여, 50% 퍼콜(Percoll, Sigma Chem. co., USA) 점진구배용액에 천천히 낙하시켜 퍼콜 층과 섞이지 않도록 하였다. 이를 원심분리기로 2500 rpm에서 25분간 원심분리하여 적혈구 층, 퍼콜 층, 세포 층 및 혈장층으로 구분하였으며 마이크로 피펫을 이용하여 세포층만을 분리하여 배양액으로 다시 희석하고 1000 rpm에서 10분간 원심분리하였다.
- 케라틴을 함유한 다공성 지지체의 제조. 케라틴을 함유한 다공성 지지체는 용매 캐스팅/염 추출법을 이용하여 제조하였다.
- PLGA(락타이드/글라이콜라이드 몰비 75/25, Resomer® RG 756, Boehringer Ingelheim Chem. Co. Ltd., Germany)는 평균분자량이 90000 g/mole인 것을 사용하였다. 또한 염화나트륨(NaCl, Orient Chem.
이론/모형
- 케라틴을 함유한 PLGA 다공성 지지체 제조. 케라틴/PLGA 다공성 지지체는 용매 캐스팅/염 추출법을 이용하여 제조하였다.13.
- 케라틴을 함유한 다공성 지지체의 제조. 케라틴을 함유한 다공성 지지체는 용매 캐스팅/염 추출법을 이용하여 제조하였다. 외형적 형태는 실리콘 몰드의 형태와 똑같이 얻어졌으며 수축 부풀림, 불규칙한 크기의 구멍 및 여타 결함이 없는 것으로 관찰되었다.
- MTT. 세포의 부착도 및 증식률은 MTT(3-[4, 5~dimethyl- thiazol-2-yl] -2, 5-diphenyItetrazolium bromide, Sigma Co.) 분석법을 이용하여 확인하였다. 세포가 파종된 지지체에 1, 3, 7 그리고 14일째에 MTT 용액(50 mg/mL)을 100 ㎕씩 넣고 4시간 동안 37 °C 인큐베이터에서 배양하였다 보라색 결정이 생성되면 PBS 로 결정이 떨어지지 않게 3번 세척하고 디메틸설폭사이드(Sigma Co.
성능/효과
- 제조한 다공성 케라틴/PLGA 지지체의 SEM 사진은 Figure 2에 나타내었다. 지지체의 내부, 측면의 다공 형태는 소금입자와 같은 모양으로 나타났으며 다공 구조는 다공과 다공 사이의 연결이 양호하고 대부분이 열린 셀 구조를 하고 있는 것으로 나타났다. 케라틴이 함유된 지지체와 함유되지 않은 지지체의 다공형태는 형태학적으로 큰 차이가 관찰되지 않았으며 이러한 결과로케 라틴이 지지체 제조 시 다공형태에 큰 영향을 주지 않음을 확인하였다.
- 지지체의 내부, 측면의 다공 형태는 소금입자와 같은 모양으로 나타났으며 다공 구조는 다공과 다공 사이의 연결이 양호하고 대부분이 열린 셀 구조를 하고 있는 것으로 나타났다. 케라틴이 함유된 지지체와 함유되지 않은 지지체의 다공형태는 형태학적으로 큰 차이가 관찰되지 않았으며 이러한 결과로케 라틴이 지지체 제조 시 다공형태에 큰 영향을 주지 않음을 확인하였다.
- Figure 3의 다공 분포에서 케라틴의 함량이 50% 정도일 때 약간의 차이가 보였으나 다공도 및 중간 다공 크기를 분석해 본 결과(Table 1), 케라틴 함량에 따라 현저한 차이를 보이지 않음을 확인할 수 있었다. 케라틴 함량이 크게 증가되면 다공 크기에 작은 차이가 관찰되는 것은 케라틴 함량이 증가되면서 케라틴이 다공 주변을 조금씩 막은 것으로 예상되나 세포의 부착과 성장에 큰 영향을 주지 않는 범위 내인 것으로 사료된다 다공도는 모든 샘플에서 65% 이상의 다공도를 보였으며 이로써 케라틴이 첨가되더라도 일정한 크기의 다공을 가지는 지지체를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
- 17 각 샘플의 녹는점 (Tm) 은 50 °C 이상에서 나타났으며 PLGA 지지체와 케라틴을 함유한 지지체의 녹는점은 거의 유사하였다. 이 결과를 바탕으로 PLGA 지지체의 성질에 케라틴이 큰 영향을 끼치지 않으며, 케라틴 지지체를 생체 내 이식하더라도 열적으로 안정할 것으로 사료된다.
- 케라틴의 첨가에 따른 친수성 효과를 Figure 6에 나타내었다. 케라틴을 함유한 지지체는 약 430%의 함수율을 나타내었고 케라틴이 함유되지 않은 PLGA 지지체는 최대 320%의 함수율을 보였으며 케라틴을 함유한 PLGA 지지체가 PLGA 지지체보다 1.5 〜2배 높은 함수율을 보임을 확인하였다. 50 wt% 케라탄/PLGA 지지체에서 초기 함수율이 높았으나 48시간 이후에는 10, 20 wt% 케라탄庄LGA 지지체 보다 함수율이 낮게 나타났다.
- 5 〜2배 높은 함수율을 보임을 확인하였다. 50 wt% 케라탄/PLGA 지지체에서 초기 함수율이 높았으나 48시간 이후에는 10, 20 wt% 케라탄庄LGA 지지체 보다 함수율이 낮게 나타났다. 이는 50 wt% 케라틴 지지체가 같은 용적의 다른 표본들 보다 2~4배 이상의 케라틴이 함유되어 높은 밀도로 인해 일정시간 이후로 10, 20 wt% 케라틴/PLGA 지체 보다 낮은 수분 흡수율을 나타내는 것으로 사료된다 케라틴 지지체의 높은 함수율은 케라틴을 구성하는 주요 성분인 글루탐산 알기닌, 시스테인 등 대부분 친수성 아미노산으로, 이러한 수분 함유 능력이 뛰어난 구성성분으로 인하여 이와 같은 결과를 보이는 것으로 사료된다.
- 골수간엽 줄기세포의 분리 및 배양. 골수간엽 줄기세포는 대퇴부로부터 분리하여 배양하였으며, 3번 정도 계대 배양 후 세포를 관찰한 결과, 전형적인 골수간엽줄기세포의 형태를 관찰할 수 있었고, 3주 정도 배양하여 실험에 필요한 정도의 세포를 얻을 수 있었다.
- 골수간엽 줄기세포를 다양한 케라틴 함량에 따른 지지체 내에서의 세포 성장을 MTT 분석을 통해 비교하여 보았다. Figure 7에 나타낸 바와 같이, PLGA 지지체보다 케라틴을 함유한 지지체에서 높은 세포생존율을 확인할 수 있었으며 특히 케라틴이 10, 20 wt% 함유된 케라틴/PLGA 지지체에서 다른 지지체보다 높은 세포생존 정도를 보였다. 이는 세포가 재료에 부착하기 위해서는 재료에 혈청단백질이 흡착되어야 하는데, 소수성의 표면성질 때문에 세포와 재료 사이의 직접적인 상호작용이 이루어지지 않은 PLGA 지지체에 케라틴이 친수성을 부여함으로써 혈청 단백질 흡착을 유도하여 결과적으로 높은 세포생존율을 보인 것으로 사료된다.
- 용매 캐스팅/염 추출법으로 제조된 PLGA, 케라틴/PLGA 다공성 지지체는 SEM을 통하여 제조된 지지체 내부에 상호연결된 다공구조를 가짐을 확인하였으며 수은 다공도계 분석을 통해 일정한 크기의 다공과 높은 다공도를 가짐을 확인하였다. 케라틴을 함유한 지지체에서 높은 표면적심성과 물 흡수성을 확인하였는데 이는 케라틴을 구성하는 친수성 아미노산 구성성분들로 인하여 생체적합성과 높은 표면적 심성, 물 흡수율을 제공하는 것으로 사료된다.
- 케라틴을 함유한 지지체에서 높은 표면적심성과 물 흡수성을 확인하였는데 이는 케라틴을 구성하는 친수성 아미노산 구성성분들로 인하여 생체적합성과 높은 표면적 심성, 물 흡수율을 제공하는 것으로 사료된다. 케라틴 함량이 골수 간엽 줄기 세포의 성장과 증식에 미치는 영향을 MTT 분석을 통해 관찰한 결과, 시간이 지남에 따라 케라틴은 골수간엽줄기 세포에 높은 세포증식률을 제공함을 확인하였으며, 특히 케라틴 함량이 10, 20 wt%인 경우 지속적인 세포증식률을 확인하였다. 이러한 세포의 성장과 증식에 긍정적인 영향을 미치는 이유는 케라틴이 가지는 생체적합성과 친수성 때문으로 사료된다.
후속연구
- 이러한 세포의 성장과 증식에 긍정적인 영향을 미치는 이유는 케라틴이 가지는 생체적합성과 친수성 때문으로 사료된다. 이는 향후 케라틴/PLGA 지지체 설계에 있어서 중요한 인자로서 작용할 것으로 사료된다.
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