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문제 정의
- 본 연구에서는, 예로부터 신비의 영약이라고 알려져 있고, 부작용이 거의 없는 생약으로 인정되는 산삼 배양근의 NO 생성과 고혈압 억제 효과를 알아보았다.
제안 방법
- 선천성 고혈압 횐쥐(SHR)에서 혈압 강하 효과. ABE의 경우 혈관이완 효과나 NO 발생량이 많아 독성이 강할 것으로 사료 되어 열수 추출물인 W를 사용하여 in vico에서 산삼 배양근 의 혈압강하 효과를 확인하였다. 비마취 상태의 선천성 고혈 압쥐에 산삼 배양근 추출물(WE)을 0.
- Western 미ot analysis. ECV304 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지로 2x13 Cells/6 well로 분주한 후, 24시간 동안 배양 시키고 FBS가 없는 DMEM 배지로 교환한 후 media control, 산삼 배양근 추출물(WE, ABE)을 1-24 h 간격으로 처리하였다. 배양액을 제거하고 PMSF(lmM)가 포함된 TNN lysis buffer(100 mM Tris pH 8.
- SD rats(ll~13 주령)를 CO2 gas로 치사 후 가슴 부분을 절개하여 즉시 흉대동맥을 적출하였다. Krebs solution(in mM, NaCl 120, KC1 4.75, Glucose 6.4, NaHCO3 25, KH2PO4 1.2, MgSO4 1.2, CaCl2 1.7)층} 에서 결합조직과 지방 등 혈관 주변 조직을 제거하고 3~5 mm의 흉대동맥 환상 절편(aortic ring)을 만들었다. 산소로 포화시킨 Krebs 용액으로 채운 organ bath 내에 특수 제작된 stainless tissue holdere- 현 수하였다.
- 산삼 배양근 추출물의 혈관이완 효과. SD rats(ll~13 주령) 혈관을 적출하여 내피세포가 있는 것과 없는 것으로 나눈 후 혈관을 전 수축시켰다. 수축이 된 혈관에 WE 2.
- 혈관이완 효과 검색. SD rats(ll~13 주령)를 CO2 gas로 치사 후 가슴 부분을 절개하여 즉시 흉대동맥을 적출하였다. Krebs solution(in mM, NaCl 120, KC1 4.
- 혈압은 간접 법 (tail culf method)을 사용하여 선천성 고혈압쥐 (spontaneously hypertensive rat, SHR)의 꼬리 동맥에서 수축기 혈압(systolic blood pressure) 을 즉정하였다. Tail cufE와 pulse transducer (MLT1050, AD instruments, USA)를 꼬리에 위치시키고, pulse transducer는 physiograph recordei에 연결하여 혈압을 측정하였다. 혈압측정 전에 실험동물을 36℃로 조절된 warming box 내에서 15・20분간 안정화를 취한 후 수축기 혈압을 측정하였다.
- 산삼 배양근 추출물의 angiotensin-I-converting enzyme 활성 억제 효과 Angiotensin-1-converting enzyme(ACE)은 불활성 형인 angiotensin의 C 말단 His-Leu을 절단하여 혈관벽 평활근 을 수축 시키는 작용을 하는 angiotensin 를 생성시킬 뿐만 아니라, 혈관이완효과를 가지는 nanopeptide인 bardykinin을 불활 성화시키는 효소로 알려져 있다.26)인삼 추출물에서 이미 ACE 저해 효과가 보고된 바 있어?)산삼 배양근 추출물에서의 ACE 저해 효과를 확인 하고자 rabbit lung acetone powder0!] 산삼 추출물을 100μg씩 처리하였고, 양성 대조군으로 captopril을 50 gg 되도록 처리하였다. 양성 대조군인 captopril의 58%에 비해 100 gg ABE 처리 시에 약 6% 정도의 ACE 억제 효과를 보였다(Fig.
- 내피세포가 건재한 혈관과 제거한 혈관 모두에서 norepinephrine (NE) 10-7M로 혈관을 전 수축시킨 후 배양근 추출물과 분획을 투여하여 이완반응을 관찰하였다. 흉대동맥 환상절편 내부에 18G 척추 천자침을 삽입하여 몇 차례 회전시킴으로써 내 피세포를 제거하였다.
- 흉대동맥 환상절편 내부에 18G 척추 천자침을 삽입하여 몇 차례 회전시킴으로써 내 피세포를 제거하였다. 내피세포의 유무 확인은 NE 10-7 M로 혈관을 전 수축시킨 후 Ach 10-5 M을 투여하여 혈관이완 유무로써 확인하였다.
- 이 상징액을 감압농축 한 후, 50 mW sodium borate buffer 1 mZ로 용해시켜 228nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로서는 추출물 대신 추출용매 50ml를 첨가하였으며, ACE 저해활성 효과는 다음 계산식을 이용하여 계산하였다.
- NO 측정. 배양 산삼근 추출물(WE, ABE)을 시간 간격(1-24 h)으로 처리하여 ECV304 세포를 배양하였다. 생성된 NO의 양은 NO Detection Kit(iNtRon biotech.
- 심박동수는 맥박에서 나온 신호를 Chart4 for windows program(AD instruments, USA)으로 분석하였다. 비마취 상태의 SHR에 산삼 배양근 추출물을 0.5g/kg의 용량을 1회 경구 투여하고 24시간 동안 수축기 혈압을 측정하였다.
- 7)층} 에서 결합조직과 지방 등 혈관 주변 조직을 제거하고 3~5 mm의 흉대동맥 환상 절편(aortic ring)을 만들었다. 산소로 포화시킨 Krebs 용액으로 채운 organ bath 내에 특수 제작된 stainless tissue holdere- 현 수하였다. Organ bath 내의 온도는 37℃(2로 유지하였으며, 실험이 진행되는 동안 계속 carbogen(95% O2, 5% CQ)을 공급하여 용액의 pH> 7.
- Korea}을 이용하여 세포 배양액 중에 존재하는 nitrite(NO2-)< 측정하였다. 세포배양 상 등액 100 mZ와 술파닐아미드(sulfanilamide) 용액 50ml, 나피레 틸렌디아민(naphylethylenediamine) 용액 50 ml를 혼합하여 96 well plate에서 10분 동안 반응시킨 후, SUNRISE absorbance reader(TECAN, Austria)를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정 하였다, 표준농도 곡선은 ImM의 nitrite를 연속희석(serial dilution)하여 얻었다.
- 혈압측정 전에 실험동물을 36℃로 조절된 warming box 내에서 15・20분간 안정화를 취한 후 수축기 혈압을 측정하였다. 심박동수는 맥박에서 나온 신호를 Chart4 for windows program(AD instruments, USA)으로 분석하였다. 비마취 상태의 SHR에 산삼 배양근 추출물을 0.
- 5% NP- 40)를 이용하여 세포를 용해시키고, BCA(PIERCE, USA) 빙-법 으로 단백질을 정량하여, 각 시료 별로 50 μg을 western blot에 사용하였다. 이 시료를 10% polyacrylamide SDS gel 전기영동 을 후, PVDF membrane(Millipore, USA)으로 gel을 transfer 하고, 1:1, 00(배로 희석한 mouse polyclonal anti-eNOS를 결합 시키고 1:5,000배로 희석한 anti-mouse IgG HRP conjugate (Invitrogen, USA)로 2차 항체를 결합시킨 후, WEST-ZOLR Plus Western Blot Detection System(iNtRon biotech., Korea) 으로 eNOS 단백질 발현 정도를 관찰하였다.
- 적출대동맥에 1g의 resting tension을 가한 후 15분 마다 bath 용액을 바꾸어 주면서 1시간 동안 안정시켰다. 혈관의 수축이완반응은 고정된 aortic ring의 다른 한쪽을 isometric force-displacement transducer(FT03, Grass, AD instruments, USA)에 연결시켜, physiograph recorder (PowerLab/400, AD instruments, USA)로 기록하고 Chart4 for Windows program(AD instruments, USA)로 분석하였다21)
- Tail cufE와 pulse transducer (MLT1050, AD instruments, USA)를 꼬리에 위치시키고, pulse transducer는 physiograph recordei에 연결하여 혈압을 측정하였다. 혈압측정 전에 실험동물을 36℃로 조절된 warming box 내에서 15・20분간 안정화를 취한 후 수축기 혈압을 측정하였다. 심박동수는 맥박에서 나온 신호를 Chart4 for windows program(AD instruments, USA)으로 분석하였다.
대상 데이터
- 내피세포 배양 본 연구에 사용된 세포는 사람의 배꼽정맥 내 피세포(HUVEC)의 자연돌연변이 세포주인 ECV304 세포를 이용하였다. ECV304 세포는 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 분양 받아 10% fetal bovine serum(FBS)와 항생제 (100 units/m/ penicillin-streptomycin)7 "|- 첨가된 DMEM 배지로 5% CO2, 37T에서 배양하였다.
- 내피세포 배양 본 연구에 사용된 세포는 사람의 배꼽정맥 내 피세포(HUVEC)의 자연돌연변이 세포주인 ECV304 세포를 이용하였다. ECV304 세포는 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 분양 받아 10% fetal bovine serum(FBS)와 항생제 (100 units/m/ penicillin-streptomycin)7 "|- 첨가된 DMEM 배지로 5% CO2, 37T에서 배양하였다.
- 산삼 배양근 시료 및 조제. 본 실험에 사용한 산삼 배양근은 (주)바이오벨류에서 구입한 후 두 종류의 수용성 시료 산삼 배양근 열수주줄물(Water Extracts of wild ginseng adventitious root; WE)과 산삼 배양근 부탄올 추출물의 물 분획물 (Aqueous fraction of Butanol Extracts of wild ginseng adventitious root; ABE)을 준비하였다. WE는 12(FC에서 6시간 열탕 추출 후 감압 농축 과정을 거쳐 동결 건조하여 얻었다.
데이터처리
- 통계처리. 모든 실험결과는 student-t 검정을 하여 유의도를 검정하였으며 p값이 0.05이하일 때 유의도가 있다고 판정하였다.
이론/모형
- Angiotensin-I-converting enzyme 저해 작용. ACE 저해활성 측정은 Cushman 등20)의 방법에 따라 측정하였다. 즉, ACE 저 해활성은 0.
- ECV304 세포를 10% FBS가 포함된 DMEM 배지로 2x13 Cells/6 well로 분주한 후, 24시간 동안 배양 시키고 FBS가 없는 DMEM 배지로 교환한 후 media control, 산삼 배양근 추출물(WE, ABE)을 1-24 h 간격으로 처리하였다. 배양액을 제거하고 PMSF(lmM)가 포함된 TNN lysis buffer(100 mM Tris pH 8.0, 250 mM NaCl, 0.5% NP- 40)를 이용하여 세포를 용해시키고, BCA(PIERCE, USA) 빙-법 으로 단백질을 정량하여, 각 시료 별로 50 μg을 western blot에 사용하였다. 이 시료를 10% polyacrylamide SDS gel 전기영동 을 후, PVDF membrane(Millipore, USA)으로 gel을 transfer 하고, 1:1, 00(배로 희석한 mouse polyclonal anti-eNOS를 결합 시키고 1:5,000배로 희석한 anti-mouse IgG HRP conjugate (Invitrogen, USA)로 2차 항체를 결합시킨 후, WEST-ZOLR Plus Western Blot Detection System(iNtRon biotech.
- 선천성 고혈압 흰쥐(SHR)에서 혈압 강하 효과. 혈압은 간접 법 (tail culf method)을 사용하여 선천성 고혈압쥐 (spontaneously hypertensive rat, SHR)의 꼬리 동맥에서 수축기 혈압(systolic blood pressure) 을 즉정하였다. Tail cufE와 pulse transducer (MLT1050, AD instruments, USA)를 꼬리에 위치시키고, pulse transducer는 physiograph recordei에 연결하여 혈압을 측정하였다.
성능/효과
- 28)유리된 NO에 의하여 평활근 세포 내의 guanylate cyclase(GC)가 활성화되고 힝mlosine 3', 5' cyclic-monophosphate(cGMP)> 증가시킴으로써 내피 비의존적 인 혈관이완을 야기한다고 알려져 있다.28) ABE 처리에 의해 ECV304 세포에서 NO 발생이 증가하지만 eNOS의 발현변화가없었고, 내피세포가 없는 상태에서도 혈관이완 효과가 탁월한 것으로 보아 내피 비의존적인 혈관 이완제의 일종인 SNP와 유사한 기작에 의해 ABE가 혈관이완 효능을 나타내는 것으로 사 료된다.
- 이러한 결과는 홍삼 사포닌이 정상 흰쥐 혈관 내피세포에서 NO 유리에 의해 혈압을 떨어뜨리는 결과와 일치한다.7) 추출방법에 따라 WE와 ABE의 NO 유리 효과가 다르긴 하나 산삼 배양근에서도 홍삼과 유사한 혈압저하 작용이 있을 것으로 사료된다.
- 1 mg/mZe 때 9L3%의 높은 이완율을 보였다. 그리고 혈관내 피세포가 제거된 혈관에서는 내피세포가 존재할 때보다는 약간 감소하긴 하였으나, WE는 22.4%, ABE는 76.5%의 이완율을 보였다(Fig 4). NO의 유리는 혈관 이완에 중요한 역할을 하는데' 혈관 이완제의 일종인 Sodium nitroprusside(SNP)는 혈관 평활근에서 외인성 NO 제공 물질이거나 관련 물질을 유리시 키는 것으로 알려져 있다.
- 1과 같다. 산삼 배양근 추출물을 처리하지 않은 세포에서는 극히 미량의 N0(2|iM)가 발생하였고, 산삼 배 양근 추출물을 처리한 세포에서는, 추출 방법과 상관없이 많은 양의 NO 생성을 보였는데, 추출물의 농도에 따라 NO 생성에 있어 큰 차이를 보였다. ME를 24시간 처리한 경우에는, 농도 50 gg/mZ 처리시 26±2.
- SD rats(ll~13 주령) 혈관을 적출하여 내피세포가 있는 것과 없는 것으로 나눈 후 혈관을 전 수축시켰다. 수축이 된 혈관에 WE 2.5 mg/mZ, ABE 0.1 mg/m/을 각각 처리한 결과, 혈관내피세포가 존재하는 혈관에서의 혈관이완율은 WE는 2.5 mg/ml일 때 44.8%, ABE는 0.1 mg/mZe 때 9L3%의 높은 이완율을 보였다. 그리고 혈관내 피세포가 제거된 혈관에서는 내피세포가 존재할 때보다는 약간 감소하긴 하였으나, WE는 22.
- 26)인삼 추출물에서 이미 ACE 저해 효과가 보고된 바 있어?)산삼 배양근 추출물에서의 ACE 저해 효과를 확인 하고자 rabbit lung acetone powder0!] 산삼 추출물을 100μg씩 처리하였고, 양성 대조군으로 captopril을 50 gg 되도록 처리하였다. 양성 대조군인 captopril의 58%에 비해 100 gg ABE 처리 시에 약 6% 정도의 ACE 억제 효과를 보였다(Fig. 3). 이러한 결과는 100 μg 인삼 추출물 처리 시에 ACE 억제 효과가 거의 없다는 Lee의 보고27)와 유사한 것이며, 산삼 배양근 추출물의 경우 저농도 처리 시에 이미 다량의 NO사 발생하여 혈관이완 효과를 나타내므로, ACE 억제에 의한 혈압감소 효과는 미미할 것으로 사료된다.
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