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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 인삼을 대체할 소재로 주목받는 산삼 배양근의 부가가치를 향상시키는 한편, 기능성을 높이기 위한 연구의 일환으로 산삼 배양근 분말 현탁액에 유산균을 배양하여 발효소재를 만들고자 하였다. 이를 위하여 일차적으로 소재 기능성 증진에 적합한 균주를 선발하기 위하여 균주별 산삼 배양근 발효에 의한 알콜 분해 효소 활성화 및 면역 세포 활성화에 미치는 영향을 관찰하였다.
- 그러므로, 알콜 대사와 관련된 효소 활성을 유도하는 소재를 개발할 수 있다면 alcohol 섭취로 인해 나타나는 부작용을 줄일 수 있을 것이다. 본 연구에서는 유산균 발효를 이용하여 산삼 배양근에 ADH 및 ALDH 같은 알콜 대사 효소의 작용을 활성화하는 기능성을 증진시킬 수 있는가에 대한 연구를 실시하였다.
제안 방법
- 33 M 2-mercaptoethanol 100 µL, 1 unit ALDH/mL 100 µL 분주 후, 발효하지 않은 산삼 배양근 추출물 대조구와 산삼 배양근 발효 추출물 시료(1,000, 500, 250, 100 µg/mL)를 100 µL 분주하였다. 37℃, 340 nm에서 0분, 10분 간격으로 흡광도를 측정하여 상대적인 ALDH 활성(%)을 구하였다.
- 5 unit AD /mL 100 µL 분주 후, 발효하지 않은 산삼 배양근 추출물 대조구와 산삼 배양근 발효 추출물 시료(1,000, 500, 250, 100 µg/mL)를 100 µL 분주하였다. 37℃를 유지하며 ELISA Reader(Tecan, Switzerland)기기를 사용하여 340 nm에서 0, 10분 간격으로 흡광도를 측정하여 상대적인 ADH 활성(%)을 구하였다.
- 7 세포에 의해 배지로 분비되는 NO의 양은 griess reaction을 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 Raw 264.7 세포를 분주한 후 24시간 동안 배양하여 산삼 배양근 발효물 추출액을 100 ppm 처리한 후 37℃에서 다시 24시간 동안 배양하여 배지내 NO2- 생성량을 측정하였다.
- 앞의 실험을 통해 만들어진 산삼 배양근 분말 현탁액 발효물로부터 추출물(이하 발효 추출물)을 만들어 기능성 평가에 사용하였다. In vitro상의 기능성 평가 실험 대조구는 균주를 접종하지 않은 산삼 배양근 추출물, 공시험은 시료대신 증류수를 첨가하여 실험하였다.
- NaNO2(0~200 µL/mL) standard curved의 흡광도에 준하여 NO의 생성능을 측정하였다.
- CFU/mL의 Lac. casei KFRI 692 균 배양액을 1% 농도로 접종하여 발효 0, 4, 24, 48, 72시간의 pH와 생균수를 측정하였다. 생균수는 십진 희석법을 사용하여 5% horse blood가 함유된 BL agar 배지에 시료액을 도말하여 48시간 37℃ incubator에 배양 후 자라난 colony의 수를 계수하였다.
- 효능 평가로부터 기능성을 최대화하는 발효 균주로 선정된 Lac. casei KFRI 692 균주를 5% 산삼 배양근 분말 현탁액 배지에 접종하여 시간대별 pH 및 생균수 변화를 측정하였다.
- Lac. casei KFRI 692를 5% 산삼 배양근 분말 현탁액 배지에 접종하여 생육 특성을 관찰하였다. 접종 후 배양 0, 4, 24, 48, 72시간의 pH는 배양 24시간에 3.
- 여기에서 선별된 발효 균주인 Lac. casei KFRI 692를 산삼 배양근 분말 현탁액 배지에서 접종하여 생육 특성을 확인하였다.
- 동일한 실험에 대하여 산삼 배양근 추출물과 유산균 발효 추출물의 Raw 264.7 세포에 대한 독성을 확인하기 위해 MTT assay를 측정하였다.
- 의 균주는 산삼 배양근 분말 현탁액 발효 과정에서 생균 분포를 고르게 유도하기 위해 진탕 배양을 하였다. 또한 진탕 배양의 효과를 높이기위해서는 발효 기질에 유동성이 확보되어야하는 한편, 발효 공정의 경제성을 높이기위해서는 고형분 함량이 높을수록 유리하므로 먼저 사전 실험을 통해 분말 현탁액 배지의 적정 농도를 5% w/v로 정하였다.
- Park 등(2006)은 7종의 선별된 Lactobacillus sp.를 1%와 5% 인삼 또는 홍삼 분말 배지에 접종하여 접종 24시간과 48시간 후 발효물의 pH와 생균수를 비교 실험하였다. 이 연구 결과에 따르면 첨가하는 균주 strain에 따라 pH가 저하되는 정도는 차이가 있었으나, 5% 백삼 분말 배지에선 유산균 접종 24시간 후 pH가 3.
- 0%)로 하여 500 mL씩 만들어 121℃ 15분간 멸균하였다. 멸균 후 방냉한 시료에 MRS에서 15시간 배양한 균액을 1% 접종하였다. 이것을 37℃ shaking incubator에서 120 rpm으로 진탕해주며 24시간 발효시킨 후 pH 및 생균수를 측정하였고, 이것을 효능 평가용 시료로 활용하였다.
- 발효 기질로 사용하기 위하여 산삼 배양근은 −70℃에서 동결한 후 동결건조(Bondiro, ILSHIN, Korea)하였다.
- 산삼 배양근 분말:증류수의 비율을 1:19 (5.0%)로 하여 500 mL씩 만들어 121℃ 15분간 멸균하였다. 멸균 후 방냉한 시료에 MRS에서 15시간 배양한 균액을 1% 접종하였다.
- casei KFRI 692 균 배양액을 1% 농도로 접종하여 발효 0, 4, 24, 48, 72시간의 pH와 생균수를 측정하였다. 생균수는 십진 희석법을 사용하여 5% horse blood가 함유된 BL agar 배지에 시료액을 도말하여 48시간 37℃ incubator에 배양 후 자라난 colony의 수를 계수하였다.
- 시험관에 증류수 1.4 mL, 1 M tris-HCl(pH 8.8) 750 µL, 2.5 mM NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide)/0.05 M trizma-HCl 300 µL, 95% ethanol 300 µL, 7.5 unit AD /mL 100 µL 분주 후, 발효하지 않은 산삼 배양근 추출물 대조구와 산삼 배양근 발효 추출물 시료(1,000, 500, 250, 100 µg/mL)를 100 µL 분주하였다.
- 시험관에 증류수 2.1 mL, 1 M trizma-HCl(pH 8.0) 300 µL, 2.5 mM NAD(Nicotinamide Adenine Dinucleotide) 100 µL, 1 M acetaldehyde 100 µL, 3 M KCL/1 M trizma-HCl 100 µL, 0.33 M 2-mercaptoethanol 100 µL, 1 unit ALDH/mL 100 µL 분주 후, 발효하지 않은 산삼 배양근 추출물 대조구와 산삼 배양근 발효 추출물 시료(1,000, 500, 250, 100 µg/mL)를 100 µL 분주하였다.
- 앞의 실험을 통해 만들어진 산삼 배양근 분말 현탁액 발효물로부터 추출물(이하 발효 추출물)을 만들어 기능성 평가에 사용하였다. In vitro상의 기능성 평가 실험 대조구는 균주를 접종하지 않은 산삼 배양근 추출물, 공시험은 시료대신 증류수를 첨가하여 실험하였다.
- 멸균 후 방냉한 시료에 MRS에서 15시간 배양한 균액을 1% 접종하였다. 이것을 37℃ shaking incubator에서 120 rpm으로 진탕해주며 24시간 발효시킨 후 pH 및 생균수를 측정하였고, 이것을 효능 평가용 시료로 활용하였다.
- 따라서 본 연구에서는 인삼을 대체할 소재로 주목받는 산삼 배양근의 부가가치를 향상시키는 한편, 기능성을 높이기 위한 연구의 일환으로 산삼 배양근 분말 현탁액에 유산균을 배양하여 발효소재를 만들고자 하였다. 이를 위하여 일차적으로 소재 기능성 증진에 적합한 균주를 선발하기 위하여 균주별 산삼 배양근 발효에 의한 알콜 분해 효소 활성화 및 면역 세포 활성화에 미치는 영향을 관찰하였다. 여기에서 선별된 발효 균주인 Lac.
대상 데이터
- 본 연구에서는 산삼 배양근의 기능성-알콜 분해 효소 활성 및 면역 세포 활성- 증진을 위한 최적 발효 균주를 검색하여 Lac. casei KFRI 692를 선발하였다. 이 균주를 이용하여 발효된 산삼 배양근 발효물은 발효 전 시료에 비해 ADH 효소 활성활성을 5.
- 발효 기질로 사용하기 위하여 산삼 배양근은 −70℃에서 동결한 후 동결건조(Bondiro, ILSHIN, Korea)하였다. 건조시료를 가정용 분쇄기(HMF-3000S, 한일, Korea)로 1차 분쇄하였고, 미분쇄기(CyclotecTM 1093, Foss Tecator, Sweden)에서 분말의 입경이 100 mesh 이하가 되도록 2차 분쇄하여 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 유산균은 한국식품연구원(KFRI, Korea)에서 보관하고 있는 8종의 Lactobacillus sp. 균주와 생명자원센터(KCTC, Korea)로부터 분양받은 2종의 균주를 MRS broth(Difco, USA)에 접종하여 37℃에서 15시간 동안 배양하여 발효 균주로 사용하였다[Table 1].
- 면역 기능 활성화를 관찰하기위해 본 연구에 사용된 Raw 264.7 세포는 한국 세포주 은행(KCLB, Seoul, Korea)에서 구입하였으며, 10% FBS, 1% antibiotic-antimycotic을 포함한 dulbecco’s modified eagle’s medium(DMEM)을 배양액으로 사용하여 37℃의 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 산삼 배양근은 영천지역에서 제공되었다.
이론/모형
- Nitrite oxide(NO) 측정은 Griess assay법(Kiemer & Vollmar, 1997)에 따라 측정하였다.
- Raw 264.7 세포에 대한 시료의 독성을 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay로 측정하였다. MTT 시약은 thiazolyl blue tetrazolium bromide를 최종 농도 5 mg/mL가 되도록 PBS에 녹인 후 빛을 차단하고 4℃에 보관하였다.
- Raw 264.7 세포에 의해 배지로 분비되는 NO의 양은 griess reaction을 이용하여 측정하였다. 96 well plate에 Raw 264.
성능/효과
- 0% 산삼 배양근 분말 현탁액 배지 100 mL에 접종, 24시간 배양하여 얻은 발효물의 pH와 생균수는 [Table 2]와 같다. 10종의 균주에 대한 발효물의 pH는 초기 pH 5.20에서 3.70~4.41까지 내려간 것을 확인하였고, 이를 통해 정상적인 유산균 증식이 이뤄졌음을 알 수 있었다. 각각의 균주 생육 특성상 Lac.
- bulgaricus KFRI 345 발효물의 생균수가 1.9×109로 확인되어 인삼 배지 발효 연구에서와 유사한 정도의 최대 생균수를 확인할 수 있었다.
- casei KFRI 692 균주로 발효한 발효 추출물의 경우, 100 µg/mL 농도에서 blank의 97.2%, 500 µg/mL 농도에서 84.3%의 효소활성을 보여 발효 전 시료와 비교하여 각각 5.4배와 4.7배로 ADH 효소 활성이 크게 증가한 것을 확인 할 수 있었다 [Figure 1].
- gasseri KFRI 658와 Lac. casei KFRI 692 균주로 발효한 발효 추출물의 활성이 가장 높아 blank 대비 각각 122.0%와 113.4%의 효소활성 유도 효과가 있었으며 이는 대조구에 비해 약 1.6배와 1.5배 활성이 증가한 수치이다 [Figure 2].
- 본 연구 역시 Lac. casei KFRI 692 균주를 이용한 5% 산삼 배양근 분말 현탁액을 발효했을 때, 생균수가 접종 후 발효 24시간에서 최대 수치를 보였으며, 48시간에는 24시간대에 확인된 생균수의 21.6% 수준만이 확인되어 생균수 최대화를 위한 발효시간은 24시간이 적합한 것으로 사료되었다.
- 앞선 실험에서 Lac. casei KFRI 692는 발효 전 산삼 배양근에 비해 알콜 분해 효소인 ADH 및 ALDH 활성을 증가시켰고, Raw 264.7 cells로부터 면역 세포 활성화 지표인 NO의 생성을 유도하는 발효물을 만들 수 있는 균주임을 확인하였다. 효능 평가로부터 기능성을 최대화하는 발효 균주로 선정된 Lac.
- 특히, Lac. casei KFRI 692로 발효한 발효 추출물은 ADH와 ALDH 효소활성 유도에 모두 긍정적인 효과가 있는 것으로 사료되었다.
- 발효 추출물 농도 100 µg/mL에서 Lac. casei KFRI 693 균주 발효 추출물의 활성이 가장 높아 blank 대비 120.4%, 발효 전 시료에 비해서는 1.5배 활성이 증가하였다. 발효 추출물 농도 500 µg/mL에서는 Lac.
- rhamnosus GG KCTC 5033(GG 유산균)과 같은 프로바이오틱스들이 발효물 중에서 그 생균수가 각각 4.1×107와 5.7×109로 다른 8종의 유산균에 비해 낮게 나타난 것은 특이할 만 하였다.
- 또한 생균수는 배양 24시간대에서 최대 5.1×108 CFU/mL까지 증가하였으며, 배양 48, 72시간에는 생균수가 점차 감소하였다.
- 41로 가장 높게 나타났다. 또한, 생균수를 관찰한 결과 균주별 발효물에서 107~109의 생균수를 확인하였다. 접종된 균수가 조절되지 않은 상태에서 15시간 MRS에서 배양한 유산균액의 비율을 분말 현탁액 대비 1% v/w로 하여 접종하였으므로 절대적인 균수 증가 정도는 확인할 수 없었다.
- 또한, 알콜의 유해한 중간대사산물인 acetaldehyde를 대사 시키는 ALDH 활성은 발효 전 시료의 경우, 증류수를 첨가한 blank에서의 효소활성 대비 100 µg/mL 농도에선 79.1%, 500 µg/mL 농도에선 76.4%의 활성을 보였다.
- 먼저 ADH 활성은 발효 전 시료인 대조구로 효소 활성을 유도하였을 때, 증류수를 첨가한 blank 보다 100 µg/mL 농도에선 18.1%, 500 µg/mL 농도에선 17.9%로 나타났다.
- 발효 시간대에 따른 pH 변화로는 균주 접종 시점에선 pH 5.09였으나 24시간 발효 후에는 크게 감소하여 pH 3.72까지 감소하였으며 이후의 pH는 관찰 시간인 72시간동안 유지되었다.
- 생균수를 관찰한 결과, 균주 접종 시점 생균수는 5.5×107 CFU/mL였으나, 4시간 후 이보다 5.1배 증가한 2.8×108 CFU/mL, 24시간 후에는 9.3배인 5.1×107 CFU/mL까지 증가하였다.
- 시료 대신 증류수를 첨가한 blank를 대조구로 하여 생존률을 100%로 환산하였을 때 대조구 및 발효 추출물을 100 ppm 처리한 경우의 세포 생존율은 대조구 110.9%, 발효 추출물 처리구는 120.6~74.8%로 나타났다. 그러나, 대조구에 대한 발효 추출물 처리구의 세포 생존율에는 유의적인 차이가 없었다 [Figure 4].
- casei KFRI 692를 선발하였다. 이 균주를 이용하여 발효된 산삼 배양근 발효물은 발효 전 시료에 비해 ADH 효소 활성활성을 5.4배, ALDH 효소 활성을 1.5배 증가시켰다. 또한 macrophage에서 생산하는 NO 농도는 발효 전 시료에 비해 Lac.
- [Figure 3]의 결과에서 알 수 있듯이 같은 Lactobacillus sp.임에도 산삼 배양근을 발효한 균주의 종류에 따라 NO의 생산량을 유도하는 것에는 차이가 있음을 확인할 수 있었다. 대조구인 발효 전 산삼 배양근을 처리했을 때 Raw 264.
- 마지막으로 발효 미생물의 작용으로 기질 고유의 성분이 대사되면서 생산된 대사산물에 의해 기능성이 발현되었을 수도 있는 등 미생물과 소재 조합에 의해 개발 가능한 기능성은 다양하다고 할 것이다. 특히 인삼의 경우, 인삼 발효의 목적이 Akao 등(1998)의 연구 를 근거로 ginsenoside 대사에 촛점을 맞춰 진행해왔다 그러나, 본 연구의 결과, 발효 전후의 산삼 배양근 시료에 의한 기능성 평가 결과엔 차이가 있었으나, 총사포닌 함량이나 ginsenosides profile에는 변화가 없는 것을 확인하였다(data not shown). 이는 ginsenosides 대사와는 무관하면서도 산삼 배양근의 기능성을 향상시킨 소재 개발이 가능하다는 것을 의미하는 만큼, 관심을 두고 지속적으로 연구할 수 있는 분야로 생각된다.
후속연구
- 이러한 대사과정에서 ethanol이나 그 대사물질이 축적된다면, 소화불량, 구토, 두통 등의 다양한 증상, 이른바 숙취를 발생시킨다. 그러므로, 알콜 대사와 관련된 효소 활성을 유도하는 소재를 개발할 수 있다면 alcohol 섭취로 인해 나타나는 부작용을 줄일 수 있을 것이다. 본 연구에서는 유산균 발효를 이용하여 산삼 배양근에 ADH 및 ALDH 같은 알콜 대사 효소의 작용을 활성화하는 기능성을 증진시킬 수 있는가에 대한 연구를 실시하였다.
- 이는 ginsenosides 대사와는 무관하면서도 산삼 배양근의 기능성을 향상시킨 소재 개발이 가능하다는 것을 의미하는 만큼, 관심을 두고 지속적으로 연구할 수 있는 분야로 생각된다. 기능성 발효소재의 개발은 천연 자원은 부족하나 인삼을 비롯한 약선 소재들이 풍부하며, 발효식품이 발달하여 이용할 수 있는 미생물 보유 자원이 많은 우리나라에 적합한 소재 개발 방식이 될 것이다.
- 또, 둘째는 발효 균주가 기질을 영양원으로 사용하면서 생산한 exopolysacchride 등의 균주 유래 분비물 조성이나 생산량이 변화하면서 나타났을 수 있다. 마지막으로 발효 미생물의 작용으로 기질 고유의 성분이 대사되면서 생산된 대사산물에 의해 기능성이 발현되었을 수도 있는 등 미생물과 소재 조합에 의해 개발 가능한 기능성은 다양하다고 할 것이다. 특히 인삼의 경우, 인삼 발효의 목적이 Akao 등(1998)의 연구 를 근거로 ginsenoside 대사에 촛점을 맞춰 진행해왔다 그러나, 본 연구의 결과, 발효 전후의 산삼 배양근 시료에 의한 기능성 평가 결과엔 차이가 있었으나, 총사포닌 함량이나 ginsenosides profile에는 변화가 없는 것을 확인하였다(data not shown).
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