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문제 정의
- 곡물을 발효시키는데 사용한다. 따라서 누룩은 보통 여러 가지 균이 많이 섞여 있지만, 저자 등이 사용한 누룩은 자체적으로 분리, 선발한 Rhizopus oryzae KSD-815라는 단일 균종만을 밀에 접종한 것으로 쌀을 발효하여 약주를 만들기 위하여 개발한 것이다. 밀에 Rhizopus oryzae KSD-815를 접종한 누룩(이하 누룩, Rhizopus oryzae KSD.
- 본 연구에서는 누룩(Rhizopus oryzae KSD-815)으로부터 이차대사산물을 분리동정하여 그 화합물에 대한 여러가지 생리활성과 관련한 연구를 진행시킴으로써 누룩(Rhizopus oryzae KSD-815)의 기능성 식품 또는 의약품 개발 등과 같은 활용방안을 모색하고자 하였다. 그래서 누룩(Rhizopus oryzae KSD-815)으로부터 주줄, 분획 및 column chromatography를 실시하여 4 종의 지질화합물을 분리하였고, NMR 및 GC/MS 등을 통하여 구조를 결정하였다.
가설 설정
- The production of nitric oxide was assayed from culture medium of RAW264.7 cells simulated with LPS (1 ㎍/ml) and IFN-γ (10 U/ml) in the presence of compound 3. RAW264.7 cells were plated at a density of 2×105 cells/m/. Nitirite accumulation was measured by Griess reaction in cultxire medium.
제안 방법
- 16,17) LPS나 cytokine에 의해 발현된 inducible NOS(iNOS)는 많은 양의 NO를 calciuiml 비의존적으로 생성하여 염증반응, 종양 발생 등에 관여하는 것으로 보고 되었다.18) 염증 유발에 중요한 역할을 하는 NO생성에 대한 누룩 유래 지방산 화합물의 효과를 평가하였다. 생성된 NO는 Griess 시약을 이용하여 세포 배양으4 중에 존재하는 NO2-의 형태를 측정하였다.
- 생성된 NO의 양은 Griess reagent 방법으로 측정하였다.9) NO는 Griess 시약 [1% sulfanilamide, 0.1% naphylethylenediamine in 2.5% phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 세포 배양 상등액 100㎕와 Griess 시약 100 ㎕를 혼합하여 96-well plate에서 5분간 반응시키고 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 25 ㎛, USA) 이외의 모든 분석 조건은 GC 조건과 동일하였다. GC/MS로 분석한 각 peak의 최종 확인은 library (Wiley GC±MS Library) 분석을 바탕으로 확인하였다.
- 각각의 지방산을 10, 20, 30, 40, 50 gg/m/ 농도로 첨가하여 24시간 동안 배 양한 후, 5 mg/m/ MTT solution을 첨가하고 4시간 동안 반응시켰다. MTT 용액을 제거하고 100 ㎕ DMSO와 20㎕ Soren's 용액[0.1 M glycine, 0.1 M NaCl, pH 10.2)]를 첨가한 후, ELISA microplate reader를 이용하여 540mm에서 흡광도를 측정하였다. 각 세포의 시료 무첨가군을 100%로 하여 상대적인 세포 독성을 평가하였다.
- Thin layer chromatography(이하 TLC라고 함)는 Kieselgel 60 F254와 RP-18 F254S를 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약은 특급시약을 사용하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Inova AS 400(Varian, Califormia, USA)으로 측정하였고, GC는 GC-14B(Shimadzu, Tokyo, Japan)로, GC/MS는 JMS-700(JEOL, Tokyo, Japan)으로 측정하였으며, UV lamp는 Spectroline(Model ENF-240 C/F, Spectronics Corporation, New York, USA)을 사용하였다. 세포독성과 nitrite는 ELISA microplate reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA.
- n-Hexane 분획(TAHe, 130 g)에 대하여 silica gel column chromatography(c.c.) (n-Hexane:EtOAc= 10:1 → 7:1 → 5:1 → 3:1 → 1:1, Φ×20cm)를 실시하여 16개의 분획물(TAHel~ TAHe16)을 얻었다. 이 중에서 분획 TAHe2(5g)에 대하여 ODS c.
- 2)]를 첨가한 후, ELISA microplate reader를 이용하여 540mm에서 흡광도를 측정하였다. 각 세포의 시료 무첨가군을 100%로 하여 상대적인 세포 독성을 평가하였다.
- 8) 각 세포주를 2x104 cells/well로 맞추고, 96-well plate에 200 ㎕씩 첨가하여 24 시간동안 37℃에서 배양하여 세포를 부착하였다. 각각의 지방산을 10, 20, 30, 40, 50 gg/m/ 농도로 첨가하여 24시간 동안 배 양한 후, 5 mg/m/ MTT solution을 첨가하고 4시간 동안 반응시켰다. MTT 용액을 제거하고 100 ㎕ DMSO와 20㎕ Soren's 용액[0.
- MDA-MB-231의 전이능력과 estrogen receptor 발현의 차이가 있는 MCF-7 세포주에 대한 세포독성 결과, (1) 누룩 유래 지방산 화합물은 MCF-7에 대한 세포 독성 효과가 없었다(Data not shown). 간암 세포주인 SK-HEP-1에 대한 화합물 1(linolenic acid methyl ester)과 화합물 3(linoleic acid)은 50 μM 농도에서 각각 4ℓ%와 38%의 세포독성을 유도하였다(Fig. 1B) . 또한 같은 농도에서 화합물 1 (linolenic acid methyl ester)과 화합물 3(linoleic acid)은 인체 유래 melanoma 세포주인 A2058에서 55~80%의 세포 독성 효과를 관찰하였다(Data not shown).
- 모색하고자 하였다. 그래서 누룩(Rhizopus oryzae KSD-815)으로부터 주줄, 분획 및 column chromatography를 실시하여 4 종의 지질화합물을 분리하였고, NMR 및 GC/MS 등을 통하여 구조를 결정하였다. 또한 각 화합물에 대하여 인체암 세포에 대한 세포독성을 측정하였고, RAW264.
- 누룩 건조한 것을 MeOH용액으로 추출하였고, 추출물을 n-hexane, EtOAc, n-BuOH 및 H2O로 분배주줄하여 분획하였다. 얻어진 4개 분획 (TAHe, 1AE, TAB, TAW)에 대하여 세포 독성 및 항염증 활성을 검색한 결과 TAHe 분획에서 유의한 활성(Data not shown)0] 확인되었다.
- 얻어진 4개 분획 (TAHe, 1AE, TAB, TAW)에 대하여 세포 독성 및 항염증 활성을 검색한 결과 TAHe 분획에서 유의한 활성(Data not shown)0] 확인되었다. 따라서 TAHe 분획에 대하여 silica gel과 ODS column chromatography를 반복하여 4종의 지질 화합물을 분리하였다.
- 그래서 누룩(Rhizopus oryzae KSD-815)으로부터 주줄, 분획 및 column chromatography를 실시하여 4 종의 지질화합물을 분리하였고, NMR 및 GC/MS 등을 통하여 구조를 결정하였다. 또한 각 화합물에 대하여 인체암 세포에 대한 세포독성을 측정하였고, RAW264.7 세포를 이용한 항염증활성을 측정하였다.
- 1B) . 또한 같은 농도에서 화합물 1 (linolenic acid methyl ester)과 화합물 3(linoleic acid)은 인체 유래 melanoma 세포주인 A2058에서 55~80%의 세포 독성 효과를 관찰하였다(Data not shown).
- 시료 TAHe2^(l, 1 mg/1 ml, CHC13), TAHe2-ll(2, 1 mg/1 ㎖, CHCI3), TAHe4-6(3, 1 mg/1 ml, CHCI3) 및 TAHe4-10(4, 1 mg/1 ml, CHCL)로부터 각 3 ㎕를 취하여, FID가 설치된 GC(GC-14B, Shimadzu, Tokyo, Japan)의 주입구에 넣고, 탈착시켜 분석하였다. 분석용 컬럼은 DB-5(30 m×0.32 mm ID×0.25 μm, J & W Folsom, California, USA)를 사용하였으며, GC의 injector 온도는 300℃, oven 온도는 처음 3분 동안 150℃로 유지하였고, 분당 승온 속도를 7℃ 로 하여 최종온도가 300℃가 되도록 한 후 5분간 300℃를 유지하도록 하였다. 분석한 화합물 1, 2, 3 및 4의 retention time(min)은 각각 10.
- 34 로 나타났다. 분석한 화합물을 동정하기 위하여, GC(Agilent technologies, California, USA)와 연결된 massspectrometer(JMS-700, JEOL, Tokyo, Japan)를 사용하였고, 분석용으로 사용한 컬럼 (HP-5, 30m×0.32mm IDx0.25 ㎛, USA) 이외의 모든 분석 조건은 GC 조건과 동일하였다. GC/MS로 분석한 각 peak의 최종 확인은 library (Wiley GC±MS Library) 분석을 바탕으로 확인하였다.
- 18) 염증 유발에 중요한 역할을 하는 NO생성에 대한 누룩 유래 지방산 화합물의 효과를 평가하였다. 생성된 NO는 Griess 시약을 이용하여 세포 배양으4 중에 존재하는 NO2-의 형태를 측정하였다. 그 결과, 화합물 3(linoleic acid)에서 농도의존적인 염증 저해 활성을 확인하였다 (Fig.
- 5% phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 세포 배양 상등액 100㎕와 Griess 시약 100 ㎕를 혼합하여 96-well plate에서 5분간 반응시키고 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양 상등액의 NO를 정량하기 위하여 sodium nitrite를 사용하여 표준곡선을 작성하였다.
- 세포 배양 상등액 100㎕와 Griess 시약 100 ㎕를 혼합하여 96-well plate에서 5분간 반응시키고 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양 상등액의 NO를 정량하기 위하여 sodium nitrite를 사용하여 표준곡선을 작성하였다.
- 지방산의 GC/MS 분석. 시료 TAHe2^(l, 1 mg/1 ml, CHC13), TAHe2-ll(2, 1 mg/1 ㎖, CHCI3), TAHe4-6(3, 1 mg/1 ml, CHCI3) 및 TAHe4-10(4, 1 mg/1 ml, CHCL)로부터 각 3 ㎕를 취하여, FID가 설치된 GC(GC-14B, Shimadzu, Tokyo, Japan)의 주입구에 넣고, 탈착시켜 분석하였다. 분석용 컬럼은 DB-5(30 m×0.
- 누룩(Rhizopus oryzae KSD-815) 8kg(건물 중)에 80% MeOH 용액 (45ℓ×3)을 가하여 실온에서 하룻밤 추출한 후 여과지로 여과하였다. 얻어진 여액을 45℃에서 감압농축하여 농축물 1.2 kg을 얻었고, 이 농축물을 물(4ℓ)과 ethyl acetate(EtOAc, 4ℓ×3)로 분배 추출하였으며, EtOAc층은 감압농축한 후 n-hexane(4ℓ)과 80% MeOH 용액(4ℓ)으로 다시 분배 추출하였다. 위의 물층은 n-butanol(n-BuOH, 4ℓ×3)로 분배 추출하였으며, 각 층을 감압농축하여 n-hexane 분획(TAHe, 135 g), EtOAc 분획(TAE, 92g), n-BuOH 분획(TAB, 114g) 및 물 분획 (TAW, 855g)을 얻었다.
- 2 kg을 얻었고, 이 농축물을 물(4ℓ)과 ethyl acetate(EtOAc, 4ℓ×3)로 분배 추출하였으며, EtOAc층은 감압농축한 후 n-hexane(4ℓ)과 80% MeOH 용액(4ℓ)으로 다시 분배 추출하였다. 위의 물층은 n-butanol(n-BuOH, 4ℓ×3)로 분배 추출하였으며, 각 층을 감압농축하여 n-hexane 분획(TAHe, 135 g), EtOAc 분획(TAE, 92g), n-BuOH 분획(TAB, 114g) 및 물 분획 (TAW, 855g)을 얻었다.
- 2). 특히, 5 μm/ml의 농도에서는 세포독성 효과도 보이지 않으면서 NO 생성 억제 활성을 확인하였다. 하지만 10 μg/ml의 농도는 RAW264.
- 누룩 유래 지방산 화합물의 암세포에 대한 세포독성을 규명하기 위해 인체 유래 유방암(MDA-MR231)과 간암(SK-HEP-1)의 세포 생존율을 MTT 방법을 이용하여 평가하였다. 화합물 l(linolenic acid methyl ester)과 화합물 3 (linoleic acid)에서 두 가지 암 세포주에 농도의존적인 세포독성효과를 확인하였다(Fig. 1). MDA-MB-231 세포에 대한 화합물 1 (linolenic acid methyl ester)과 화합물 3(linoleic acid)은 50 μM 농도에서 각각 49%와 43%의 세포독성을 나타냈다(Fig.
대상 데이터
- 따라서 이 화합물은 세 쌍의 이중결합을 갖고 있는 aliphatic chain 형태의 화합물로 판단되었다. 13C-NMR(100 MHz, CDC13) spectrum에서 19개의 탄소 signal이 관측되었다. δc 174.
- 6 Hz)에서 terminal methyl proton signal이 관측 되어 지방산 화합물로 추측되었다. 13C-NMR(100 MHz, CDCL) spectrum에서 17개의 탄소 signal이 관측되었고, δc 170.5에서 ester-carbon signal과 δc 51.5에서 methoxy signal이 관측되었다. δc 34.
- 시약 및 기기. Column chromatography용 silica gele Kiesel gel 60(Merck, Darmstadt, Germany)을 octadecyl silica(ODS) gele LiChroprep RP-18(Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였다. Thin layer chromatography(이하 TLC라고 함)는 Kieselgel 60 F254와 RP-18 F254S를 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약은 특급시약을 사용하였다.
- Lipopolysaccharide(LPS), aminoguanidine(AG), interferon-γ (IFN-γ), MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide), sulfanilamide, naphylethylenediamine, sodium nitrite(NaNO2)를 포함한 모든 시약은 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA) 제품을 구입하였고, 세포주 배양을 위한 RPIM1640 medium, fetal bovine serum(FBS) 및 penicillin-streptomycin은 Gibco-BRL(Grand Island, NY, USA)에서 구입하여 사용하였다.
- Column chromatography용 silica gele Kiesel gel 60(Merck, Darmstadt, Germany)을 octadecyl silica(ODS) gele LiChroprep RP-18(Merck, Darmstadt, Germany)을 사용하였다. Thin layer chromatography(이하 TLC라고 함)는 Kieselgel 60 F254와 RP-18 F254S를 사용하였고, 실험에 이용한 모든 시약은 특급시약을 사용하였다. NMR 스펙트럼은 Varian Inova AS 400(Varian, Califormia, USA)으로 측정하였고, GC는 GC-14B(Shimadzu, Tokyo, Japan)로, GC/MS는 JMS-700(JEOL, Tokyo, Japan)으로 측정하였으며, UV lamp는 Spectroline(Model ENF-240 C/F, Spectronics Corporation, New York, USA)을 사용하였다.
- 활성물질의 분리. 누룩(Rhizopus oryzae KSD-815) 8kg(건물 중)에 80% MeOH 용액 (45ℓ×3)을 가하여 실온에서 하룻밤 추출한 후 여과지로 여과하였다. 얻어진 여액을 45℃에서 감압농축하여 농축물 1.
- 7 세포를 사용하였다. 모든 세포주 배양에는 RPIM1640 medium을 사용하였으며 10% FBS와 100 unit/㎖의 penicillin, 100 units/㎖의 streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기 내에서 적응시켜 배양하였다.
- 누룩 Rhizopus oryzae KSD-815. 본 실험에서 사용한 누룩은 (주)국순당에서 제공한 것으로, 신우창 박사가[(주)국순당 연구소] 동정하였으며,7)표본시료(KHU-060425)는 경희대학교 천연물화학실험실에 보관 되어 있다.
- 지방산의 세포독성을 측정하기 위한 암세포주는 모두 인체 기원의 암세포주들로, 유방암세포주인 MDA-MB-231, 간암세포주인 SK-HEP1 을 사용하였다. 항염증 활성을 평가하기 위하여 대식세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW264.
- 지방산의 세포독성을 측정하기 위한 암세포주는 모두 인체 기원의 암세포주들로, 유방암세포주인 MDA-MB-231, 간암세포주인 SK-HEP1 을 사용하였다. 항염증 활성을 평가하기 위하여 대식세포 계열(murine macrophage cell line)인 RAW264.7 세포를 사용하였다. 모든 세포주 배양에는 RPIM1640 medium을 사용하였으며 10% FBS와 100 unit/㎖의 penicillin, 100 units/㎖의 streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기 내에서 적응시켜 배양하였다.
이론/모형
- 세포독성 효과. 누룩 유래 지방산 화합물의 암세포에 대한 세포독성을 규명하기 위해 인체 유래 유방암(MDA-MR231)과 간암(SK-HEP-1)의 세포 생존율을 MTT 방법을 이용하여 평가하였다. 화합물 l(linolenic acid methyl ester)과 화합물 3 (linoleic acid)에서 두 가지 암 세포주에 농도의존적인 세포독성효과를 확인하였다(Fig.
- 각 지방산과 LPS(1 μg/㎖)과 IFN-γ(10 U/ml)을 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess reagent 방법으로 측정하였다.9) NO는 Griess 시약 [1% sulfanilamide, 0.
- 세포독성 측정. 지방산의 세포독성 효과를 측정히기 위하여 MTT assay를 수행하였다.8) 각 세포주를 2x104 cells/well로 맞추고, 96-well plate에 200 ㎕씩 첨가하여 24 시간동안 37℃에서 배양하여 세포를 부착하였다.
성능/효과
- 발색되었다. 1H-NMR(400 MHz, CDCL) spectrum에서 SH 5.21(6H, m)의 signa로부터 6개의 olefine methine proton 이 존재함을 확인하였고, δH 3.64(3H, s)의 signal로부터 methoxy의 존재를 확인 하였다. δH 2.
- IA) . MDA-MB-231의 전이능력과 estrogen receptor 발현의 차이가 있는 MCF-7 세포주에 대한 세포독성 결과, (1) 누룩 유래 지방산 화합물은 MCF-7에 대한 세포 독성 효과가 없었다(Data not shown). 간암 세포주인 SK-HEP-1에 대한 화합물 1(linolenic acid methyl ester)과 화합물 3(linoleic acid)은 50 μM 농도에서 각각 4ℓ%와 38%의 세포독성을 유도하였다(Fig.
- 발색되었다. iH-NMR(400 MHz, CDC13) spectrum에서 δH 5.40(4H, m)의 signal로부터 olefine methine proton 4개가 존재함을 확인하였고, δH 2.63(2H, dd, J =6.6, 6.4 Hz), δH 2.30(2H, t, J=8.4 Hz), δH 2.18(2H, m) 및 SH 2.14(2H, dt, J= 6.6, 6.7 Hz)의 signal로부터 allyl 위치의 4개의 methylene 이관즉 되었으며, δH 1.52~ 1.27 사이에서 다수의 methylene proton signal과 δH 0.90(3H, t, J =7.8 Hz)에서 triplet의 말단 methyl proton signal이 관측되었다. 따라서 이 화합물은 두 쌍의 이중결합을 갖고 있는 aliphatic chain 형태의 화합물로 판단되었다.
- 생성된 NO는 Griess 시약을 이용하여 세포 배양으4 중에 존재하는 NO2-의 형태를 측정하였다. 그 결과, 화합물 3(linoleic acid)에서 농도의존적인 염증 저해 활성을 확인하였다 (Fig. 2). 특히, 5 μm/ml의 농도에서는 세포독성 효과도 보이지 않으면서 NO 생성 억제 활성을 확인하였다.
- 1 에서 terminal methyl carbon signal이 확인되었다. 따라서 정확한 구조 동정을 위하여 GC/MS를 이용하여 분석한 결과 9분 72초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectrum에서 M+ 이온 peak가 m/z 270에서 관측되어 270으로 결정 하였고, 이것을 Wiley library를 사용하여 비교해본 결과 palmitic acid methyl ester와 일치 하였다.
- 따라서 화합물 1은 octadecatrienoic acid methyl ester로 구조를 규명하였다. 또한 GC/MS를 이용하여 분석한 결과 10분 84초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectrum에서 M+ 이온 peak가 m/z 292에서 관측되었다. 이 결과를 토대로 Wiley library를 사용하여 검색한 결과 화합물 1을 linolenic acid methyl ester로 동정하였다.
- 1에서 terminal methyl carbon signal이 확인되었다. 또한 GC/MS를 이용하여 분석한 결과 11분 49초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectrum에서 M+ 이온 peak가 m/z 280에서 관측되었다. 이 결과를 토대로 Wiley library를 사용하여 검색한 결과 화합물 3을 linoleic acid로 동정하였다.
- 분획하였다. 얻어진 4개 분획 (TAHe, 1AE, TAB, TAW)에 대하여 세포 독성 및 항염증 활성을 검색한 결과 TAHe 분획에서 유의한 활성(Data not shown)0] 확인되었다. 따라서 TAHe 분획에 대하여 silica gel과 ODS column chromatography를 반복하여 4종의 지질 화합물을 분리하였다.
- 또한 GC/MS를 이용하여 분석한 결과 10분 84초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectrum에서 M+ 이온 peak가 m/z 292에서 관측되었다. 이 결과를 토대로 Wiley library를 사용하여 검색한 결과 화합물 1을 linolenic acid methyl ester로 동정하였다.10)
- 또한 GC/MS를 이용하여 분석한 결과 11분 49초에서 단일 peak가 관측되었으며, 이 화합물의 EI/MS spectrum에서 M+ 이온 peak가 m/z 280에서 관측되었다. 이 결과를 토대로 Wiley library를 사용하여 검색한 결과 화합물 3을 linoleic acid로 동정하였다.
- 화합물는 모두 사슬형 지방산이지만, 세포독성을 보인 화합물 1과 3은 cis배치의 이중결합을 2개 혹은 3개를 가짐으로 하여, 반응성이 화합물 2와 4에 비하여 상대적으로 높고, 입체적 모양도 일직선이 아니라 구부러진 모양으로 활성을 나타내는 요인이 되는 것으로 추측되었다. 현재까지(0-3 또는(0-6 불포화지방산은 암세포의 이동성과 전이, 혈관생성, 신호전달체계 등을 조절하는 역할이 있다고 보고되어 있으며, R(3) 불포화지방산의 섭취는 fatty acid synthase(FAS) 등 lipogenic enzyme을 억제하여 암 세포의 사멸을 유도한다고 보고되었다.
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