양파는 우리 식생활에서 자주 사용되는 식품 재료로서 그 재배 방법이 용이하여 전국 각지에서 많이 생산되고 있다. 양파 내에는 glutamic acid, arginine 등 다양한 종류의 아미노산이 들어 있어서 그 효능을 증가시킨다. 본 연구에서는 이러한 장점을 가지고 있는 양파의 수요 확대 및 국민 건강 증진을 위하여 양파즙을 기질로 하여 알코올 발효 조건을 검토하고 나아가 발효주의 품질을 개선하여 산업화를 위한 발판을 마련하고자 하였다. 플라스크 배양 결과, 48시간 경에 정지기로 접어들고, 90시간 이후에 사멸기로 나타났다. 에탄올 생성은 114시간에서 정점을 보였다. 플라스크 배양의 최적 조건을 토대로 하여 유가 배양, 연속 배양 등 발효조 배양을 행하였다. 발효조 정치배양은 플라스크 배양과 유사한 결과를 보였지만, 약 24시간 정도 빠르게 진행되었다. 유가배양은 배양 시작 후 72시간 때 10% sucrose가 첨가된 양파즙 배지를 첨가하여 실시되었고, 균의 사멸을 방지하고 알코올의 일정농도를 유지하게 했다. 연속배양은 배양 시작 후 72시간 때부터 24시간 간격으로 연속적으로 신선한 배지를 균 생육이 유지되게 하였다. 그 결과 균 생육은 다소 감소하였지만, 일정농도의 알코올 생성은 가능한 것으로 나타났다. 또한 생체 내에서 항괴혈병 작용, 면역 촉진 작용 등의 생리 활성을 나타내는 비타민 C(L-ascorbic acid)의 유도체인 $2-O-{\alpha}-D-glucopyranosyl$ L-ascorbic acid (AA-2G)를 양파즙 배지에 첨가하여 알코올 발효의 특성을 분석하여 발효주의 비타민 C를 강화하고 면역 증강을 촉진시키는 기능성 발효주로의 가능성을 확인하였다.
양파는 우리 식생활에서 자주 사용되는 식품 재료로서 그 재배 방법이 용이하여 전국 각지에서 많이 생산되고 있다. 양파 내에는 glutamic acid, arginine 등 다양한 종류의 아미노산이 들어 있어서 그 효능을 증가시킨다. 본 연구에서는 이러한 장점을 가지고 있는 양파의 수요 확대 및 국민 건강 증진을 위하여 양파즙을 기질로 하여 알코올 발효 조건을 검토하고 나아가 발효주의 품질을 개선하여 산업화를 위한 발판을 마련하고자 하였다. 플라스크 배양 결과, 48시간 경에 정지기로 접어들고, 90시간 이후에 사멸기로 나타났다. 에탄올 생성은 114시간에서 정점을 보였다. 플라스크 배양의 최적 조건을 토대로 하여 유가 배양, 연속 배양 등 발효조 배양을 행하였다. 발효조 정치배양은 플라스크 배양과 유사한 결과를 보였지만, 약 24시간 정도 빠르게 진행되었다. 유가배양은 배양 시작 후 72시간 때 10% sucrose가 첨가된 양파즙 배지를 첨가하여 실시되었고, 균의 사멸을 방지하고 알코올의 일정농도를 유지하게 했다. 연속배양은 배양 시작 후 72시간 때부터 24시간 간격으로 연속적으로 신선한 배지를 균 생육이 유지되게 하였다. 그 결과 균 생육은 다소 감소하였지만, 일정농도의 알코올 생성은 가능한 것으로 나타났다. 또한 생체 내에서 항괴혈병 작용, 면역 촉진 작용 등의 생리 활성을 나타내는 비타민 C(L-ascorbic acid)의 유도체인 $2-O-{\alpha}-D-glucopyranosyl$ L-ascorbic acid (AA-2G)를 양파즙 배지에 첨가하여 알코올 발효의 특성을 분석하여 발효주의 비타민 C를 강화하고 면역 증강을 촉진시키는 기능성 발효주로의 가능성을 확인하였다.
This study was carried out to develope an alcoholic drink by fermentation of onion extract using Saccharomyces cerevisiae. The optimal conditions for ethanol production were obtained by standing culture at $25^{\circ}C$ for 5 days with 5% inoculum volume. At the results by flask culture, ...
This study was carried out to develope an alcoholic drink by fermentation of onion extract using Saccharomyces cerevisiae. The optimal conditions for ethanol production were obtained by standing culture at $25^{\circ}C$ for 5 days with 5% inoculum volume. At the results by flask culture, the growth curve of used S. cerevisiae reached to the stantionary phase at 48 hr and the death phase at 90 hr, whereas ethanol production reached maximum at 114 hr. Under the above conditions, a large scale production was carried out. A standing culture in 5 l fermenter showed the similar results to its flask culture, but progressed 24 hr rapidly more than that of the flask culture. A fed-batch culture was performed by addition of the onionic medium supplemented with 10% (v/v) sucrose after 72 hr from the fermenting start. The fed-batch culture could prevent S. cerevisiae from entering into the death phase and maintain constant level of alcohol production. A continuous culture was able to carry out by adding per every 24 hr the onionic medium supplemented with 10% (v/v) sucrose after 72 hr from the fermenting start. Although S. cerevisiae used showed a little decreased growth, alcohol production maintained roughly the constant level at the maximum yield. To enhance the quality of this alcoholic drink, $2-O-{\alpha}-D-glucopyranosyl$ L-ascorbic acid (AA-2G) was supplemented into the onion extract of the substrate for fermentation. As resulted at this study, this alcoholic drink containing AA-2G should be used as a functional fermented alcohol drink strengthened with vitamin C.
This study was carried out to develope an alcoholic drink by fermentation of onion extract using Saccharomyces cerevisiae. The optimal conditions for ethanol production were obtained by standing culture at $25^{\circ}C$ for 5 days with 5% inoculum volume. At the results by flask culture, the growth curve of used S. cerevisiae reached to the stantionary phase at 48 hr and the death phase at 90 hr, whereas ethanol production reached maximum at 114 hr. Under the above conditions, a large scale production was carried out. A standing culture in 5 l fermenter showed the similar results to its flask culture, but progressed 24 hr rapidly more than that of the flask culture. A fed-batch culture was performed by addition of the onionic medium supplemented with 10% (v/v) sucrose after 72 hr from the fermenting start. The fed-batch culture could prevent S. cerevisiae from entering into the death phase and maintain constant level of alcohol production. A continuous culture was able to carry out by adding per every 24 hr the onionic medium supplemented with 10% (v/v) sucrose after 72 hr from the fermenting start. Although S. cerevisiae used showed a little decreased growth, alcohol production maintained roughly the constant level at the maximum yield. To enhance the quality of this alcoholic drink, $2-O-{\alpha}-D-glucopyranosyl$ L-ascorbic acid (AA-2G) was supplemented into the onion extract of the substrate for fermentation. As resulted at this study, this alcoholic drink containing AA-2G should be used as a functional fermented alcohol drink strengthened with vitamin C.
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문제 정의
본 연구에서는 양파를 이용한 알코올음료를 위한 대량생산의 기틀을 마련함과 동시에 비타민 C 유도체인 AA-2G 를 첨가하여 기능성 발효주로의 가능성을 확인하였다.
이상에서 양파즙을 이용한 알코올음료의 개발을 위하여 여러 가지 가능성을 살펴보았다. 알코올 외에도 양파는 다양한 종류의 제품으로 개발될 수 있다.
제안 방법
100 ml 플라스크에 양파즙 배지 50 ml 첨가한 후 상기에서 결정된 최적 조건으로 발효를 시작하여 5일 동안 6시간마다 pH, 균 생육도 및 알코올의 생산량을 측정하였다.
5 1 용량의 발효조에 양파즙 배지 3.0 1를 첨가한 후 플라스크 배양과 같은 조건하에서 발효를 시작하여 5일 동안 6시간마다 pH, 균 생육도 및 알코올의 생성량을 측정하였다. 그 결과 플라스크 배양보다 pH는 약간 빠른 하향 곡선을 나타내었고 보다 낮은 pH 범위까지(pH 3.
72시간이 되는 때부터 24시간 간격으로 10% sucorose가 첨가된 양파즙 배지 100 ml을 첨가하고 배양액을 100 ml 회수함으로서 배양액 부피는 항상 일정하게 유지하여 균체의 재 사용성과 알코올 생성을 측정하였다[1,18].
균 생육도는 균 배양액을 10배 희석하여 spectrophotometer (Techne Co., England)로 O.D.660에서 흡광도 값을 측정하였다. 양파즙 및 발효액의 pH는 pH meter (Corning Co.
이것은 곧 연속 배양으로의 적용 가능성을 시사한다. 따라서 72시간 때부터 24시간 간격으로 10% sucorose 첨가한 양파즙 배지 100 ml을 첨가하고 배양액을 100 ml 회수함으로서 배양액 부피는 항상 일정하게 유지하여 균체의 재 사용성과 알코올 생산을 측정하였다. 그 결과 배지를 첨가한 후 24시간이 지나면서 균 생육도가 증가하였고 그 후에 다시 감소하다가 배지를 첨가할 때마다 균 생육도가 증가하는 양상을 보였다.
발효가 종료된 후 AA-2G와 비타민 C의 양을 알아보기 위해 발효액을 filtration 하여 HPLC로 Table 3와 같은 조건 하에서 standard (AA-2G 표준품)의 면적과 비교하여 AA-2G 양을 계산하였고 비타민 C (AA)도 확인하였다.
발효조 정치 배양의 자료를 토대로 탄소원 부족에 의한 균체 생육과 알코올 생산의 저하를 막고 연속 배양으로의 가능성을 모색하기 위하여 배양 시작 후 72시간 때 10% sucrose가 첨가된 양파즙 배지 100 ml을 첨가하여 pH, 균 생육도 및 알코올 생산량을 측정하였다. 이때 pH는 조절하지 않았다.
발효조 정치 배양의 자료를 토대로 탄소원 부족에 의한 균체 생육과 알코올 생산의 저하를 막고 연속 배양으로의 가능성을 모색하기 위하여 일정한 시간, 즉 균 생육도가 대수 증식기에 있고 알코올 생성이 최고에 이를 때 10% sucrose가 첨가된 양파즙 배지 100 ml을 첨가하여 pH, 균 생육도 및 알코올 생성량을 측정하였다. 이때 pH는 조절하지 않았다.
이것은 효모의 생장에 아미노산이 영양성분을 사용되었기 때문이라고 사료된다. 발효주에 비타민 C를 강화하기 위해 양파즙 배지에 AA-2G 산물을 sucrose와 함께 첨가하여 발효하였다. 양파즙 배지 50 ml에 sucrose를 17.
상기에서 결정된 균 생육 최적 조건에서의 균 생육 특성과 알코올 생성량 등을 검토하고 나아가 유가 배양에 필요한 기초 자료를 확립하기 위하여 5 1 용량의 발효조(Korea Fermenter Co., Korea)에 양파즙 배지 3 1을 첨가한 후 플라스크 배양과 같은 조건 하에 발효를 시작하여 5일 동안 6시간마다 pH, 균 생육도 및 알코올의 생성량을 측정하였다.
이 조효소액을 사용한 AA-2G의 생산의 최적 조건은 이미 Bae[2] 등의 연구에 의해 밝혀졌고 그 조건에 의하여 AA-2G를 생산하였다. 생산된 AA-2G를 양파즙 배지에 대해 10%(v/v)로 첨가하고 발효한 후 발효액의 성분을 측정하였다.
660에서 흡광도 값을 측정하였다. 양파즙 및 발효액의 pH는 pH meter (Corning Co., USA)로 측정하였다.
양파즙과 발효액 내의 아미노산을 분석하기 위하여 시료를 evaporator (Eyela Co., Japan)를 이용하여 농축한 다음 membrane filter로 여과하여 여과액 20 μ1를 아미노산 분석기 (Biochrom 20, Pharmacia Co., Sweden)로 Table 2와 같은 조건 하에 loading 하여 분석하였다.
양파즙을 발효 기질로 하여 알코올 발효를 한 후 그 발효액 내에 존재하는 아미노산을 분석하였다. 그 결과 발효 전보다 대부분의 아미노산이 감소하는 것으로 나타났다(Fig.
플라스크를 이용하여 최적 조건[8] 하에서 발효를 시작하여 5일 동안 6시간마다 pH, 균 생육도 및 알코올의 생산량을 측정하였다(Fig. 1). 이때 알코올 도수는 약 13°였다(Fig.
대상 데이터
5% agar이며 모두 일급 시약을 사용하였다. 또한 배양용 액체 배지는 분리용 평판 배지의 성분 중에서 agar를 제외한 것을 사용하였다.
본 실험에 사용한 양파는 경상남도 창녕군에서 생산된 영산 오사리 종을 원료로 하여 상부와 하부 뿌리 부분을 제거하고 사용하였다. 양파의 배지는 양파의 냄새를 제거하기 위해 양파를 파쇄한 후 과립형 활성탄(Sigma Co.
, USA)을 함유한 YM 한천 배지에 도말하여 30℃ 에서 배양한 후 나타나는 단일 colony들을 1차로 분리하였다. 분리한 colony들을 YM 액체 배지에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 배양한 후, 균 생육도와 알코올 발효도가 가장 뛰어난 균주를 2차로 선별하여 실험에 사용하였다.
실험에 사용한 균주는 탁주 생산에 이용되는 시판 중인 효모 S, cerevisiae를 구입하여 양파즙 배지에 넣고 30℃에서 순화시킨 후 한 백금이 떠서 0.01 μg/ml의 chloramphenicol(Sigma Co., USA)을 함유한 YM 한천 배지에 도말하여 30℃ 에서 배양한 후 나타나는 단일 colony들을 1차로 분리하였다. 분리한 colony들을 YM 액체 배지에 접종하여 30℃, 200 rpm에서 배양한 후, 균 생육도와 알코올 발효도가 가장 뛰어난 균주를 2차로 선별하여 실험에 사용하였다.
효모의 분리용 평판 배지의 구성 성분은 0.3% yeast extract, 0.3% malt extract, 0.5% peptone, 1.0% glucose, 1.5% agar이며 모두 일급 시약을 사용하였다. 또한 배양용 액체 배지는 분리용 평판 배지의 성분 중에서 agar를 제외한 것을 사용하였다.
이론/모형
초기 양파즙의 당도 및 발효 과정에서의 당도는 당도계 (Atago Co., Japan)를 이용하여 측정하였고 발효 과정에서 발효액의 환원당은 발효가 끝난 발효액을 7,000 rpm, 20분간 원심 분리(Bechman Co., USA)하여 얻은 상등액을 103배 희석한 후 Somogyi-Nelson 방법[15]을 이용하여 spectrophotometer로 O.D.540에서 흡광도 값을 측정하였다.
성능/효과
4C). AA-2G 산물을 첨가하였을 때 첨가하지 않았을 때보다 알코올 생산량이 약 1° 증가하는 것으로 나타났다(Fig. 5).
1). 균의 생육도는 48시간을 정점으로 하여 90시간까지 42시간 동안 일정 수준으로 유지된 이후에 급격히 사멸되는 것으로 나타났다. 에탄올의 생성은 균이 대수증식기와 정지기를 보이는 시점에서는 균 생육과 유사한 정도의 에탄올 생성능의 증가를 보였다.
이때 pH는 조절하지 않았다. 그 결과 sucrose를 첨가하지 않았을 때보다 알코올 도수가 약 1° 높아졌으며 균 생육도도 잠시 감소하다 증가하는 추세를 보여서 균 재사용의 가능성을 시사하였다(Fig. 2B).
내에 존재하는 아미노산을 분석하였다. 그 결과 발효 전보다 대부분의 아미노산이 감소하는 것으로 나타났다(Fig. 3B). 이것은 효모의 생장에 아미노산이 영양성분을 사용되었기 때문이라고 사료된다.
따라서 72시간 때부터 24시간 간격으로 10% sucorose 첨가한 양파즙 배지 100 ml을 첨가하고 배양액을 100 ml 회수함으로서 배양액 부피는 항상 일정하게 유지하여 균체의 재 사용성과 알코올 생산을 측정하였다. 그 결과 배지를 첨가한 후 24시간이 지나면서 균 생육도가 증가하였고 그 후에 다시 감소하다가 배지를 첨가할 때마다 균 생육도가 증가하는 양상을 보였다. 또한 알코올 도수는 시간이 지날수록 약간 감소하였지만 13°로 일정하게 유지됨을 알 수 있었다(Fig.
0 1를 첨가한 후 플라스크 배양과 같은 조건하에서 발효를 시작하여 5일 동안 6시간마다 pH, 균 생육도 및 알코올의 생성량을 측정하였다. 그 결과 플라스크 배양보다 pH는 약간 빠른 하향 곡선을 나타내었고 보다 낮은 pH 범위까지(pH 3.2) 저하되는 것으로 나타났다. 균의 생육도는 약 하루 정도 빠른 것을 알 수 있었으며 발효를 시작한 지 102시간이 되었을 때 가장 많은 양의 알코올을 생성하였다(15°; Fig.
시중에 나와 있는 양파 주스, 양파 식초가 그 대표적인 예이다. 그래서 본 실험실에서는 상기 실험을 통하여 결정한 최적 조건으로 알코올 발효를 수행하여 양파즙에 AA-2G를 첨가하여 기능성 알코올 음료를 생산하는 것이 가능하였다. 현재는 기능성 양파 식초를 개발하기 위해 알코올 발효가 끝난 발효액에 초산균을 접종하여 초산 발효를 수행하고 있다.
2C). 따라서 연속 배양은 10일 이상 지속되는 발효에 의해 더 많은 양의 발효주를 얻을 수 있음과 동시에 효모의 재사용에 의한 경제성이 있는 것으로 판단되었다. 뿐만 아니라 산업적으로 응용할 경우 배양 5일 후 새로운 발효를 시작하여 발효 시간을 연장시키지 않고 바로 새로운 배지를 첨가하여 발효액으로부터 알코올을 계속해서 연속적으로 얻을 수 있으므로 경쟁력 있는 발효주가 될 수 있을 것이라 생각된다.
그 결과 배지를 첨가한 후 24시간이 지나면서 균 생육도가 증가하였고 그 후에 다시 감소하다가 배지를 첨가할 때마다 균 생육도가 증가하는 양상을 보였다. 또한 알코올 도수는 시간이 지날수록 약간 감소하였지만 13°로 일정하게 유지됨을 알 수 있었다(Fig. 2C). 따라서 연속 배양은 10일 이상 지속되는 발효에 의해 더 많은 양의 발효주를 얻을 수 있음과 동시에 효모의 재사용에 의한 경제성이 있는 것으로 판단되었다.
4B). 양파즙 배지에 AA-2G를 첨가하여 발효한 경우는 AA-2G를 첨가하지 않고 발효한 것에 비하여 aspartic acid, glutamic acid, alanine 등의 아미노산이 상대적으로 많이 잔존하는 것으로 나타났다(Fig. 4C). AA-2G 산물을 첨가하였을 때 첨가하지 않았을 때보다 알코올 생산량이 약 1° 증가하는 것으로 나타났다(Fig.
균의 생육도는 48시간을 정점으로 하여 90시간까지 42시간 동안 일정 수준으로 유지된 이후에 급격히 사멸되는 것으로 나타났다. 에탄올의 생성은 균이 대수증식기와 정지기를 보이는 시점에서는 균 생육과 유사한 정도의 에탄올 생성능의 증가를 보였다. 그러나 균이 사멸되는 시점에서는 완만한 증가의 추세를 보이는데, 이것은 세포 내에 존재하는 에탄올이 사멸과 동시에 유출된 것으로 판단된다.
정치 유가 배양의 자료에 의하면 균 생육도와 알코올 생성이 발효조 배양보다 유가 배양일 때가 더 높은 것으로 나타났다. 이것은 곧 연속 배양으로의 적용 가능성을 시사한다.
양파 내에는 다양한 종류의 아미노산이 들어있다. 특히 본 실험에 사용한 양파즙 내에는 aspartic acid, glutamic acid, ornithine, threonine, lysine 등의 아미노산이 많이 들어 있는 것으로 관찰되었다(Fig. 3A).
후속연구
따라서 연속 배양은 10일 이상 지속되는 발효에 의해 더 많은 양의 발효주를 얻을 수 있음과 동시에 효모의 재사용에 의한 경제성이 있는 것으로 판단되었다. 뿐만 아니라 산업적으로 응용할 경우 배양 5일 후 새로운 발효를 시작하여 발효 시간을 연장시키지 않고 바로 새로운 배지를 첨가하여 발효액으로부터 알코올을 계속해서 연속적으로 얻을 수 있으므로 경쟁력 있는 발효주가 될 수 있을 것이라 생각된다.
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