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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 우수한 항산화 활성을 갖는 것으로 보고된 민들레 잎 물추출물의 항산화 활성을 증진시키기 위한 최적 추출조건을 설정하고자 하였으며, 이를 위해서 시료에 대한 용매 비, 추출온도, 추출시간에 따른 유용성분과 항산화 효과 둥의 추출특성을 반응표면분석하였다.
제안 방법
- 잘 혼합시킨 후, 분광광도계를 사용하여 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. Catechin을 사용하여 구한 검량선으로부터 시료 중의 플라보노이드 함량을 구하였다.
- 이혼합액을 90분간 방치한 후 분광광도계를 사용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. Chlorogenic acid를 사용하여 구한 검량 선으로부터 시료 중의 총 폴리페놀 함량을 구하였다.
- 의해 측정하였다. Xanthine(0.4 mM)이 함유된 0.1 M phosphate buffer(pH 7.5)에 xanthine oxidase(0.05 units/mL)를 반응 시켜 superoxide anion radical을 생성시킨 후 NBT(0.24 mM/L) 와 추출물을 첨가하여 반응시키고 560 nm에서 흡광도를 측정하여 소거 효과를 측정하였다. 각 추출물의 superoxide 라디칼 소거 활성은 추출물을 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 추출물의 농도인 IC50 값으로 나타내었다.
- 이때 추출조건은 시 료에 대한 추출온도(Xj) 50-90oC와 추출용매비 (X2) 10-30 mL/g와 추출시간(X3) 1-3시간이었으며, 이들 독립변수들은 5단계(-2, -1, 0, 1, 2)로 부호화(Table 1)하여 중심합성계획에 따라 16구간으로 설 정하였다(Table 2). 또한 이들 요인변수에 의해 영향을 받는 종속 변수(Yn)는 수율(Y1), 총 폴리페놀(Y2), 총 플라보노이드(Y3), DPPH 라디칼 소거활성 (IC50) (Y4), ABTS 라디칼 소거활성 (IC50) (Y5), superoxide 라디칼 소거활성 (IC50) (Y6)으로 하였다. 이때 민들레 잎을 추출조건에 따라 3회 반복 추출하여 구한 값을 반응표면분 석에 사용하였다
- 민들레 잎 열수추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteau 방법(14)을 변형하여 측정하였다. 농도별 시액 0.
- 민들레 잎 열수추출물의 총 플라보노이드 함량은 Jia 등의 방법 (15)을 변형하여 측정하였다. 농도별 시액 0.
- 반응표면분석에 의한 민들레 잎의 열수추출 조건의 최적화는 MINITAB program을 이용하여 각각의 반응변수의 특성값에 대한목표값을 설정하여 목표값을 만족시키는 인자의 최적 조합을 결정하였다.
- 또한 이들 요인변수에 의해 영향을 받는 종속 변수(Yn)는 수율(Y1), 총 폴리페놀(Y2), 총 플라보노이드(Y3), DPPH 라디칼 소거활성 (IC50) (Y4), ABTS 라디칼 소거활성 (IC50) (Y5), superoxide 라디칼 소거활성 (IC50) (Y6)으로 하였다. 이때 민들레 잎을 추출조건에 따라 3회 반복 추출하여 구한 값을 반응표면분 석에 사용하였다
- , State college, PA, USA를 사용하였다. 이때 추출조건은 시 료에 대한 추출온도(Xj) 50-90oC와 추출용매비 (X2) 10-30 mL/g와 추출시간(X3) 1-3시간이었으며, 이들 독립변수들은 5단계(-2, -1, 0, 1, 2)로 부호화(Table 1)하여 중심합성계획에 따라 16구간으로 설 정하였다(Table 2). 또한 이들 요인변수에 의해 영향을 받는 종속 변수(Yn)는 수율(Y1), 총 폴리페놀(Y2), 총 플라보노이드(Y3), DPPH 라디칼 소거활성 (IC50) (Y4), ABTS 라디칼 소거활성 (IC50) (Y5), superoxide 라디칼 소거활성 (IC50) (Y6)으로 하였다.
- 민들레 잎의 열수 추출물의 항산화 활성 증진을 위한 추출조 건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법을 사용하였다. 중심합성 계획에 따라 추출조건의 독립변수(추출온도, 용매비, 추출시간)와 이에 따라 영향을 받는 종속변수(수율, 총 폴리페놀 함량, 총 플 라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활 성, superoxide 라디칼 소거활성)를 설정하였다. 추출물의 수율은 추출시간에 의해 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났으며 시 료의 용매비가 증가할수록 감소하였고, 70o C 이상의 추출온도에 서 감소하는 것으로 나타났다.
- 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성은 DPPH 자유 라디칼에 대한 환원력을 측정하였다. EtOH에 녹인 0.
대상 데이터
- 본 연구에 사용한 민들레는 경남 의령군의 (주)민들레식품에서 재배한 길이 20 cm 내외의 잎을 채취하여 실험에 사용하였다. 시료는 이물을 제거하고 깨끗이 세척한 후 열풍 건조하여 분쇄한 후 사용하였고, 열수 추출물은 Whatman No.
- 사용하였다. 시료는 이물을 제거하고 깨끗이 세척한 후 열풍 건조하여 분쇄한 후 사용하였고, 열수 추출물은 Whatman No. 1으로 여과한 다음 동결 건조하여 분석용 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 민들레 잎의 열수 추출조건에 따른 추출물의 특성은 MINITAB statistical software program을 사용하여 반응표면회귀분석으로 통계처리하였다.
이론/모형
- ABTS 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS+ - cation decolorization assay 방법(17)에 의하여 시행하였다. 7 mM 2, 2-azino- bis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)와 2.
- Superoxide 라디칼 소거활성은 nitro blue tetrazolium(NBT) 환원법(18)에 의해 측정하였다. Xanthine(0.
- 민들레 잎의 열수 추출물의 항산화 활성 증진을 위한 추출조 건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법을 사용하였다. 중심합성 계획에 따라 추출조건의 독립변수(추출온도, 용매비, 추출시간)와 이에 따라 영향을 받는 종속변수(수율, 총 폴리페놀 함량, 총 플 라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활 성, superoxide 라디칼 소거활성)를 설정하였다.
- 본 실험에서는 추출조건에 따른 추출특성의 모니터링과 추출 조건의 최적화를 위하여 반응표면분석법 (response surface methodology, RSM)(12)을 사용하였다. 추출조건에 대한 실험계획은 중 심합성계획(central composite design)(13)을 사용하였으며, 반응표 면분석을 위해 MINITAB statistical software(version 13, Minitab Inc.
- 본 실험에서는 추출조건에 따른 추출특성의 모니터링과 추출 조건의 최적화를 위하여 반응표면분석법 (response surface methodology, RSM)(12)을 사용하였다. 추출조건에 대한 실험계획은 중 심합성계획(central composite design)(13)을 사용하였으며, 반응표 면분석을 위해 MINITAB statistical software(version 13, Minitab Inc., State college, PA, USA를 사용하였다. 이때 추출조건은 시 료에 대한 추출온도(Xj) 50-90oC와 추출용매비 (X2) 10-30 mL/g와 추출시간(X3) 1-3시간이었으며, 이들 독립변수들은 5단계(-2, -1, 0, 1, 2)로 부호화(Table 1)하여 중심합성계획에 따라 16구간으로 설 정하였다(Table 2).
성능/효과
- Superoxide 라디칼 소거활성에 대한 회귀식의 결정계수(R2)는 0.945로 반응모형 이 적합하였으며 , 반응표면모델식 이 통계적으로 1% 이내에서 유의성이 큰 것으로 나타났다. 종속변수 Y6의 상수와 X] X11 항이 고도의 유의성 p<0.
- 007로 유의하게 낮아 반응표면분석 모델에 적용할 수 없어 최적화 과정에서 제외시켰다. 또한 나머지 종속변수 중 항산화 능을 나타내는 Y4 와Ye Y1 와Y보다 항산화 활성 증진을 위한 열수추출의 조건에서 중요한 요인이기 때문에 최적화 과정 시중요 도를 높게 설정하였고(Table 5), 모든 반응변수의 특성값을 고려하였을 때의 합성 만족도는 0.979이었다. 이러한 특성을 고려한 최적추출조건(Table 6)은 추출온도 83.
- 085로 약간의 유의성이 인정되었다. 반응표면 분석결과(Fig. 4), 추출 시간과 용매비는 DPPH 라디칼 소거활성에 크게 영향을 미치지 않고, 추출온도에 크게 영향을 받는 것으로 나타났다. 추출온도가 높아질수록 IC50 값이 감소하여 소거활성이 증가하다가 최적온도 이후에 약간 감소하는 경향을 나타내었다.
- 016으로 5% 이내의 유의성이 인정되었으며 상호항은 유의성이 인정되지 않았다. 반응표면 분석결과(Fig. 5), 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성이 추출 시간과 용매비에는 거의 영향을 받지 않고, 추출온도에 크게 영향을 받아 온도가 증가함에 따라 소거 활성이 증가하다가 고온에서 약간 감소하는 경향이 나타내어 DPPH 라디칼 소거활성 결과와 유사한 경향을 나타내었다.
- 1)이 인정되었고, 나머지 항은 유의성이 인정되지 않았다(Table 3). 분산분석 결과(Table 4), 일차항이 고도의 유의성이 인정되었고 p<0.01), 이차항은 p=0.016으로 5% 이내의 유의성이 인정되었으며 상호항은 유의성이 인정되지 않았다. 반응표면 분석결과(Fig.
- 1)항이 유의성이 있는 것으로 나타났다(Table 3). 분산분석의 결과(Table 4), 이차항과 상호 항은 유의성이 인정되지 않았고 p>0.1), 일차항만이 유의성이 인정되었다 p<0.01). 추출물의 총 폴리페놀 함량에 대한 반응표면 분석 결과는 Fig.
- 05)항이 유의성 이 있는 것으로 나타났다. 분산분석의 결과(Table 4), 이차항과 상호항은 통계적으로 유의성이 인정되지 않았고 p>0.1), 일차항만이 유의성S0.023)이 있는 것으로 나타났다 (p<0.05).
- 1) 이 인정되었다(Table 3). 분산분석의 결과(Table 4), 일차항과 이차항이 고도의 유의성이 인정되었고0<0.01), 상호항은 P=0.085로 약간의 유의성이 인정되었다. 반응표면 분석결과(Fig.
- 01) 이 인정된 반면 나머지 항은 유의성이 인정되지 않았다(Table 3). 분산분석의 결과(Table 4), 일차항은 1% 이내에서 고도의 유의성이 인정되었고, 이차항도 5% 이내에서 유의성이 인정되었지만 상호항은 유의성이 인정되지 않는 것으로 나타났다. 추출조건에 따른 반응표면 분석 결과(Fig.
- 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량은 추출온도가 증가함에 따라 크게 증가하였으며, DPPH 라 디칼, ABTS 라디칼, superoxide 라디칼 소거활성도 추출온도에 가장 크게 영향을 받아 추출온도가 증가함에 따라 증가하다가 최 적온도 이후에 약간 감소하는 것으로 나타났다. 이들 추출물의 특성을 모두 만족시키는 최적 추출조건은 추출 온도 83.77±1.07o C, 시료에 대한 용매비 20.85±0.24 mL/g, 추출시간 1.59±0.12 hr이 었고 이 때 예측된 수율은 38.98%, 총 폴리페놀 함량은 74.28 µg/mg, 총 플라보노이드 함량은 74.00 µg/mg이었으며, DPPH 라디칼, ABTS 라디칼, superoxide 라디칼의 소거활성(IC50)의 예측 특성 값은 각각 0.14 mg/mL, 3.24 mg/mL, 2.49 mg/mL로 나타났다.
- 979이었다. 이러한 특성을 고려한 최적추출조건(Table 6)은 추출온도 83.77±1.07oC, 시료에 대한 용매비 20.85±0.24 mL/g, 추출시간 1.59±0.12 hr이었고 이 때 예측된 수율은 38.98%, 총 폴리페놀 함량은 74.28 μg/mg, 총 플라보노이드 함량은 74.001ug/mg이고 DPPH 라디칼, ABTS 라디칼과 superoxide 라디칼의 소거활성 (IC%:의 예측 특성 값은 각각 0.14 mg/mL, 3.24 mg/mL, 2.49 mg/mL로 나타났다(Table 7).
- Choi 둥(10)은 팜유와 돈지에 대한 민들레의 항산화력을 측정한 결과 에탄올 추출물과 물 추출물의 항산화력을 인정하였고, Kang(11)은 linoleic acid를 이용하여 민들레의 항산화력을 측정한 결과 물추출물의 항산화력이 BHA보다 유의적으로 높은 값을 나타내었으며, 또한 EPR를 이용하여 민들레 잎의 superoxide 라디칼에 대한 소거활성을 분석한 결과 물 추출물이 가장 높은 활성을 나타낸다고 하였다. 이상의 연구결과에서 보는 바와 같이 민들레는 에탄올 등의 유기용매 추출물보다는 물 추출물이 더 높은 항산화 활성을 나타내기 때문에 민들레의 항산화 활성을 이용한 기능성 소재를 개발하고자 할 때 물 추출물을 이용하는 것이 적합함을 알 수 있다.
- 979로 반응모형이 적합하였으며, 통계적으로도 유의성이 1% 이내에서 인정되었다. 종속변수 Y2의 상수, 일차항(X1, X2, X3), 이차항(X:, X22, X32), 상호항(X1X2, XX X2X3) 중에서 상수p<0.01)와 X1, X22, %2p<0.1)항이 유의성이 있는 것으로 나타났다(Table 3). 분산분석의 결과(Table 4), 이차항과 상호 항은 유의성이 인정되지 않았고 p>0.
- 종속변수 Y3의 상수와 X1 항만이 유의성00.1), 일차항만이 유의성이 인정되었다 p<0.01).
- 추출물의 수율은 추출시간에 의해 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났으며 시 료의 용매비가 증가할수록 감소하였고, 70o C 이상의 추출온도에 서 감소하는 것으로 나타났다. 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량은 추출온도가 증가함에 따라 크게 증가하였으며, DPPH 라 디칼, ABTS 라디칼, superoxide 라디칼 소거활성도 추출온도에 가장 크게 영향을 받아 추출온도가 증가함에 따라 증가하다가 최 적온도 이후에 약간 감소하는 것으로 나타났다. 이들 추출물의 특성을 모두 만족시키는 최적 추출조건은 추출 온도 83.
- 나타내었다. 총 플라보노이드 함량에 대한 회귀식의 결정계수 R2는 0.975로 반응모형이 적합하였으며, 통계적으로도 1% 이내의 유의성이 인정되었다. 종속변수 Y3의 상수와 X1 항만이 유의성0<0.
- 중심합성 계획에 따라 추출조건의 독립변수(추출온도, 용매비, 추출시간)와 이에 따라 영향을 받는 종속변수(수율, 총 폴리페놀 함량, 총 플 라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거활성, ABTS 라디칼 소거활 성, superoxide 라디칼 소거활성)를 설정하였다. 추출물의 수율은 추출시간에 의해 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났으며 시 료의 용매비가 증가할수록 감소하였고, 70o C 이상의 추출온도에 서 감소하는 것으로 나타났다. 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량은 추출온도가 증가함에 따라 크게 증가하였으며, DPPH 라 디칼, ABTS 라디칼, superoxide 라디칼 소거활성도 추출온도에 가장 크게 영향을 받아 추출온도가 증가함에 따라 증가하다가 최 적온도 이후에 약간 감소하는 것으로 나타났다.
- 01). 추출물의 총 플라보노이드 함량에 대한 반응표면 분석결과(Fig. 3), 폴리페놀 함량에 대한 분석결과와 마찬가지로 추출시간과 용매비가 크게 영향을 미치지 않는 것으로 나타났고, 추출온도가 증가할수록 총 플라보노이드 함량이 크게 증가하는 경향을 나타내었다.
- 2에 나타내었다. 추출시간이 증가함에 따라 총폴리 페놀 함량이 약간 증가하고 용매비가 증가함에 따라 약간 증가하다가 최적 용매비를 지나면서 폴리페놀 함량이 다시 감소하는 경향을 나타내었다. 한편 추출온도가 증가함에 따라 총 폴리페놀 함량이 크게 증가하는 것으로 나타났다.
- 4), 추출 시간과 용매비는 DPPH 라디칼 소거활성에 크게 영향을 미치지 않고, 추출온도에 크게 영향을 받는 것으로 나타났다. 추출온도가 높아질수록 IC50 값이 감소하여 소거활성이 증가하다가 최적온도 이후에 약간 감소하는 경향을 나타내었다. Kang 등(20)은 20 mL/ g 용매비, 75-80oC에서 3시간 동안 3회 추출한 민들레 잎의 물 추출물이 첨7]농도 0.
- 분산분석의 결과(Table 4), 일차항은 1% 이내에서 고도의 유의성이 인정되었고, 이차항도 5% 이내에서 유의성이 인정되었지만 상호항은 유의성이 인정되지 않는 것으로 나타났다. 추출조건에 따른 반응표면 분석 결과(Fig. 6), DPPH 라디칼 및 ABTS 라디칼 소거활성 결과와 마찬가지로 추출 시간과 용매비는 온도에 비해 크게 영향을 미치지 않았고, 온도가 증가함에 따라 superoxide 라디칼 소거활성이 크게 증가하는 것으로 나타났다.
- 추출시간이 증가함에 따라 총폴리 페놀 함량이 약간 증가하고 용매비가 증가함에 따라 약간 증가하다가 최적 용매비를 지나면서 폴리페놀 함량이 다시 감소하는 경향을 나타내었다. 한편 추출온도가 증가함에 따라 총 폴리페놀 함량이 크게 증가하는 것으로 나타났다.
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