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문제 정의
- 본 연구는 해조류로부터 안전하고 우수한 활성을 나타내는 미백제를 개발하기 위한 연구의 일환으로 파래가 멜라닌 생성에 영향을 주는지를 조사하고자 각 용매별 주줄물에 의한 tyrosinase 저해활성 및 멜라닌 양을 측정한 결과 유의한 효과를 보였기에 보고하는 바이다.
- 본 연구에서는 해조류로부터 안전하고 우수한 활성을 나타내는 미백제를 개발하기 위한 연구의 일환으로 파래가 멜라닌 생성에 영향을 주는지를 조사하고자 각 용매별 추출물에 의한 tyrosinase 활성 저해 및 멜라닌 양을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
가설 설정
- )는 녹조식물 갈파래과에 속하는 해조류로 독특한 맛과 향을 지녀 예로부터 널리 식용되어 왔으며, 우리나라 전 연안에 분포하며 특히 전라남도 지방에 많이 서식하고 있다.6) 식물체는 모여서 나고 길며, 편평한 엽상체이다. 모양은 피침상, 신장형 또는 선상이다.
제안 방법
- Tyrosinase 저해활성 측정 - Tyrosinase 저해활성 측정은 Choi⑸ 등의 방법을 변형시켜 사용하였다. 96-wellplate에 0.
- 세포 내 Tyrosinase 저해활성 측정 - 세포 내 tyrosinase 저해 활성은 Matinez-Esparza⑹의 방법을 변형시켜 측정하였다. 6-well plate에 5><10'cells/well로 세포를 분주하고 하루 동안 배양한 후 시료를 처리하였다.
- 세포 생존율 측정 - 세포독성은 3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)- 2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 Mosmann"의 방법을 변형하여측정하였다. 96-well plate에 B16/F1 melanoma 세포를 2xl04cells/well 농도로 접종한 후 각 wel에 시료를 투여하여 CC>2 배양기에서 24시간 배양하였다.
- 96-well plate에 B16/F1 melanoma 세포를 2xl04cells/well 농도로 접종한 후 각 wel에 시료를 투여하여 CC>2 배양기에서 24시간 배양하였다. MTT 용액(5 pig/ ml)을 첨가하고 4시간 후 원심분리하여 상등액을 제거하고 100 pil acid-isopropanol (0.04N HC1 in isopropanol)를 첨가한 후 푸른색의 formazan이 용출되도록 하여 micro plate reader 565 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군과 비교하였다.
- 멜라닌 정량 - 멜라닌 정량은 Hosoi 등18)의 방법을 변형하여 사용하였다. 6-well plate에 3><103cells/well 농도로 세포를 접종한 후 시료를 처리하고 48시간 동안 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 여기서 얻은 pellet에 IN NaOH (+10% DMSO) 용액 200 μ1를 첨가하여 용해시킨 후 405nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 양은 합성 멜라닌(Sigma-Aldrich Co.)을 사용하여 작성된 표준 검량선에서 구하고, 실험군의 멜라닌 양은 대조 군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하였다. 멜라닌은 단 위세포(104cells)에서의 멜라닌 생성량을 비교하였다.
- )을 사용하여 작성된 표준 검량선에서 구하고, 실험군의 멜라닌 양은 대조 군의 멜라닌 양에 대한 백분율로 계산하였다. 멜라닌은 단 위세포(104cells)에서의 멜라닌 생성량을 비교하였다.
- 안정도 측정 - 파래 추출물의 제형내 안정도 측정을 위하여 파래 추출물을3%(v/v) 적용한 O/W emulsion을 제조하여 상온, 순환, 고온, 자외선의 4가지 조건에서 보관하면서 pH와 성상 변화를 4주간 관찰하였다.
- 세포독성 - 파래 추출물 및 용매 분획 시료 중에서tyrosinase 저해 활성 우수하게 나타난 파래 추출물과 EtOAc 분획에 대한 세포 내 tyrosinase 저해활성 및 멜라닌 합성 저해능을 측정하기 위해 B16/F1 melanoma 세포에 대한 독성 정도를 측정하였다. 그 결과 시료를 800 pig/ml 농도로 처 리한 경우에도 90% 이상 생존하는 것으로 보아 별다른 세포독성은 없는 것으로 나타났다(Fig.
- 세포 내 Tyrosinase 활성 저해 효과 - Tyrosinase는 멜라닌 합성 과정에서 속도제한(rate-limiting) 효소이며 멜라닌 합성의 주요한 조절적 단계를 나타내는 효소이다.2D 파래 추 출물과 EtOAc 분획을 처리한 세포를 수집하여 용해시킨 후,02% L-DOPA가 첨가된 0.1M sodium phosphate buffer (pH6.8)를 넣고 37℃에서 배양한 후 tyrosinase 저해활성을 측정하였다. 그 결과 Fig.
- 멜라닌 합성 저해 효과 - 생체에서의 멜라닌 합성과정etyrosine을 기질로 하여 dopa를 생성시키고 다시 L-dopa- quinone으로 산화시키는 과정으로 연속적인 효소적 산화가 진행된 후 각 생성물의 중합반응에 의해 이루어진다.22) Tyrosinase 저해 활성이 뛰어난 EtOAc 분획이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 최종 산물인 멜라닌 양을측정하였다. B16/F1 melanoma 세포에 EtOAc 분획을 10, 100, 200 pig/ml 의 농도로 각각 처리하고 48시간 배양한 다음 멜라닌 생성량을 측정하였다.
- 22) Tyrosinase 저해 활성이 뛰어난 EtOAc 분획이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 최종 산물인 멜라닌 양을측정하였다. B16/F1 melanoma 세포에 EtOAc 분획을 10, 100, 200 pig/ml 의 농도로 각각 처리하고 48시간 배양한 다음 멜라닌 생성량을 측정하였다. Fig.
- 안정도 측정 결과 - 파래 추출물의 제형내 안정성을 측정하기 위하여 파래추출물을 l%(w/v) 농도로 용해한 원료와 이 원료 3%(v/v)가 첨가된 O/W emulsion을 각각 제조하여 상온, 순환, 고온, 자외선의 4가지 조건에서 4주간 pH 와 성상의 변화를 관찰하였고, 그 결과를 Fig. 5에 나타내었다. 원료의 경우 제조 직후 pH는 4.
대상 데이터
- 재료 및 시약 - 본 실험에 사용한 파래(E. linea)는 우리나라 서해 연안에서 채취한 것을 즉시 냉동하여 보관된 것을 구입하여, 전문가의 감정을 받아 시용하였으며, 시료의일부(KYPE-10003)는 본 연구실에 보관 중이다. Tyrosinase 저해활성 측정을 위해 사용된 mushroom tyrosinase, tyrosine 및 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma-Aldrich사(USA)에서 각각 구입하여 사용하였다.
- linea)는 우리나라 서해 연안에서 채취한 것을 즉시 냉동하여 보관된 것을 구입하여, 전문가의 감정을 받아 시용하였으며, 시료의일부(KYPE-10003)는 본 연구실에 보관 중이다. Tyrosinase 저해활성 측정을 위해 사용된 mushroom tyrosinase, tyrosine 및 dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma-Aldrich사(USA)에서 각각 구입하여 사용하였다. 추출 및 분획에 사용된 유기용매들과 그 외 각종 시약은 일급 및 특급 시약을 구입하여 시용하였다.
- 세포배양 - B16/F1은 생쥐의 melanoma 세포주로 서울대학교 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 구입한 세포는 5%fetal bovine serum (Bio Whittaker, USA), 1% penicillin-Aqueous Layer (3.
- 세포배양 - B16/F1은 생쥐의 melanoma 세포주로 서울대학교 한국 세포주 은행에서 구입하였다. 구입한 세포는 5%fetal bovine serum (Bio Whittaker, USA), 1% penicillin-Aqueous Layer (3.7g) n-BuOH Fraction (1.3g)Scheme I. Procedure for extraction and fractionation of Enteromorpha linza.streptomycin (Gibco BRL, USA), 200 jiM a-MSH (Sigma-Aldrich Co.)를 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
데이터처리
- 자료분석 및 통계처리 - 모든 실험결과는 평균±표준편 차로 표기하였으며, 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군간의 통계적 유의성 검증은 Studenfs t- test로 하였으며, p 값이 0.
- 자료분석 및 통계처리 - 모든 실험결과는 평균±표준편 차로 표기하였으며, 각 실험군을 대조군에 대한 백분율로 나타내었다. 각 군간의 통계적 유의성 검증은 Studenfs t- test로 하였으며, p 값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
성능/효과
- 1과 같다. 파래 추출물 및 EtOAc 분획층은 농도가 증가함에 따라 tyrosinase 활성 저해율이 유의하게 증가하였다(p<0.05). 또한, tyrosinase 활성도의 IC50 (Inhibition rate 50%)은 EtOAc 분획이 12 μg/ml, 파래 추출물이 18 μg/ml, 부탄올 분획이 140 pig/ml 순이었으며 (p<0.
- 05). 또한, tyrosinase 활성도의 IC50 (Inhibition rate 50%)은 EtOAc 분획이 12 μg/ml, 파래 추출물이 18 μg/ml, 부탄올 분획이 140 pig/ml 순이었으며 (p<0.05), 파래 추출물 중에서 EtOAc 분획의 tyrosinase 활성 저해능이 가장 높았으며, 이는 tyrosinase의 copper 결합부위와 결합해서 tyrosinase 활 성을 억제하는 것으로 알려진 kojic aicd19)의 저해 양상과 비슷하였다.
- 세포독성 - 파래 추출물 및 용매 분획 시료 중에서tyrosinase 저해 활성 우수하게 나타난 파래 추출물과 EtOAc 분획에 대한 세포 내 tyrosinase 저해활성 및 멜라닌 합성 저해능을 측정하기 위해 B16/F1 melanoma 세포에 대한 독성 정도를 측정하였다. 그 결과 시료를 800 pig/ml 농도로 처 리한 경우에도 90% 이상 생존하는 것으로 보아 별다른 세포독성은 없는 것으로 나타났다(Fig. 2).
- 8)를 넣고 37℃에서 배양한 후 tyrosinase 저해활성을 측정하였다. 그 결과 Fig. 3에 나타난 바와 같이 파래 추출물과 EtOAc 분획의 농도가 증가함에 따라 tyrosinase 활성 억제율이 농도 의존적으로 유의하게 증가하였다(p<0.05). 또한, Tyrosinase 활성도의 ICee 파래 추출물이 13 zzg/ml, EtOAc 분획이 8.
- 4에 나타낸 바와 같이, 파래 EtOAc 분획 처리농도가 증가함에 따라 농도 의존적으 로 멜라닌 생성이 감소하였다. 즉, 10μg/ml에서 10±5%, 100 μg/ml에서 15±3%, 200 μg/ml에서 25±5%의 감소율을 보여 EtOAc 분획 처리 농도에 따른 멜라닌 합성 이 유의적 으로 감소되었다. 특히, 양성 대조군으로 사용된 알부틴이 400 μg/ml에서 25±5%의 감소율을 보인 것과 비교하여 볼 때 파래 EtOAc 분획은 알부틴과 비슷하거나 우수한 멜라닌 생성 저해 효과를 나타내는 것으로 나타났다.
- 즉, 10μg/ml에서 10±5%, 100 μg/ml에서 15±3%, 200 μg/ml에서 25±5%의 감소율을 보여 EtOAc 분획 처리 농도에 따른 멜라닌 합성 이 유의적 으로 감소되었다. 특히, 양성 대조군으로 사용된 알부틴이 400 μg/ml에서 25±5%의 감소율을 보인 것과 비교하여 볼 때 파래 EtOAc 분획은 알부틴과 비슷하거나 우수한 멜라닌 생성 저해 효과를 나타내는 것으로 나타났다. 본 연구의 결과 B16/F1 melanoma 세포에 파래 EtOAc 분획을 처리하면 농도 의존적으로 대조군에 비하여 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성이 모두 감소하는 것으로 나타난 것으로 보아 tyrosinase가 멜라닌 합성에 관여하는 주요한 효소로 작용함을 알 수 있다.
- 특히, 양성 대조군으로 사용된 알부틴이 400 μg/ml에서 25±5%의 감소율을 보인 것과 비교하여 볼 때 파래 EtOAc 분획은 알부틴과 비슷하거나 우수한 멜라닌 생성 저해 효과를 나타내는 것으로 나타났다. 본 연구의 결과 B16/F1 melanoma 세포에 파래 EtOAc 분획을 처리하면 농도 의존적으로 대조군에 비하여 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성이 모두 감소하는 것으로 나타난 것으로 보아 tyrosinase가 멜라닌 합성에 관여하는 주요한 효소로 작용함을 알 수 있다. 이러한 사실은 England 등이 보고한 연구와 일치하는 사실이다.
- 5에 나타내었다. 원료의 경우 제조 직후 pH는 4.98이었으며, 4가지 조건에서 모두 4주간 4.55에서 5.08 수준을 유지하였으며, 고유의 검푸른 색은 그대로 유지되었고 침전이나 변색은 발견되지 않았다(data not shown). 파래 추출물을 3%(v/v) 첨가하여 제조한 O/W emulsion의 경우 추출물 첨가전 pH 5.
- 1. 파래 용매별 분획물 중에서 EtOAc 분획 처리군이 가장 높은 tyrosinase 활성 저해 효과를 보였다.
- 2. 세포 내 tyrosinase 활성은 파래 EtOAc 분획의 처리 농도 의존적으로 감소하는 것으로 나타났다.
- 3. B16/F1 melanoma 세포에 파래 EtOAc 분획을 농도별로 처리하고 멜라닌 생성 정도를 측정한 결과 투여 농도의 존적으로 멜라닌 생성을 저해하는 것으로 나타났다.
후속연구
- 향후 파래 추출물을 함유한 화장품을 사용하였을 때 미백효과에 대한 검증 시험과 파래 추출물이 멜라닌 생성에 어떤 기전으로 생성 억제효과를 나타내는지에 대한 연구가 더 진행되면 새로운 미백원료 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- 결론적으로 파래 추출물이 tyrosinase 활성 저해, 멜라닌 생성 억제 효과를 동시에 가지는 물질로 새로운 미백 원료로 개발할 수 있을 것으로 사료된다.
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