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문제 정의
- 본 연구에서는 함초를 새로운 미백소재로 이용하기 위해 B16F10 melanoma 세포에서의 멜라닌 합성 억제효과를 측정하여 작용기전을 규명 하고자 멜라닌 합성 과정에 관여하는 단백질의 발현을 확인하였다.
제안 방법
- B16F10 세포에 α-MSH 100 nM로 멜라닌을 유도한 후, 함초 추출물을 농도별로 처리한 후 멜라닌 합성에 관여하는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF의 단백질 발현량을 측정하였고 housekeeping gene인 β-actin을 대조군으로 사용하였다.
- 따라서 본 실험을 바탕으로 B16F10 세포에 250 μg/ml 이하의 함초 추출물 농도를 처리하여 미백 관련 단백질의 발현 정도 실험을 진행하였다.
- 세포 생존률 측정 − 함초 추출물의 B16F10 세포 독성에 미치는 농도를 조사하기 위하여 MTT assay를 수행하였다.
- 24 well plate에 2×105개를 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 함초 추출물을 농도별로 처리한 다음 48시간 배양 하였다. 배양 후 0.5 mg/ml MTT용액을 넣어 3시간 동안 37℃에서 배양한 다음 상층액을 제거하고 formazan 침전물에 1 ml DMSO를 넣어 약 20분간 방치한 후 570 nm의 파장에서 ELISA readrer로 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 계산하였다.
- 단백질 발현을 확인하기 위하여 B16F10을 100 mm tissue culture dish에 cell seeding 후 24시간 동안 배양하여 cell을 안정화 시켰다. 함초 추출물을 농도별로 처리한 배지로 24-72 시간 배양한 후 다시 배지를 제거하고 phosphate buffered saline(PBS)로 세척해 주었다.
- 함초 에탄올 추출물이 세포 활성 및 멜라닌 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 세포내 멜라닌 생성 저해 효과와 tyrosinase 및 멜라닌 형성에 관련된 단백질을 확인 하였다. 함초 에탄올 추출물의 세포 독성을 분석한 결과 250 ug/ml 이하의 농도에서 세포생존율이 90% 이상으로 나타났다.
대상 데이터
- 함초 탈염 및 추출 − 함초는 순천만에서 재배하는 유기농 함초 건초를 미가식품(2014년 3월)에 구입하여, 증류수로 탈염과정을 거친 뒤 99% 에탄올(v/v)로 상등액을 분리 한 다음 탈염과정을 3회 반복한 후, 이 침전물을 회수하여 회수물의 10배의 70% 에탄올(v/v)로 환류 추출을 실시하였다.
- Western Blot을 통한 미백 관련 단백질의 발현 측정 −미백 관련 단백 유전자 중 TRP-1, TRP-2, Tyrosinase, TRP1, TRP-2, ERK 항체는 Santa Cruz Biotechnology(CA, USA), β-actin Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA) MITF, pERK, CREB Abcam(Cambridge, MA, USA), MEK Cell Signaling Technology(Boston, MA, USA), pMEK Enzo Life Scinences(Farmingdale, NY, USA)에서 사용하였다.
- Louis, MO, USA) MITF, pERK, CREB Abcam(Cambridge, MA, USA), MEK Cell Signaling Technology(Boston, MA, USA), pMEK Enzo Life Scinences(Farmingdale, NY, USA)에서 사용하였다. 이차항체로는 anti-rabbit Invitrogen(Carlsbad, USA), antimouse Cell Signaling Technology(Boston, MA, USA)를 사용하였다.
- B16F10 세포배양 − B16F10 melanoma세포는 ATCC(American Type culture collection, Rockville, MD, U.S.A) 구입하여 37℃에서 5% Co2 배양기에서 RPMI-1640 media(Corning, USA)에 10% fetal bovine serum(Corning, USA), 1% penicillin 및 streptomycin을 첨가하여 배양하였고, 멜라닌 세포 자극 호르몬(α-melanocyte stimulating hormone, αMSH)은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 통계처리 − 본 실험에서는 독립적으로 3회 이상 반복 실시 하여 실험 한 결과를 평균 표준편차로 표기 하였고, 통계적 유의성은 SPSS 프로그램을 사용하여 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의 하다고 판단하였다.
이론/모형
- B16F10 세포의 함초 추출물의 시간대별 미백 관련 단백질 발현 확인 − 함초 추출물이 멜라닌 합성 관련 단백질을 변화시킬 수 있는지를 알아보기 위해 western blotting을 수행하였다.
- 세포 생존율 실험 − 본 실험에서 B16F10 세포에 대한 시료의 처리농도를 결정하기 위해 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma] assay를 Mosmann의 방법에 의하여 실시하였다.
성능/효과
- B16F10 세포에 대한 각 시료의 세포 독성을 측정한 결과 Fig. 2에서 보는 바와 같이 250 μg/ml 이하의 농도에서 90% 이상의 세포 생존율을 확인하였다.
- B16F10 세포에 α-MSH 100 nM로 멜라닌을 유도한 후, 함초 추출물을 농도별로 처리한 후 멜라닌 합성에 관여하는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF의 단백질 발현량을 측정하였고 housekeeping gene인 β-actin을 대조군으로 사용하였다. 그 결과, 48시간 처리를 제외한 Tyrosinase 단백질 발현량은 농도 의존적으로 감소함을 보였으며 처리 시간에 관여 없이 TRP-2, MITF 단백질 발현량도 추출물의 농도 의존적으로 감소함을 확인하였다(Fig. 3, 4). 하지만 72 시간 처리한 세포에서는 흥미롭게도 DOPA 자극 하에서 세포에서 매우 높은 수준의 TRP-1 단백질 발현을 나타냈다(Fig.
- 이는 체내 melanin이 항상성 있게 유지되기 위함으로 사료되며 TRP-1은 DHICA를 산화시켜 최종적으로 melanin을 생성하는 DHICA oxidase로 melanin 생성에 있어 매우 중요한 역할을 하는 단백질 중 하나이다.12) 함초 추출물을 농도별 처리한 결과 농도 의존적으로 증가 하였다. 이는 함초 추출물이 유의적으로 DOPA를 제거하였기 때문에 세포에서 TRP-1의 생성이 정상 수준으로 돌아간 것이라고 사료되어진다.
- 125 µg/ml 농도로 함초 추출물의 처리한 후 tyrosinase, TRP-1, TRP-2, MITF 멜라닌 관련 단백질 발현은 9시간 이후부터 발현이 현저하게 감소 하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 6).
- 이는 함초 추출물이 유의적으로 DOPA를 제거하였기 때문에 세포에서 TRP-1의 생성이 정상 수준으로 돌아간 것이라고 사료되어진다. 또한 dopachrom을 산화시켜 DHICA를 생성시키는 고농도의 함초 추출물의 존재하에서 TRP-2의 단백질 발현이 억제되는 것을 확인하였다.13)
- 6). MAPKase의 활성을 확인해 본 결과, 3시간 때에 발현량이 증가함을 나타내어 멜라닌 생성 억제에 extracellular signal-regulated kinase(ERK) pathway가 관여함을 알 수 있었다(Fig. 7). 함초 추출물의 농도별로 3시간 처리 후 농도 의존적으로 인산화가 증가하는 것으로 보아 멜라닌 합성 억제에 ERK가 관여함을 알 수 있었다(Fig.
- 7). 함초 추출물의 농도별로 3시간 처리 후 농도 의존적으로 인산화가 증가하는 것으로 보아 멜라닌 합성 억제에 ERK가 관여함을 알 수 있었다(Fig. 8). 세포 내 cAMP response element binding(CREB) protein을 활성화되면서 melanin 합성이 증가하며 3시간 처리 후 함초 추물이 농도 의존적으로 발현량이 감소하는 것을 볼 수 있다14)(Fig.
- 이 실험 결과로 Melanin의 생합성 신호 전달 체계에는 매우 다양한 신호 전달 물질이 관여 하고 있고 melanin은 몇 가지 세포내 신호 전달 기전을 통하여 합성되는 데 그 중 cAMP/ PKA경로가 melanin 합성의 주요경로이다. PKA를 활성화 시키며, CREB를 거쳐 MITF의 발현을 증가시킨다.
- 함초 에탄올 추출물이 세포 활성 및 멜라닌 생성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 세포내 멜라닌 생성 저해 효과와 tyrosinase 및 멜라닌 형성에 관련된 단백질을 확인 하였다. 함초 에탄올 추출물의 세포 독성을 분석한 결과 250 ug/ml 이하의 농도에서 세포생존율이 90% 이상으로 나타났다. 또한 B16F10melanoma 세포에서 멜라닌 합성에 관여하는 단백질을 western blot으로 분석한 결과, tyrosinase와 TRP-2, MITF에서 함초 에탄올 추출물 처리 군이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었고, tyrosinase는 12시간 이후부터 TRP-1과 MITF가 24시간 이후부터 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 함초 에탄올 추출물의 세포 독성을 분석한 결과 250 ug/ml 이하의 농도에서 세포생존율이 90% 이상으로 나타났다. 또한 B16F10melanoma 세포에서 멜라닌 합성에 관여하는 단백질을 western blot으로 분석한 결과, tyrosinase와 TRP-2, MITF에서 함초 에탄올 추출물 처리 군이 농도 의존적으로 감소하는 것을 확인할 수 있었고, tyrosinase는 12시간 이후부터 TRP-1과 MITF가 24시간 이후부터 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
- 또한 ERK 단백질 활성을 확인해본 결과, 3시간 때에 최고 수준을 나타내었고 농도 의존적으로 인산화가 증가하는 것으로 보아 멜라닌 생성 억제에 ERK pathway가 관여함을 확인할 수 있었다.20)
- 결과적으로 함초 추출물의 미백 작용은 tyrosinase의 활성을 억제하며 B16F10 melanoma 세포에서 α-MSH에 의한 tyrosinase 활성과 melanin 생성 증가를 농도 의존적으로 억제 하였다.
후속연구
- 멜라닌 생합성에 관여하는 단백질의 발현조절 경로를 통하여 멜라닌 생합성 저해 및 감소 효과를 나타나는 것으로 보이며 향후 미백 제품에 응용 할 수 있을 것으로 판단된다.
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