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문제 정의
- 현재 항산화 활성 검색에는 다양한 방법이 시용되고 있으나 ORAC (oxygen radical absorbance capacity) assay는 peroxy radical의 생성과 소멸에 의한 fluorescent의 감소율 변화를 측정히는 것으로 ORAC assay는 2004년 항산화 작용의 표준화를 위한 세계학술대회에서 선정된 방법 중 하나로서 측정 감도가 예민하여 정확도를 높일 수 있는 방법이다. 9)본 연구에서는 ORAC assay에 의한 항산화 활성의 측정에서 강한 활성을 보인 애기땅빈대의 EtOAc 분획으로부터 항산화 활성을 가지는 8종의 flavonoid 화합물을 분리하고 그 항산화 효과를 보고하고자 한다.
제안 방법
- 3 mg). EtOAc 가용부의 소분획 Fr.2를 MeOH용매로 Sephadex LH-20 column에 적용하여 9개의 분획 (Fr2- 1〜2・9)으로 나누었으며, 5번째 분획인 Fr.2-5를 recycling HPLC (JAI-GEL GS-310, MeO니)로 정제하여 화합물 7 (22.2mg)을 얻었다. 화합물 8은 분획 Fr.
- ORAC assay에 의한 항산화 활성의 측정에서 강한 활성을 보인 애기땅빈대의 EtOAc 분획을 각종 컬럼 크로마토그래피에 적용히여8종의 화합물을 분리하였고 이화학적 성상 및 기기 분석적 방법으로 그 구조를 규명하였다. 분리된 화합물은flavonoid인 kaempferol (1), quercetin (2), juglanin (3), avicularin (4), astragalin (5), isoquercitrin (6), hyperin (7)및 nicotiflorin (8)으로 확인 동정히였다.
- 과산화 라디칼의 생성을 위해 2, 2-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochlcride (AAPH)를 사용하였고, Talcott & Lee가 항산화 활성 측정에 사용한 ORAC (oxygen radical absorbance by fluorescein)분석법을 이용하였다 3)본 실험에서 검액 및 표준액의 농도별 희석과 실험용 시액들의 제조에는 중성 phosphate buffer를 사용하였다. 검량곡선을 작성하기 위하여 항산화 활성 비교 표준액으로 trolox를 인산 완충용액을 가하여 각각 0, 1.65, 3.125, 6.25, 12.5, 25.0, 50.0 ㎍/ml 농도로 희석하여 표준 곡선을 작성하였다. Fluorescent 표준 용액은 Ou 등11)의 방법에 따라 fluorescent stock 10㎕를 phosphate buffer 50mL에 용해하여 제조하였고, 측정기기는 fimax fluorescent microplate reader를 사용하여 485 nm에서 전자가 여기 (ex-citation)되고 538nm에서 방출 (emission)되게조절하여 본 실험에 적용하였다.
- 1-1 시-8)을 얻었다. 분획 Fr.1-1 과 Fr.1-2로 각각 reverse phase (RP) C-18 (60% MeOH)과 Sephadex LH-20 column chromatography (MeO니)를 실시하여 화합물 1 (2.1 mg), 2 (9.6mg)를 분리하였다. 소분획 Fr.
- 애기땅빈대의 항산화 활성 성분 규명을 위하여 전초를 MeOH로 추출하고 CH2C12, EtOAc, w-BuOH 순으로 용매 분획하였다. 항산화 효능 평가를 위한 ORAC assay에서 positive control인 trolox보다 강한 활성을 나타낸 EtOAc 가용 부를 silica gel, Sephadex LH-20 및 RP C-18 column chromatography를 반복 실시하고, 일부 분획은 recycling HPLC로 정제하여 8종의 flavonoid화합물을 분리하였다.
- 애기땅빈대의 항산화 활성 성분을 밝히기 위히여 MeOH 추출물 및 용매분획의 항산화 효능을 검색하였다. ORAC assay에 의한 항산화 활성의 측정에서 강한 활성을 보인 애기땅빈대의 EtOAc 분획을 각종 컬럼 크로마토그래피에 적용히여8종의 화합물을 분리하였고 이화학적 성상 및 기기 분석적 방법으로 그 구조를 규명하였다.
- 항산화 활성 측정 (ORAC assay) - 추출물 및 화합물의 항산화 활성은 peroxy radical의 생성과 소멸에 의한 fluorescent의 감소율 변화를 측정하였다. 과산화 라디칼의 생성을 위해 2, 2-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochlcride (AAPH)를 사용하였고, Talcott & Lee가 항산화 활성 측정에 사용한 ORAC (oxygen radical absorbance by fluorescein)분석법을 이용하였다 3)본 실험에서 검액 및 표준액의 농도별 희석과 실험용 시액들의 제조에는 중성 phosphate buffer를 사용하였다.
- 5 응을 얻었다. 항산화 효능 평가를 위한 ORAC assay에서 positive control인 trolox보다 강한 활성을 나타낸 EtOAc 가용 부를 EtOAc-MeOH (15:1, 10:1, 5:1, 1:1) 혼합용매로 silica gel column chromatography0]] 적용하여 4개의 분획 (Fr. 1〜4)으로 나누었다. 소분획 Fr.
- , EtOAc, w-BuOH 순으로 용매 분획하였다. 항산화 효능 평가를 위한 ORAC assay에서 positive control인 trolox보다 강한 활성을 나타낸 EtOAc 가용 부를 silica gel, Sephadex LH-20 및 RP C-18 column chromatography를 반복 실시하고, 일부 분획은 recycling HPLC로 정제하여 8종의 flavonoid화합물을 분리하였다.
- 배당체임을 추정하였다. 화합물 3과 4의 ^-NMR spectrum에서 flavonoid의 aglycone에 해당하는 영역은 각각 1, 2와 거의 흡사하였으며 3의 5 5.45와 4의 5 5.45에서 나타난 broad singlet의 anomeric proton peak와 8 3.30-4.40범위의 당에 의한 signal들로부터 화합물 3, 4는 각각kaempferol 3-(9-a-L-arabinofuranoside (juglanin)과 quercetin 3-(9-a-L-arabinofuranoside (avicularin)로 추정하였으며, 문헌 기록 spectral data6」^)와의 비교로부터 확정하였다.
대상 데이터
- 15423, Merck) 을 사용하였다. 2, 2-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride 와 trolox는 Aldrich사 (Milw., WI, USA)에서 구입하여 사용하였고, fluorescent stock은 Sigma사 (St Louis, MO, USA)에서 구입하였다. 추출 및 column chromatography용 용매는 1급시약을 증류하여 사용하였으며 recycling HPLC에는 HPLC용 용매를 적용하였고 기타 시약은 1급 또는 특급을 사용하였다.
- , California)# 사용하였다. Column chromato- graphy용 충진제는 Kiesel gel 60 (230~400mesh, No. 9385, Merck), Lipophilic Sephadex (LH-20, 25-100 ji, Sigma- Aldrich)와 LiChroprep RP-18 (40-63 jim, Merck)을 시용하였으며 TLC plate는 precoated Kiesel gel 60 F254 (No. 5715, Merck)와 precoated RP-18 F254s (No. 15423, Merck) 을 사용하였다. 2, 2-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride 와 trolox는 Aldrich사 (Milw.
- 실험재료 - 애 기땅빈대 (Euphorbia suphid)는 2006년 6월 경상남도 창녕군에서 채집하여 정획히 감정한 후 시용하였으며, 표준품은 성균관대학교 약학대학 생약학 연구실에 보관하고 있다 (SKKU-06-25).
데이터처리
- 기기 및 시약 - 'H- 및 13C-NMR spectra는 Varian Unity INOVA 500 spectrometers. 측정하였고' ESI-MS는 Agilent 1100 LC/MSD trap classic을 시용하였다. Recycling HPLC 는 JAIGEL-GS310 column。] 장착된 JAI LC-908 Recycling Preparative HPLC를 이용하였으며, fluorescent microplate reader는 fimax® fluorescent microplate reader (Molecular Device Co.
이론/모형
- 0 ㎍/ml 농도로 희석하여 표준 곡선을 작성하였다. Fluorescent 표준 용액은 Ou 등11)의 방법에 따라 fluorescent stock 10㎕를 phosphate buffer 50mL에 용해하여 제조하였고, 측정기기는 fimax fluorescent microplate reader를 사용하여 485 nm에서 전자가 여기 (ex-citation)되고 538nm에서 방출 (emission)되게조절하여 본 실험에 적용하였다.
- 감소율 변화를 측정하였다. 과산화 라디칼의 생성을 위해 2, 2-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochlcride (AAPH)를 사용하였고, Talcott & Lee가 항산화 활성 측정에 사용한 ORAC (oxygen radical absorbance by fluorescein)분석법을 이용하였다 3)본 실험에서 검액 및 표준액의 농도별 희석과 실험용 시액들의 제조에는 중성 phosphate buffer를 사용하였다. 검량곡선을 작성하기 위하여 항산화 활성 비교 표준액으로 trolox를 인산 완충용액을 가하여 각각 0, 1.
- 추출물과 분획, 분리된 화합물의 항산화 활성은 ORAC assay법을 적용하여 검토하였다. 추출물 및 분획의 항산화 활성을 측정한 결과 각 시료의 농도가 2 pig/mL이하 수준에서는 차이를 나타내지 않았으나' 10jig/mL을 처리한 경우 시료에 뚜렷한 차이를 나타내었다.
성능/효과
- 의한 발색과 NMR spectum의 양상으로 부터 flavonoid 계열의 화합물임을 알 수 있었다. 화합물 1과 2는 유사한 물질로서 ESLMS에서 16의 분자량 차이로부터 2에 산소가 하나 더 도입된 화합물임을 알 수 있었고, 1H-NMR spectrum에서 flavonol의 aglycone에 해당하는 signal들의 존재로부터 당이 결합되지 않은 flavonol화합물임을 인지하였으며, 두 화합물의 차이를 나타낸 flavonol B-ring게 해당하는 signal들의 chemical shift값과 coupling양상으로부터 화합물 1과 2는 각각 kaempferol^ quercetin임을 알 수 있었고 이들의 spectral data는 문헌에 보고된 값", ⑶과 잘 일치하였다.
- ORAC assay에 의한 분리된 화합물의 항산화 활성 검색 결과, 화합물 4에서 높은 항산화 활성을 나타내었으며, 화합물 6. 7 또한 비교적 높은 활성을 보였고' 나머지 화합물은 trolox보다 약한 활성을 가짐을 알 수 있었다.
- 2배 이상 높은 항산화 효과를 나타내 었다 (Table I). 따라서 EtOAc 분획으로부터 8 종의 flavonoid 화합물을 분리하였고 각각의 항산화 활성을 측정한 결과, 화합물 4는 trolox에 비하여 약 1.5배 이상의 높은 항산화 수치로 매우 높은 활성이 나타났으며 화합물 6과 7은 EtOAc 분획과 유사한 값으로 trolox보다 높은 항산화 활성을 보여주었고' 나머지 화합물은 대조물질인 trolox 보다 약한 활성을 나타내었다(Table II).
- 화합물 1〜8은 TLC plate상에서 lOZ-HzSQ 및 FeC, 용액에 의한 발색과 NMR spectum의 양상으로 부터 flavonoid 계열의 화합물임을 알 수 있었다. 화합물 1과 2는 유사한 물질로서 ESLMS에서 16의 분자량 차이로부터 2에 산소가 하나 더 도입된 화합물임을 알 수 있었고, 1H-NMR spectrum에서 flavonol의 aglycone에 해당하는 signal들의 존재로부터 당이 결합되지 않은 flavonol화합물임을 인지하였으며, 두 화합물의 차이를 나타낸 flavonol B-ring게 해당하는 signal들의 chemical shift값과 coupling양상으로부터 화합물 1과 2는 각각 kaempferol^ quercetin임을 알 수 있었고 이들의 spectral data는 문헌에 보고된 값", ⑶과 잘 일치하였다.
후속연구
- 본 연구에 시용한 ORAC assay는 2004년 플로리다 올랜도에서 열린 항산화 작용의 표준화를 위한 세계학술대회에서 선정된 방법 중 하나로서 측정 감도가 예민하여 정확도를 높일 수 있는 방법이다추후 애기땅빈대의 EtOAc 분획으로부터 더 많은 성분의 분리와 다양한 유사 유도체 의획, 보로부터 정확한 구조 활성 상관 괸계의 연구와 활성 메카니즘의 규명이 필요하리라 사료된다.
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