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제안 방법
- 이에 白蘇葉과 紫蘇葉에 함유되어있는 phenolic compound 인 曲와 CA 의 함량을 RP-HPLC# 사용한 동시정량 분석 방법으로 최적 추출 조건을 설정하였으며, 이를 이용하여 紫蘇葉과 白蘇葉의 함량과 紫 蘇葉의 대표적인 방제인 香蘇散과 杏蘇散에서 함량분석을 실험하였다
- 曲와 CA, naringin 표준품 1.0 mg을 각각 정밀하게 달아 이동상 1.0 mL를 정확하게 넣어 표준액으로 하였다 이를 희석하여 100, 10, 1 Ug/mL의 농도로 조제하여 naringin 1.0 mg/mL 와 9 : 1의 비율로 조제한 후 이를 mlC로 분석하였다 분석한 chromatograme 칵 피크와 내부 표준물질 피크의 면적 비율을 측정하여 검량선을 각성하였다.
- HPLC 분석 조건은 rosmarinic acid, caffeic acid 과 내부표준물질인 naringin이 동시에 분리되는 조건으로 정확도를 실험하기 위해 recovery test를 실시하였다. Recovery test는 白蘇葉 주줄물 1 mL에 CA 와 RA를 각각 1, 5, 10 Ug씩 첨가하여 HPLC 분석조건으로 각각 3회 이상 분석하여 실험하였다.
- HPLC 분석 조건은 rosmarinic acid, caffeic acid 과 내부표준물질인 naringin이 동시에 분리되는 조건으로 정확도를 실험하기 위해 recovery test를 실시하였다. Recovery test는 白蘇葉 주줄물 1 mL에 CA 와 RA를 각각 1, 5, 10 Ug씩 첨가하여 HPLC 분석조건으로 각각 3회 이상 분석하여 실험하였다.
- 白蘇葉을 정확히 1 g 취한 후 에탄올을 20, 30, 40, 50%의 농도로 각각 100 mL를 가하여 끓기 시작하는 시점부터 0-120분까지 환류 추출하였다. 추출용액은 30분단위로 1 mL를 취하고, 12,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상층액을 분리하였다.
- 추출용액은 30분단위로 1 mL를 취하고, 12,000 rpm으로 20분간 원심 분리하여 상층액을 분리하였다. 이를 0.20 Um membrane filter (Advantec, Tokyo, Japan) 로 여과한 후 0.45 mL을 취하여 내부표준물질인 1.0 mg/ml의 naringin을 0.05 mL을 합하여 이것을 HPLC로 분석하였다.
- 香蘇散과 杏蘇散은 방제학的의 처방비율에 근거하여 조말을 혼합하였다 香蘇散은 香附子, 紫蘇葉, 甘 草, 陳皮를 4 : 4 : 1 : 2의 비율로 혼합하였며, 杏蘇 散은 紫蘇葉, 半夏, 茯苓, 前胡, 桔梗, 枳殼, 甘草, 陳 皮, 杏仁을 모두 동량으로 혼합하였다 香蘇散 및 杏 蘇散은 정확히 1 g 취한 후 50% ethanol을 100 mL 가하여 60분간 환류 추출하였다. 환류 추출액을 1 mL 취하여 12,000 rpm으로 20분간 원심 분리 하 여상증액을 분리하였다.
- 농도별로 조제한 표준액의 면적과 일정한 농도의 내부표준물질의 면적을 나누어 X축을 표준액의 농도로, y죽을 표준액과 naringin의 피크 면적 비율로 하여 검량선을 작성하였다 추세선 및 수식을 설정 한 후 수식에 대입하여 검액의 함량으로 계산하였다.
- 추출시간에 따른 추출률을 살펴보면 끓기 시작한 이후 1시간까지는 추출 시간이 길어지면 추출 시간이 증가하다가 1 시간 이상이 되면 RA와 CA 모두 추출물의 함량 차이가 나타나지 않았다. 또한 曲와 CA는 각각 에탄올의 농도가 40%와 30% 이상이 되면 냉침 상태에서도 어느 정도 추출이 되는 것을 볼 수 있으나 모든 에탄올 농도에서 끓기 시작하여 1시간까지 추출률이 증가하는 것으로 나타나 추출 시간은 1시간으로 하였다. 曲의 경우, ethanol 농도별 추출 함량에 차이가 나타났으며 50%의 ethanol 조건에서 우수한 추출률을 나타내었다.
- 앞서 언급한 HPLC 분석 조건을 이욚하여 자소엽이 함유된 대표 방제인 香蘇散과 杏蘇散에 적용하여보았다. 다만 이 경우 두 방제는 naringin을 주요 성분으로 함유하는 陳皮를 구성 약재로서 가지고 있어 방해 피크가 생기기 때문에 naringin이 내부 표준 물질로써의 역할을 할 수 없게 되어 내부표준물질을 사용하지 않고 피크의 면적으로 검량선을 작성하여 함량을 즉정였다.
- 분석 및 추출 조건에 따라 紫蘇葉과 白蘇葉의 함량을 측정하였다. 紫蘇葉과 白蘇葉에 함유된 RA는 각각 38.
대상 데이터
- 白蘇葉은 가락동 농수산물시장에서 들깨의 잎을 구입하였으며, 紫蘇葉은 경희대학교 약초원에서 채취하였다. 紫蘇葉 및 香附子, 甘草, 陳皮, 半夏, 茯苓, 前胡, 桔梗, 枳殼, 杏仁은 서울 동대문구 제기동 소재의 경동시장의 한약유통업체 및 한약국에서 구입하여 《대한약전》과 《대한약전외한약규격집》의 성상을 기준으로 관능검사를 실시하여 적합한 것을 실험에 사용하였다.
- 紫蘇葉 및 香附子, 甘草, 陳皮, 半夏, 茯苓, 前胡, 桔梗, 枳殼, 杏仁은 서울 동대문구 제기동 소재의 경동시장의 한약유통업체 및 한약국에서 구입하여 《대한약전》과 《대한약전외한약규격집》의 성상을 기준으로 관능검사를 실시하여 적합한 것을 실험에 사용하였다.
- 白蘇葉과 紫蘇葉은 잎을 가볍게 정제수로 닦은 후 자연 건조하여 실험에 사용하였다. 모든 시료는 조말로 분쇄하여 냉동 보관하여 실험에 사용하였다
- 曲와 CA 정량에 사용한 표준품은 RA (Sigma chemical Co, St Louis, USA), CA (Sigma chemical Co, St Louis, USA)를 사용하였으며, 내부표준물질 (internal standard)은 naringin, (Sigma chemical Co, St Louis, USA)을 사용하였다.
- Methanol (Malinckrodt Baker, Inc. Pliilipsburg, USA)은 HPLC 등급을 사용하였으며, ethanol (Duksan chemical, Korea), fomiic acid (Duksan chemical, Korea) 및 기타 시약은 특급시약을 사용하였다. HPLC 분석에 사용한 기기는 Sliisheido nanospace SI-2 HPLC system (Shisheiclo, Tokyo, Japan)으로 펌프 및 칼럼 오븐 및 시료주입장치, UV 검출기로 구성되었다.
- Pliilipsburg, USA)은 HPLC 등급을 사용하였으며, ethanol (Duksan chemical, Korea), fomiic acid (Duksan chemical, Korea) 및 기타 시약은 특급시약을 사용하였다. HPLC 분석에 사용한 기기는 Sliisheido nanospace SI-2 HPLC system (Shisheiclo, Tokyo, Japan)으로 펌프 및 칼럼 오븐 및 시료주입장치, UV 검출기로 구성되었다.
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