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문제 정의
- Raw 264.7 세포에서 LPS로 염증반응을 자극하여 유도시킨 TNF-α의 생성량에 미치는 연교승마탕과 회춘양격산 추출물의 영향에 대해 알아보았다.
- 따라서 본 연구에서는 기성한의서를 바탕으로 항염증 효과가 있는 연교를 함유한 처방단 중 피부 염증과 관련 있는 처방단 추출물을 이용하여 화장품 원료로의 적용 가능성을 확인하기 위하여 항산화 및 항염 효능을 알아보았다.
- 연교를 포함한 처방단들이 화장품 소재로 사용되었을시 안전한 소재임을 평가하기 위하여 섬유아세포의 생존력을 평가하였다. 항산화 효과와 lipoxygenase 활성 저해 효과에서 양호하게 평가되었던 각각 처방단들의 75 % EtOH 수용액 추출물에 대해 알아보았다.
제안 방법
- 배양 후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 연교 함유 처방단 중 연교승마탕과 회춘양 격산의 75 % EtOH 수용액 추출물 및 분획물들을 희석하여 처리한 후 염증 반응 유도 인자인 lipopolysaccharide (LPS)를 1 µg/mL의 농도로 처리하여 24 h 동안 배양하였다. 24 h 동안 배양 후 배양액을 NO detection kit를 이용하여 NO의 생성 정도를 측정하였다.
- 4가지 연교 함유 처방단을 각 총 50 g을 정량하여 추출기에 넣은 후, 25, 50, 75, 100 % 에탄올(EtOH) 및 정제수를 사용하여 4 h 씩 2회 반복 환류 냉각 ⋅ 추출하였다.
- 4종의 처방단 중 연교처방단과 회춘양격산 추출물의 항염 효능을 평가하기 위하여 Raw 264.7 세포에 LPS를 처리하여 주고 세포배양 배지 내에 존재하는 NO의 생성 양을 NO detection kit로 측정하였다. LPS 처리시 NO 생성량이 약 10배 증가하는 것을 확인하였다.
- 연교를 포함한 처방단 추출물들 대부분에서 항산화 효과가 있음을 확인하였으며, 연교승마탕, 청열소독음, 회춘양격산 추출물에서 lipoxygenase 저해 효과를 알 수 있었다. Raw 264.7 세포를 이용한 항염 효능을 평가한결과 연교승마탕 추출물의 우수한 NO 생성 저해 효과와 회춘양격산 추출물의 강한 PGE2 생성 저해 효과를 확인하였다. 또한, 인체 피부 일차자극 시험 결과 처방단 추출물들은 무자극으로 판정되었다.
- 배양 후 배양액을 제거하고 각각 처방단들의 75 % EtOH 수용액 추출물들을 농도별로 무혈청 배지에 희석하여 교체한 후 24 h 동안 배양하였다. 배양 후 MTT assay를 통해 정상 사람 섬유아세포에서의 생존력을 알아보았다. 연교를 함유한 처방단 중 연교승마탕과 회춘양 격산의 75 % EtOH 수용액 추출물들과 분획물들을 농도별로 무혈청 배지에 희석하여 교체한 후, Raw 264.
- 배양 후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 연교 함유 처방단 중 연교승마탕과 회춘양 격산의 75 % EtOH 수용액 추출물 및 분획물들을 희석하여 처리한 후 염증 반응 유도 인자인 LPS를 1 µg/mL 의 농도로 처리하여 24 h 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 PGE2 ELISA kit를 이용하여 PGE2 생성 정도를 측정하였다.
- 배양 후 배양액을 TNF-α ELISA kit를 이용하여 TNF-α 생성 정도를 측정하였다.
- 배양 후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 연교 함유 처방단 중 연교승마탕과 회춘양 격산의 75 % EtOH 수용액 추출물 및 분획물들을 희석하여 처리한 후 염증 반응 유도 인자인 LPS를 1 µg/mL 의 농도로 처리하여 24 h 동안 배양하였다.
- 배양 후 배지를 제거하고, 무혈청 배지에 연교 함유 처방단 중 연교승마탕과 회춘양 격산의 75 % EtOH 수용액 추출물 및 분획물들을 희석하여 처리한 후 염증 반응 유도 인자인 lipopolysaccharide (LPS)를 1 µg/mL의 농도로 처리하여 24 h 동안 배양하였다.
- 대조군은 시료 대신 정제수를 넣으며, xanthine oxidase 대신에 정제수를 넣어 색보정값을 얻었다. 소거율은 DPPH radical 소거율에 사용된 식에 따라 계산하였으며, 그 결과는 활성산소를 50%소거할 수 있는 농도(IC50)로 나타내었다.
- 배양 후 MTT assay를 통해 정상 사람 섬유아세포에서의 생존력을 알아보았다. 연교를 함유한 처방단 중 연교승마탕과 회춘양 격산의 75 % EtOH 수용액 추출물들과 분획물들을 농도별로 무혈청 배지에 희석하여 교체한 후, Raw 264.7 세포의 생존력을 알아보았다.
- 연교승마탕과 회춘양격산 처방에 공통으로 함유된 연교, 작약, 감초, 길경의 주요성분 중 항염 작용을 하는 glycyrrhizin, paeoniflorin, baicalin, berberrin와 주 약재연교의 성분인 matairesinol, matairesinoside, arctigenin, arctiin, forsythiaside, acetoside의 함량을 측정하였다. Table 2의 실험 조건에서 측정결과 glycyrrhizin, paeoniflorin, forsythiaside, acetoside는 함량이 측정되지 않았다.
- 연교승마탕과 회춘양격산 추출물의 NO 생성 저해능을 확인하고 또 다른 염증 유발 매개체인 PGE2의 생성 억제 효능을 평가하였다. LPS로 활성화된 Raw 264.
- 추출여액을 여과지로 여과하고 회전식 증발 건조기로 감압·농축하여 에탄올 및 열수추출물을 얻었다. 이 중 75% EtOH 수용액 추출물에 증류수 및 10 % EtOH 수용액을 가하여 가용화한 후 동량의 에틸아세테이트(EtOAc), 메틸렌클로라이드(CH2Cl2)를 첨가하여 용매분획을 실시하여 분획물을 얻었다.
- 연교의 항산화 활성[3-5], 항염증 효과[7] 및 주름개선 효과[10]에 대한 생리활성은 알려진 바 있다. 이에 기성한의서 11종을 바탕으로 연교를 포함한 처방단 중 피부염과 관련 있는 4종의 처방단을 선정하여 피부 자극 완화를 위한 화장품 소재로서의 가능성에 대해 평가하였다. 연교를 포함한 처방단 추출물들 대부분에서 항산화 효과가 있음을 확인하였으며, 연교승마탕, 청열소독음, 회춘양격산 추출물에서 lipoxygenase 저해 효과를 알 수 있었다.
- 처방단 개개 약재의 주요성분을 조사하여 항염 활성이 알려진 화합물에 대한 분석을 위해 고속액체크로마토그래피(HPLC)를 행하였다. HPLC 분석 조건은 Agilent Technologies의 1,200 series HPLC, 칼럼은 Luna C18 (0.
- 피험자로 18세 이상으로 선정기준에 부합하고 제외기준에 해당되지 않는 여성 30명을 선정하였다. 첩포시험은 피험자의 등 부위에 시험물질을 도포하여 48 h와 72 h 후 제거하였으며, 제거 30 min 후와 24 h 후 관찰하였다. 판정은 Frosch & Kligman[15]와 Fragrance Association (CTFA)[16] 가이드라인을 반영한 Table 3의 기준에 따라 시행하였다.
- 추출여액을 여과지로 여과하고 회전식 증발 건조기로 감압·농축하여 에탄올 및 열수추출물을 얻었다.
- 연교를 포함한 처방단들이 화장품 소재로 사용되었을시 안전한 소재임을 평가하기 위하여 섬유아세포의 생존력을 평가하였다. 항산화 효과와 lipoxygenase 활성 저해 효과에서 양호하게 평가되었던 각각 처방단들의 75 % EtOH 수용액 추출물에 대해 알아보았다. 4종의 처방단 모두에서 50 µg/mL의 농도까지 세포생존력이 약 90 %이상으로 나타났으며, 연교음과 회춘양격산의 75 % EtOH 수용액 추출물에서는 세포증식 효과도 볼 수 있었다(Figure 4a).
대상 데이터
- HPLC 분석 조건은 Agilent Technologies의 1,200 series HPLC, 칼럼은 Luna C18 (0.5 µm, 46 mm LD × 250 mm), 검출기는 자외부흡광광도계로 측정파장은 280 nm로 하였다.
- 기성한의서 11종을 바탕으로 문헌적으로 검색하여 아토피 및 피부 질환과 가장 연관이 있을 것으로 판단되는 연교 함유 처방단 4종; 연교승마탕(yeongyoseungmatang : YGSMT), 연교음(yeongyoeum : YGE), 청열소독음(cheongyeolsodokeum : CYSDE), 회춘양격산(hoechunyangkyeoksan : HCYKS)을 선정하였다(Table 1). 4가지 연교 함유 처방단을 각 총 50 g을 정량하여 추출기에 넣은 후, 25, 50, 75, 100 % 에탄올(EtOH) 및 정제수를 사용하여 4 h 씩 2회 반복 환류 냉각 ⋅ 추출하였다.
- 세포주는 Raw 264.7 세포(한국 세포주 은행; Korean cell line bank, Korea)와 normal human fibroblast (CoseedbioPharm Co., LTD.)를 각각 분양 받아 사용하였다. 10% fetal bovine serum (FBS, HyClone Lab.
- 실험에 사용된 시약들은 dimethyl sulfoxide (DMSO), 1,1-diphenyl-2-picryl- hydrazyl (DPPH), xanthine, xanthine oxidase, lipoxygenase, linolenic acid, lipopolysaccharide (LPS), 3-(4,5-dimethylthiazo-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT)는 Sigma (USA)에서 구입하여 사용하였고, nitric oxide (NO) detection kit는 iNtRON Biotechnology (Korea), prostaglandin E2 (PGE2)와 TNF-α immunoassay kit는 각각 R&D system (USA), eBioscience (USA)에서 구입하였다.
- 피험자로 18세 이상으로 선정기준에 부합하고 제외기준에 해당되지 않는 여성 30명을 선정하였다. 첩포시험은 피험자의 등 부위에 시험물질을 도포하여 48 h와 72 h 후 제거하였으며, 제거 30 min 후와 24 h 후 관찰하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 평균 ± 표준편차로 표기하였고 통계적 유의성은 SPSS를 이용한 Student's t-test로 하였으며 p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
이론/모형
- 연교를 포함한 처방단 추출물에 대한 피부 안전성, 즉 피부반응의 관찰을 통해서 자극 혹은 알레르기성 반응의 발생 여부를 알아보기 위하여 한국식품의약품안전청 기준 피부안전성 검사법에 따라 인체 피부 일차자극시험을 실시하였다.
- 판정은 Frosch & Kligman[15]와 Fragrance Association (CTFA)[16] 가이드라인을 반영한 Table 3의 기준에 따라 시행하였다.
- 활성산소(superoxide anion) 소거 활성 평가는 Noro 등의 방법을[14] 활용하여 xanthine / xanthine oxidase 효소반응에 의한 활성산소 발생계를 이용하여 활성산소에 의한 nitroblue tetrazolium (NBT)의 산화에 의한 흡광도 변화를 측정하였다. 0.
성능/효과
- 4종의 처방단 모두에서 50 µg/mL의 농도까지 세포생존력이 약 90 %이상으로 나타났으며, 연교음과 회춘양격산의 75 % EtOH 수용액 추출물에서는 세포증식 효과도 볼 수 있었다(Figure 4a).
- 4종의 처방단 중 항산화 효과와 lipoxygenase 활성 저해 효과에서 상대적으로 우수하게 평가된 연교승마탕과회춘양격산의 75 % EtOH 수용액 추출물과 분획물의 Raw 264.7 세포에 대한 생존력을 평가한 결과 10 µg/ mL 농도까지 약 80 %의 생존력을 나타내었다.
- 7 세포에 LPS를 처리하여 주고 세포배양 배지 내에 존재하는 NO의 생성 양을 NO detection kit로 측정하였다. LPS 처리시 NO 생성량이 약 10배 증가하는 것을 확인하였다. 연교승마 탕[17]과 회춘양격산의 EtOAc 및 CH2Cl2 분획물에서 유의성 있게 NO 생성이 감소하였으며, 회춘양격산 CH2Cl2분획물은 10 µg/mL의 농도에서 33.
- 의 생성 억제 효능을 평가하였다. LPS로 활성화된 Raw 264.7 세포에서 PGE2의 생합성이 급격히 증가함을 확인하였다. 연교승마탕과 회춘양격산 추출물의 효능을 확인한 결과 농도 의존적으로 PGE2 생성이 억제됨을 볼 수 있었다.
- 각각 동량의 추출물에 대한 lipoxygenase 활성 저해 효과를 알아본 결과, 연교승마탕 75 % EtOH 수용액 추출물의 lipoxygenase 활성 저해 효과가 65.9 ± 5.8 %로 상대적으로 가장 우수하였다.
- Table 2의 실험 조건에서 측정결과 glycyrrhizin, paeoniflorin, forsythiaside, acetoside는 함량이 측정되지 않았다. 각각의 추출물들은 75% EtOH 수용액 추출물에 비해 분획물에서 성분들의 함량이 높게 측정되었다. 연교 승마탕의 CH2Cl2 분획물에서는 arctigenin과 matairesinol 을 6 % 이상 함유하고 있었다.
- 7 세포를 이용한 항염 효능을 평가한결과 연교승마탕 추출물의 우수한 NO 생성 저해 효과와 회춘양격산 추출물의 강한 PGE2 생성 저해 효과를 확인하였다. 또한, 인체 피부 일차자극 시험 결과 처방단 추출물들은 무자극으로 판정되었다. 따라서 이와 같은 연 교를 함유한 처방단 추출물들의 항산화 및 항염 효능을 이용하여 피부 자극 완화를 위한 소재로 이용될 수 있음을 확인하였으며, 우수한 항산화 효과와 섬유아세포 증식 효과를 보인 회춘양격산은 피부 노화 방지를 위한 소재로의 이용도 가능할 것으로 생각된다.
- 피험자 30명에 대하여 실시한 인체 피부 일차자극시험 결과에 근거하여 계산된 피부 반응도를 Table 5에 나타내었다. 시험 결과 연교를 포함한 처방단 추출물들에 대한 피부반응도는 판정기준에 의하여 무자극으로 안전한 소재임을 알 수 있었다.
- 이에 기성한의서 11종을 바탕으로 연교를 포함한 처방단 중 피부염과 관련 있는 4종의 처방단을 선정하여 피부 자극 완화를 위한 화장품 소재로서의 가능성에 대해 평가하였다. 연교를 포함한 처방단 추출물들 대부분에서 항산화 효과가 있음을 확인하였으며, 연교승마탕, 청열소독음, 회춘양격산 추출물에서 lipoxygenase 저해 효과를 알 수 있었다. Raw 264.
- 연교승마탕 100% EtOH 추출물, 청열소독음 75 % EtOH 수용액 추출물, 회춘양격산 100 % EtOH 추출물에서 각각 57.1 ± 4.7, 54.6 ± 3.9, 52.8 ± 5.0 %로 lipoxygenase 활성 저해 효과를 나타내었다.
- 7 세포에서 PGE2의 생합성이 급격히 증가함을 확인하였다. 연교승마탕과 회춘양격산 추출물의 효능을 확인한 결과 농도 의존적으로 PGE2 생성이 억제됨을 볼 수 있었다. 회춘양격산 CH2Cl2 분획물은 10 µg/mL의 농도에서 약 96.
- 연교음 75 % EtOH 수용액 추출물의 DPPH 라디칼 소거 효과가 IC50 값이 49.2 ± 4.7 µg/mL로 상대적으로 가장 우수하게 나타났다.
- 연교음 75 % EtOH 수용액 추출물의 활성산소 소거 효과는 IC50 값이 516.4 ± 10.5 µg/mL로 상대적으로 가장 우수하게 나타났다.
- 회춘양격산 CH2Cl2 분획물은 10 µg/mL의 농도에서 약 96.5 ± 0.3 % PGE2 생성 억제 효과를 나타냄으로써, 앞선 연구의 연교승마탕[17]에 비해 상대적으로 유의성 있는 양호한 결과를 보였다(Figure 6).
- 회춘양격산의 EtOAc 및 CH2Cl2 분획물은 IC50 값이 각각 3.9 ± 0.3, 9.5 ± 0.1 µg/mL로 추출물보다 약 9, 20배 강한 DPPH 라디칼 소거 효과를 보였다(Figure 1b).
후속연구
- 또한, 인체 피부 일차자극 시험 결과 처방단 추출물들은 무자극으로 판정되었다. 따라서 이와 같은 연 교를 함유한 처방단 추출물들의 항산화 및 항염 효능을 이용하여 피부 자극 완화를 위한 소재로 이용될 수 있음을 확인하였으며, 우수한 항산화 효과와 섬유아세포 증식 효과를 보인 회춘양격산은 피부 노화 방지를 위한 소재로의 이용도 가능할 것으로 생각된다.
- 과량의 NO는 cyclooxygenase (COX)의 활성을 촉진시켜 prostaglandin 등의 합성을 유도하여 염증반응을 심화시키는 것으로 알려져 있다. 처방단 추출물의 PGE2 생성 저해는 NO 생성을 저해함으로써 COX의 활성을 억제시킨 결과로 사료되어지며, COX의 발현 및 활성에 대한 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
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