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문제 정의
- 인체 섬유육종세포(HT-1080) 는 활성산소종 형성과 관련된 실험에서 널리 사용되어지고있으몌2이 이에 본 연구에서 양파 추출물에 의한 증식 억제 및 항산화 효과를 알아보고자 하였다. 또한 양파 섭취가 결장암 위험을 감소시켰다는 보고[24]와 관련하여 인체 결장 암세포(HT-29) 증식에 미치는 양파 추출물의 효과를 살펴보았다. Fig.
- MTT assay를 행하였다. 인체 섬유육종세포(HT-1080) 는 활성산소종 형성과 관련된 실험에서 널리 사용되어지고있으몌2이 이에 본 연구에서 양파 추출물에 의한 증식 억제 및 항산화 효과를 알아보고자 하였다. 또한 양파 섭취가 결장암 위험을 감소시켰다는 보고[24]와 관련하여 인체 결장 암세포(HT-29) 증식에 미치는 양파 추출물의 효과를 살펴보았다.
제안 방법
- 되조록 10。μ1씩 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배 양한 후 배지는 제거한 뒤 각 시료를 RPMI 배지로 희석하여각 well당 시료를 100 μ1씩 첨가하고, 대조군에는 시료 대신 PBS를 100 μ1씩 첨가하였다. 이 plate를 다시 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다.
- DA을 각 well에 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 20분간 pre-incubation하였다. 각 well 에 시료를 처리하여 3TC, 5% CO2 incubator에서 1시간 in- cubation한 후, DCFH.DA을 없애고 세포는 다시 PBS 완충액으로 씻은 후 500 |iM H2O2를 처리 하여 시간별로 DCF fluorescence® excitation 488 nmz emission 530 nm에서 형 광 분석기로 측정하였다. 대조군들(blank군과 control군)은 시료 대신 PBS를 처리하며, control군은 500 pM H2O2를 처리를 하고, blank군은 500 pM H2O2 대신 PBS를 처리하여 측정하였다.
- 건조된 양파 분말은 실험 사용 전까지 -70℃에 냉동 보관되었다가 유기용매 추출을 위하여 acetone:methylene chlor- ide를 1:1 비율로 혼합하여 양파분말이 충분히 잠기도록 하여 24시간 방치한 후 추출하였다. 이 과정을 2회 반복하여 얻은 여액음- 40℃ 수욕 싱:에서 rotary vacuum evaporator (EYELA, Japan)을 사용하여 녾축하여 aceton/methylene chloride 추출물(A+M) 을 얻었다.
- DA을 없애고 세포는 다시 PBS 완충액으로 씻은 후 500 |iM H2O2를 처리 하여 시간별로 DCF fluorescence® excitation 488 nmz emission 530 nm에서 형 광 분석기로 측정하였다. 대조군들(blank군과 control군)은 시료 대신 PBS를 처리하며, control군은 500 pM H2O2를 처리를 하고, blank군은 500 pM H2O2 대신 PBS를 처리하여 측정하였다.
- 동결건조와 저온 진공 건조방법에 따른 각각의 양파 추출물과 그 분획물들의 인체 암세포 증식 억제효과를 조사하기 위해 MTT assay를 행하였다. 인체 섬유육종세포(HT-1080) 는 활성산소종 형성과 관련된 실험에서 널리 사용되어지고있으몌2이 이에 본 연구에서 양파 추출물에 의한 증식 억제 및 항산화 효과를 알아보고자 하였다.
- 재배한 것을 구입하였다. 두 가지 건조방법, 즉 동결건조법과 저온 진공건조법을 이용하여 양파 분말을 제조하였다. 동결건조는 -70℃ deep freezer (DC 400, Yamato, Japan)에서 24시간 냉동한 후 동결건조기를 이용하여 -45℃에서 20 Fa의 압력으로 7일간 건조시켰다.
- 배양종료 후 생성된 formazan 결정을 가라앉힌 후 깍 well에 형성된 결정이 흐트러지지 않도록 주의하면서 MTT 시약처리 배지를 제거하였다. 배지가 제거된 각 well에 formazan 결정을용해시키기 위하여 DMSO를 100 μ1씩 분주하여서 5~10 분간반응 시 켜 96 well plate용 광도계 (ELISA reader)로 540 run에서 흡광도를 측정하였다[6]. 이 흡광도는 MED} 세포에 의해 서 환원된 양을 나타내 며, 따라서 각 well에 존재하는 생존 수와 비례한다.
- 37℃ 5% CQ incubator에서 배양하였다. 세포 내 활성산소종은 DCFH-DA (dichlorodihydrofluorescin diacetate) as- say로 측정하였다[17, 3이. DCFH-DA (Sigma, USA)는 세포 내활성산소종과 반응하여 형광물질(dichlorofluorescein, DCF)을 만들어 내는 것으로 이 시약을 세포 속에 넣어 발생하는형광을 측정함으로써 세포 내의 활성산소종을 측정할 수 있다.
- 배양 중인 세포를 일주일에 2번 새로운 배지로 바꿔주었다. 일주일 후 phosphate buffered saline (PBS) 으로세척한 뒤 0.05% trypsin-0.02% EDTA (Gibco Co., USA)로 부착된 세포를 분리하여 원심분리 한 후 집적된 암세포에 배지를 넣고 피펫으로 암세포가 골고루 분산되도록 잘 혼합하여 75 mm3 cell culture flask에 10 ml 씩 일정한 수로 분할하여 주입하고 계속 6~7일마다 계대 배양하면서 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 배양하면서 실험에 사용하였다. HT-1080과 HT-29 암세포를 100 units/ml의 penicillin-streptomycin과 10% FBS가함유된 RPMI 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 배양 중인 세포를 일주일에 2번 새로운 배지로 바꿔주었다.
- 본 실험에 사용된 양파(Turbo 품종)는 경상남도 창녕군에서 재배한 것을 구입하였다. 두 가지 건조방법, 즉 동결건조법과 저온 진공건조법을 이용하여 양파 분말을 제조하였다.
- 한국 세포주 은행(서울의대)으로부터 인체 섬유육종세포 (HH-1080)와 인체 결장암세포(HT-29)를 분양 받아 본 실험실에서 배양하면서 실험에 사용하였다. HT-1080과 HT-29 암세포를 100 units/ml의 penicillin-streptomycin과 10% FBS가함유된 RPMI 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 MeaniSEM (Standard Error of Mean)으로 나타내었고 분석된 실험 데이터는 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자료로부터 one-way ANOVA® 실시하여 유의 성이 있을 경우에 post-hoc test로 Duncan's mutiple range test를 실시하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
성능/효과
- 5A). Fig. 5B에서 동결 건조된 양파 A+M 추출물과 MeOH 추출물의 억제 효과를 나타낸 것으로 두 추출물들은 500 jiM H2O2만을 처리한 control군에 비하여 지질 과산화물의 증가율이 낮았음을 관찰할 수가 있었으나 앞서 저온 진공 건조된 양파 추출물과 비교했을 경우 다소 높은 농도를 보였다. Fig.
- 05). MeOH 추출물의 경우에서도 저온 진공건조에 의해 건조된 양파 추출물이 0.5 및 25 mg/ml 첨가농도에서 동결 건조된 양파 추출물보다 높은 증식 억제효과(p<0.05)를 나타내었으며 5 mg/ml 첨가농도에서는 둘 다 67%의 암세포 증식 억제 효과를 나타내었다. Fig.
- 4는 두 가지 방법으로 건조된 양파 추출물들의 hexane, BuOH, 85% aq. MeOH, water 분획물을 10 mg/ml의 농도로 HT-29 세포에 처리했을 때 증식 억제효과를 나타낸 것으로 85% MeOH 추출물을 제외 하고 모든 분획물들에서 80% 이상의 암세포 증식 억제효과(p<0.05)를 나타내었다. 여기에서도 인체 섬유육종세포와 유사하게 동결 건조된 양파의 water 분획물과 hexane 분획물들에 의한 증식억제효과가 저온 진공건조에 의해 건조된 양파 분획물들보다 높았다(p<0.
- 05). 그 중에서 동결 건조된 양파의 water 분획물과 hexane 분획물은 저온 진공 건조된 양파의 경우보다 다소 높은 저해효과를 나타내었다(p<0.05). Fig.
- 05). 동결 건조된 양파 분말의 A+M 추출물은 저온 진공 건조된 양파 추출물에 비하여 다소 낮은 억제효과를 보였으나 5 mg/ml 첨가농도에서는 98%로 높은 억제효과를 보였다(p<0.05). MeOH 추출물의 경우, A+M 추출물과 비교했을 때 낮은 증식 억제효과를 나타내 었으나 저온 진공건조 및동결 건조된 양파 MeOH 추출물을 5 mg/ml 첨가농도로 처리했을 때 각각 43%, 37%의 암세포 증식 억제효과를 보였다(p<0.
- 저온 진공건조는 40℃에서 40 torr의 압력으로 3일간 건조시켰다. 두 가지 건조 방법에 따른 일반성분의 함량에는 거의 차이가 없었으며 동결건조와 저온 진공건조에 의한 건조 양파의 수분 함량은 각각 17.1%와 16.5%였고 생양파의 경우 수분 함량이 93.1%이며건조에 의해 조지방, 조단백질 및 조회분의 양은 농축되어증가하였다.
- 두 가지 건조방법에 의해 건조된 양파분말의 A+M 추출물 및 MeOH 추출물과 각 분획물들을 2.5 mg/ml의 농도로 HT-1080 섬유육종 세포에 처리하였을 때 지질 과산화물의 생성을 크게 억제시켰다. 저온 진공 건조법에 의한 양파 A+M 추출물과 MeOH 추출물은 첨가농도 2.
- 05). 따라서 본 연구 결과로부터 A+M 추출물과 MeOH 추출물의 경우 저온 진공 건조에 의해 건조된 양파 추출물에 의한 암세포 증식 억제 효과가 컸으며 분획물들의 경우에는 동결 건조된 양파 추출물의 억제 효과가 다소높았다. 이상의 암세포주들 이외에 Rho와 Han [3이은 폐암세포주인 NCI-H522와 NCI-H596에 대한 양파의 메탄올 추출물의 세포독성을 검토한 결과 양파 메탄올 추출물은 NCI-H522의 경우 47.
- Kwak 등[16]은 양파 메탄올 추출물은 우수한 전자 공여 효과를 나타내 었으며 pH가 낮을수록 아질산염 소거 작용이 증가하였고 고혈압의 원인인 angiotensin-I- converting enzyme (ACE) 에 대해 높은 저해효과를 나타내었다고 보고하였다. 또한 식용 유지를 이용한 양파 메탄올추출물의 산화 안정성을 검토한 결과 쇼트닝을 제외한 대두유, 옥배유, 라아드에 첨가되었을 때 과산화물가, 산가 및 thiobarbituric acid reactive substances (TBARS)값을 감소시켜 우수한 항산화 효과를 나타내었다고 언급하였다. Woo 등 [34]도 양파 에탄올 추출물은 ACE를 비롯하여 통풍과 관련된 효소인 xanthine oxidase와 미백과 관련된 tyrosinase의 활성을 저해하였다고 보고하였다.
- Kim 등[15]은 양파 열수 추출물은 p-carotene-linoleate system에서 BHT와 L-ascorbicacid보다는 낮았으나 우수한 항산화력을 보였고 금속이온을 환원시키는 환원력도 뚜렷하였다고 보고하였다. 본 연구 결과에서 나타난 양파 추출물 및 분획물들에 의한 세포 내 활성산소종의 억제효과는 이상의 연구들의 결과와 유사하였고항산화효과 실험에서는 저온 진공 건조 방법에 따른 건조 양파의 추출물 및 분획물이 동결 건조에 의해 건조된 양파 추출물 보다 다소 높은 항산화 효과를 나타내었다. 따라서 양파분말 제조에 저온 진공 건조의 도입은 저온에서 건조되어지므로 영 양소 손실의 최소화와 시간의 절약이 라는 관점에서 향후 유용하게 이용되어 질 수 있는 건조법이라고 사료된다.
- 05)를 나타내었다. 여기에서도 인체 섬유육종세포와 유사하게 동결 건조된 양파의 water 분획물과 hexane 분획물들에 의한 증식억제효과가 저온 진공건조에 의해 건조된 양파 분획물들보다 높았다(p<0.05). 따라서 본 연구 결과로부터 A+M 추출물과 MeOH 추출물의 경우 저온 진공 건조에 의해 건조된 양파 추출물에 의한 암세포 증식 억제 효과가 컸으며 분획물들의 경우에는 동결 건조된 양파 추출물의 억제 효과가 다소높았다.
- 그러나 water 분획물과 동결 건조된 양파의 BuOH 분획물의 경우 control 군보다는 지질 과산화물 농도가 낮았으나 blank군에 비해 높은 농도를 보였다. 이상의 결과로부터 건조 양파의 A+M 추출물, MeOH 추출물 및 그 분획물들이 세포 내 지질 과산화물의 생성을 억제시키는 활성이 있음을 확인하였다. Park과 Kim [25]은 철분 보충으로 인한 산화 스트레스 증가는 양파 시료의 공급으로 완화되어 체내 항산화능을 증진시켰으며간 및 뇌 조직의 항산화 지표에는 유의적이지는 않으나 양파 시료 공급흐로 钮한 항산화능의 증가 경향을 살펴 볼 수 있었다고 보고하였다.
- 5 및 5 mg/ml의 농도로 HT-1080 섬유육종세포에 처리했을 때 인체 암세포 증식 억제효과를 나타낸 것이다. 저온 진공 건조방법으로 건조된 양파 분말의 A+M 추출물은 가장 낮은 농도인 0.5 mg/ml에서부터 농도 의존적으로 HT-1080 세포의 성장을 억제시켜 2.5 mg/ml 첨가농도에서 98%의 증식 억제효과를 보였고, . 5mg/ml 첨가농도에서는 99%로 높은 억제효과를 보였다 (p<0.
- 5 mg/ml의 농도로 HT-1080 섬유육종 세포에 처리하였을 때 지질 과산화물의 생성을 크게 억제시켰다. 저온 진공 건조법에 의한 양파 A+M 추출물과 MeOH 추출물은 첨가농도 2.5 mg/ml에서 blank군과 control군과 비교하였을 때 측정 시간 120분 동안계속적으로 높은 세포 내 지질 과산화물 생성 억제 능력을 나타내었고 특히 A+M 추출물의 억제효과가 높았다(Fig. 5A). Fig.
- 3은 인체 결장 암세포(HH-29)에 대한 결과를 나타낸 것으로, 건조방법에 따른 각각의 양파 A+M 추출물들은 MeOH 추출물들과 비 교했을 때 HT-29 세포에 대한 증식 억제 효과가 대체적으로 높았다. 특히 25 mg/ml와 5 mg/ml 첨가농도에서는 저온 진공 건조된 양파 A+M 추출물이 각각 96% 및 98%의 높은 저해 효과를 보였으며 같은 농도에서 동결건조법에 따른 양파 A+M 추출물보다 그 저해효과가 높았다(p<0.05). MeOH 추출물의 경우에서도 저온 진공건조에 의해 건조된 양파 추출물이 0.
후속연구
- 따라서 양파분말 제조에 저온 진공 건조의 도입은 저온에서 건조되어지므로 영 양소 손실의 최소화와 시간의 절약이 라는 관점에서 향후 유용하게 이용되어 질 수 있는 건조법이라고 사료된다. 양파의 분말화는 양파의 과잉생산에 따른 가격폭락으로인한 농민들의 피해를 방지하고 안정적인 양파 생산을 장려하기 위해 큰 기여를 할 것이며 기능성 식품소재로 큰 활용을 할 것으로 기대된다.
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