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문제 정의
- 삼백초 에탄올추출물의 항균 활성으로는 이 등이 삼백초 에탄올 추출물 1 mg/'disc 에서 Staphylococcus aureus 에 대하여 항균력을 나타냈다고 보고하였다卽. 이에 본 연구에서는 여드름의 원인균인 Propionibacterium acnes 와 호기성 그람 양성 균주로 호흡기, 피부, 장관 등에 흔히 존재하는 상재균인 Steiiylocxcus gdermidis와 Stajiiylococcus aureus 의 세 가지 균주에 대한 삼백초 에탄올추출물의 항균 활성을 살펴보았다. 삼백초 에탄올추출물은 Prcponitecterium acnes 균주에 대해서는 항균성을 나타내지 않았고, Staphylococcus epidermidis 균주는 5mg/dics에서 그■리고 Staphylococcus aureus 균주는 lmg/disc에서 항균성을 나타냈다.
- 19) 및 진통성분20)등에 관한 연구가 있었고, 삼백초의 피부의 미백작용에 대한 연구로는 이 등m 이 버섯 타이로시네이즈 효소 활성을 억제한다고 보고하였다. 이에 본 저자는 피부의 생리활성을 위한 연구의 일환으로 삼백초의 에탄올추출물로 항산화능을 측정하고, B16흑색종세포를 DOPA염색을 통해 멜라닌과 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 관찰하여 피부 미백작용에 관한 검토를 하였다.
- 피부의 생리활성 물질 탐색을 위한 연구의 일환으로 삼백초 에탄올추출물로 항산화능을 측정하고, 멜라닌 합성 조절 기전에 미치는 영향을 조사하고자 B16ZF10 세포를 이용하여 멜라닌과 tyrosinase 활성에 미치는 영향을 관찰하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
제안 방법
- 1% (WV) L-DOPA (3, 4-Dihydroxy- L-phenylalanine)를 &) M 씩 분주하였다. 37笆에서 1 시간 동안 30분 간격으로 405 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 으로 측정하였다. 6~well 배양용기에 B16/F10 세포를 8시04 cells/well 이 되도록 분주하여 24시간동안 배양한 후 삼백초 에탄올 추출물을 25, 50, 100 嬉/ml로 처리하고 60분 후에 1(X) nN! a-MSH를 처리했다. 이것을 72시간 동안 배양하였다’ 배양 후 배양액을 제거하고 PBS로 2회 세척한 후 5 mM EDTA가 포함된 0.
- 5xl(f cells/dish 개씩 분주하여 24시간 배양한 후, 삼백초 에탄올추출물 25 始/0를 처리하고 30분 후 100 nM, a-MSH를 처리했다. 72시간 배양 후 세포를 수거하여 각 군당 5><10°개씩 취하였다. lysis buffer(5 mM EDTA, 0.
- B16/F10 세포를 6 cm 배양용기에 5시tf* cells/ml 씩 분주하여 세포를 부착시키고 삼백초 에탄올 추출물과 a-MSH(100 nM) 을 각각 처리하여 배양한 후 B16/ F10 세포의 수지상 돌기의 변화를 위상차도립현미경 (inverted phase contrast microscope, LeicaX 이용하여 관찰하였다.
- 다음 4℃, 13, 000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 tjTosmase 활성 측정에 사용하였다. 단백질 정량은 Bradford 시약(Bio-Rad, USA)으로 595 nm에서 흡광도를 측정하여 동량의 단백질 양을 계산하였다. 계산된 단백질 양과 0.
- 통하여 관찰할 수 있다. 따라서 験PA 염색을 이용하여 멜라닌세포내에 생성된 멜라닌 양을 형태학적으로 관찰하였다.
- 멜라닌 정량은 Hosei 등의 방법3을 변형하여 사용하였다. 직경 6 cm 배양용기에 1.
- 멜라닌은 멜라닌 세포의 세포소기관인 멜라닌소체 (melanosome)에서 일련의 효소 반응에 의해 생성되므로, 삼백초 에탄올주출물이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 멜라닌세포주인 B16 세포에 삼백초 에탄올추출물 25 嬉/ml을 B16세포에 처리하여 72시간 동안 배양하고, 각 군당 IxlO6 cells를 수집하여 멜라닌 양을 측정하였다.
- unit)를 형성하는데, 이는 멜라노좀의 수송에 중요한 역할을 하고 있다. 본 실험에서 삼백초 에탄올추출물이 수지상 가지돌기의 변화와 세포사멸에 미치는 영향을 확인하기 위하여 5xl04 cells/ml 의 B16 멜라닌 흑색종세포에 12.5 昭/ml 와 25 岫7ml의 시료를 처리하여 48시간 배양하고 광학현미경으로 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다. 그 결과, 현미경적인 소견은 대조군에 비하여 세포증식은 감소되었으나, 괴사나 세포손상 등의 독성을 나타내는 소견은 관찰되지 않았으며, 수지상 가지돌기를 감소시켰으며, 세포의 형태가 두꺼워졌다(Fig.
- 삼백 초 에탄올추출물의 멜라닌세 포인 B16 흑색 종 세포주의 생존율에 어떤 영향을 미치는지 알아보기 위하여 삼백초 에탄올추출물을 B16세포(1시04 cells/ well) 에 12.5, 25, 50 ws/ml의 농도로 처리한 후 24시간 배양하여 MTT assay 방법으로 생존율을 측정하였다. 실험 결과 세포 생존율은 농도 의존적으로 지속적인 감소를 보였으며, 25 輝/ml 과 50 昭/ml 에서 각각 67±6.
- 처음 두 단계 반응을 촉매하면서 시작된다. 삼백초 에탄올추출물은 B16 흑색 종세포에서 최종적인 산물인 멜라닌 생성이 억제된 것으로 나타나 멜라닌 합성에 관여하는 효소들의 활성과 관련성을 알아보기 위하여, 삼백초 에탄올추출물 12.5 嫗/ml 와 25 娼/ml를 B16세포에 처리하여 72시간 배양한 후 세포 내 tyrosinase 효소 활성을 조사하였다. 실험 결과 삼백초 에탄올추출물의 tyrosinase 활성은 대조군에 비교하여 각각 31±2.
- 삼백초 에탄올추출물을 각 시험균주를 대상으로 미리 제조한 항균시험용 고체배지에 일정량 점적한후에 항균활성을 조사하였다.
- 삼백초의 에탄올추출물에 대해서 DPPH 라디칼 소거 활성 법을 이용하여 항산화 활성을 측정하여 보았다. 실험결과, 삼백초 에탄올추출물에서 처리농도에 따라 50 嫗/ml 과 100 娼/ml 의 농도에서 각각 59+1.
- 삼백초의 잎 200 g을 100% ethanol 2, 500 iri 에 넣고 상온에서 72시간 동안 추출하여 거즈로 여과한 후 그 추출액을 50笆에서 감압 농축하여 동결건조 하였 ' 다. 최종적으로 얻어진 추출물의 평균 회수율은 5.
- 세포생존율 측정은 세포 배양판(24-well)에 B16/F10 세포([xlO, cells/well)를 1 血씩 분주하여 24시간 이상 배양 후 삼백초 에탄올추출물을 다양한 농도로 처리한 다음, 37℃, 5% CO2 하에서 72시간 배양한 후 MTT 용액(5 mg/ml, PBS)을 배양액 최종부피의 1/10 되게 첨가하였다. 3시간 후 배양액을 제거하고, 형성된 formazan 침전물을 DMSO 1 成로 녹여서 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였디'
대상 데이터
- Centrifug HA-12, Clean Bench, CO2 incubatior, Micro 17TR centrifuge는 한일기기사 제품을, ELISA reader는 Ho-TEKeXVemmt, LSA) 저〕품을 Electropharesis power supply는 Amersham BioscienceseKBuckinghanshire, UK) 제품을, ChemidocXRS image analysis는 Bio- rad사(California, USA) 제품을 사용하였다.
- Dulbecco, s Modified eagle medium(DMEM) 은 Gihco사(New York, USA) 제품을, Fetal bovine serum(FBS)은 Hyclones사(Logan, UK) 제품을 AntiRabbit tyrosinase는 Santa Cruz시-(California, USA) 제품을, Anti~Rabbit HRP antibody, Hybond-ECL Nitrocellulose membrane, Western Blotting detection reagent는 Amersham Biosciences사(London, UK) 제품을, Non-fat skim miUk는 Becton사(New Jersey, USA) 제품을 Dirnethylsulfoxide (DVBO), a-Nfelanocyte stimulating hcrmone(a- IVEH), Bovine serum albumin (BSA), Phenylmethyl sulfonyl fluoride(PMSF), Leupeptin, Aprotonia N, N, N' , N' -tetiBmethylethylered lamine(TEMED), Catech이은 Sigma사(Missouri, USA) 제품을, protein assay 시약은 Bio-rad사(California, USA)제품을 사용하였다.
- R acnes의 배양 배지는 GAM Broth(Nissui Seiyaku, Tokyo, Japan)를 사용하였으며 P. acnes는 4笆에서 보관하면서 실험 3일 전에 활성화 시켰다. 그리고 3 7℃, 5% CO2 incubator에서 배양 했다.
- 37℃, 5% CO? 하에서 12~24시간 배양한 후 disc 주변의 clear zone 크기를 측정하여 항균활성으로 나타내었다. 대조군으로 80% 에탄올을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 균주는 여드름의 원인 균인 Propionibacterium acnes (KCCM41747)와 호기성 그람 양성 균주로 호흡기, 피부, 장관 등에 흔히 존재하는 상재균인 Staphylococcus epidermidis(KCTC1917)와 Staphylococcus aureus (KCTC1927)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 삼백초는 신우약업사(서울)에서 구입한 국산 규격품을 정선하여 냉장실에 보관하면서 사용하였다.
- 한국세포주은행(서울대학교 의과대학)에서 분양받은 B16/F10 멜라닌세포를 37℃, 5% CO2 배양기에서 10% 우태아혈청이 포함된 Dulbecco's modified eagle moliuin(Gibco BRL, Gaithersburg, MD; distributed by ICDR biotedh Co. Ltd., Seoul)으로 배양하였으며 24시간 간격으로 배양액을 교체하여 log phase에 있는 세포에 삼백초 에탄올추출물을 처리한 후 생화학 및 분자생물학적 변화 실험을 수행하였다.
데이터처리
- 실험 결과는 one way ANOVA test를 이용하여 p-value를 구하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 삼백초 에탄올 추출물의 항균활성 평가는 디스크면역 확산법을 이용하였다 P. acnes 균주를 GAM 액체배지에, S. epidermidis와 S. aureus는 Nutrient 액체배지에 각 균주의 single colony를 넣고 12시간동안 배양 후 620 nm에서 흡광도를 측정하였다. P.
- 세포 내 tyrosinase 활성은 Matinez-Esparza 등의 방법으, 으로 측정하였다. 6~well 배양용기에 B16/F10 세포를 8시04 cells/well 이 되도록 분주하여 24시간동안 배양한 후 삼백초 에탄올 추출물을 25, 50, 100 嬉/ml로 처리하고 60분 후에 1(X) nN! a-MSH를 처리했다.
- 항산화활성은 l, l-diphenyl-2-piaylhydrazyl (DPPH) 을 이용하여 시료의 자유산소기 소거효과(radical scavenging effect)를 측정하는 Kweon 등의 방법24, 을 활용하였다. 메탄올로 녹인 시료를 준비한 후, DPPH 약 2 mg을 methanol 15 ml 에 녹여 0.
성능/효과
- 실험결과, 삼백초 에탄올추출물에서 처리농도에 따라 50 嫗/ml 과 100 娼/ml 의 농도에서 각각 59+1.0% 와 42±L。%의 라디칼 소거활성(scavenging activity, SC)을 나타내 농도 의존적으로 DPPH의 자유산소기소거 활성이 증가함을 보였다(Fig. 1).
- 1. 삼백초 에탄올추출물은 농도 의존적으로 DPPH 의 자유산소기 소거 활성이 증가하였다.
- 2. 삼백초 에탄올추출물의 xanthine oxidase 저해활성은 농도 의존적이었지만, 뚜렷한 차이는 나타내지 .않았다.
- 3. 삼백초 에탄올추출물은 S&rty/ocnosus epidenridis 와 Staphylococcus aureus에서 항균력을 나타내었으나 Propionibacterium acnes 균주에 대해서는 항균력을 나타내지 않았다.
- 4. 삼백초 에탄올추출물의 세포 생존율은 25 昭/虽 과 50 卷福에서 각각 67±$9%와 37±34%로 현저한 감소를 나타냈다.
- 5. 삼백초 에탄올추출물은 세포 내 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 나타났다.
- B16 흑색종세포는 DOPA 염색 시 양성 소견을 보였고, 삼백초 에탄올추출물 12.5 “g/ml 와 25 嬉/ml을 전처리한 군에서는 대조군에 비해 DOPA 염색의 강도가 현저히 약하게 나타났다(Fig. 7).
- 5 昭/ml 와 25 岫7ml의 시료를 처리하여 48시간 배양하고 광학현미경으로 세포의 형태학적 변화를 관찰하였다. 그 결과, 현미경적인 소견은 대조군에 비하여 세포증식은 감소되었으나, 괴사나 세포손상 등의 독성을 나타내는 소견은 관찰되지 않았으며, 수지상 가지돌기를 감소시켰으며, 세포의 형태가 두꺼워졌다(Fig. 4).
- 삼백초 에탄올추출물로 항균력을 측정한 결과 Staphylococcus epidennidis에서는 1 mg, 5 mg, 10 mg에서 각각 9 mm, 12 mm, 18 mm의 투명대를 형성하였고, Staphylococcus aureus 에서는 5 mg과 ]0 mg 에서 각각 16 mm와 2D mm의 투명대를 형성하였다. 그러나 여드름의 주된 원인균인 Propionibaaeriijm acnes 균주에 대해서는 어떠한 농도에서도 투명대를 형성하지 않았다(Table 1).
- 이에 본 연구에서는 여드름의 원인균인 Propionibacterium acnes 와 호기성 그람 양성 균주로 호흡기, 피부, 장관 등에 흔히 존재하는 상재균인 Steiiylocxcus gdermidis와 Stajiiylococcus aureus 의 세 가지 균주에 대한 삼백초 에탄올추출물의 항균 활성을 살펴보았다. 삼백초 에탄올추출물은 Prcponitecterium acnes 균주에 대해서는 항균성을 나타내지 않았고, Staphylococcus epidermidis 균주는 5mg/dics에서 그■리고 Staphylococcus aureus 균주는 lmg/disc에서 항균성을 나타냈다.
- 삼백초 에탄올추출물의 xanthine oxidase 저해활성을 검토해 본 결과, 저농도에서는 농도 의존적으로 약간의 활성을 나타냈지만, 뚜렸한 차이를 나타내지는 않았으나, 100 0011과 150 此/nd의 처리 농도에서 각각 86±4.7%와 84±0.1%의 xanthine oxidase 저해활성을 나타내었다(Fig. 2).
- 것으로 알려져 있다. 삼백초가 피부의 멜라닌 합성과정에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 B16 흑색종세포를 이용하여 다양한 실험을 시행한 결과, 삼백초 에탄올추출물은 멜라닌 형성에 중요하게 작용하는 tyrosinase의 활성과 최종적으로 생성되는 멜라닌 양을 억제하였으며, 또한 세포에 대한 독성효과가 있는지 관찰한 결과 B16 흑색종세포의 증식이 약간 감소되었다.
- 5 嫗/ml 와 25 娼/ml를 B16세포에 처리하여 72시간 배양한 후 세포 내 tyrosinase 효소 활성을 조사하였다. 실험 결과 삼백초 에탄올추출물의 tyrosinase 활성은 대조군에 비교하여 각각 31±2.8%, 43±5.4%로 tyrosinase 활성을 억제시키는 것으로 나타났다(Fig. 6).
- 5, 25, 50 ws/ml의 농도로 처리한 후 24시간 배양하여 MTT assay 방법으로 생존율을 측정하였다. 실험 결과 세포 생존율은 농도 의존적으로 지속적인 감소를 보였으며, 25 輝/ml 과 50 昭/ml 에서 각각 67±6.9%와 37±3.4%로 현저한 감소를 나타냈다(Fig. 3).
- 실험결과 삼백초 에탄올추출물 처리군은 대조군의 76 ±59%로 B16 흑색종세포에서 최종적인 산물인 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 나타났다(Fig. 5).
- 아울러 삼백초 에탄올추출물의 효과를 세포의 형태학적인 관찰을 통하여 확인하기 위하여 DOPA 염색을 시행한 결과, 삼백초 에탄올추출물 처리군은 대조군에 비해 DOPA 염색 양성의 강도가 감소되었다. 이는 삼백초 에탄올추출물이 tyrosinase 활성을 억제함으로써 멜라닌 형성을 억제시키는 것으로 추정된다.
- 이상의 결과를 종합하면 삼백초 에탄올추출물은 항산화 효능이 있으며, B16 흑색종세포의 tyrosinase 활성과 수지상 가지돌기의 형성 억제를 통하여 멜라닌의 생성을 감소시켜 효과적인 미백효능을 나타냈다. 따라서 삼백초 에탄올추출물은 미백기능성 피부생리활성 효능 소재로서 앞으로도 멜라닌 합성 억제효과에 대한 더욱 정확한 작용기전과 응용방법의 개발 등 더욱 체계적이고 심도 있는 연구가 필요하리라 사료된다.
- 이에 본 연구에서 DPPH 라디칼 소거 활성법을 이용하여 삼백초 에탄올추출물의 항산화 활성을 측정한 결과, 농도 의존적으로 항산화효과를 나타내었다. Xanthine oxidase 저해활성 또한 농도 의존적으로 활성을 나타냈다.
- 다. 최종적으로 얻어진 추출물의 평균 회수율은 5.655 % 정도였다. 얻어진 시료는 냉동보관 하였으며, 시료는 분주하여 dimethyl sulfoxide(DMSO, Sigma Chemical Co.
후속연구
- 따라서 삼백초 에탄올추출물은 미백기능성 피부생리활성 효능 소재로서 앞으로도 멜라닌 합성 억제효과에 대한 더욱 정확한 작용기전과 응용방법의 개발 등 더욱 체계적이고 심도 있는 연구가 필요하리라 사료된다.
- 이상의 결과 삼백초 에탄올추출물은 항산화 효능과 tyrosinase 활성과 수지상 가지돌기의 형성 억제를 통하여 멜라닌 생성을 감소시키는 미백효능을 보였으니-, 삼백초 에탄올추출물이 미백기능성 피부 생리활성 효능 소재로서 개발되기에는 멜라닌 합성 억제 효과에 대한 작용기전과 응용방법 등의 연구가 필요하리라 사료된다.
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