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문제 정의
- 본 연구는 굴 패각으로부터 추출된 콘키올린 (COS)이 LPS 로 활성화된 Raw 264.7 세포에서 나타나는 염증관련 지표들에 미치는 영향을 평가하여, COS가 면역체계에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
- 본 연구는 굴패각의 새로운 효능발굴 및 자원 재활용쩍 측면에서 굴 패각으로부터 분리한 콘키올린 (COS) 의 iNOS, COX-2, PGE2 단백질 발현 및 TNF-ct, IL-6 등의 cytokine에 미 치는 영향을 살펴보고자 실시하였다.
제안 방법
- 정량한 단백질 50 pg을 취하여 10% SDS-PAGE에 전기 영동시 킨 후 NC membrane으로 gel의 단백질을 blot시 켰다. Blocking 후 iNOS, COX-2 1차 antibody 와 반응시킨 후 2차 antibody 인 horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG 를 반응시키고 ECL detection reagents (Amersham Biosciences Corp., Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 단백질의 발현 정도를 확인하였다. Densitometric analysis를위 해 image analyzing system (Ultra-Violet Products Ltd.
- COS 0.1, 0.3 mg/M의 농도에서 LPS로 유도된 NO 생성의 감소가 콘키올린의 세포독성으로 인한 것인지를 관찰하기 위하여 COS를 0.1, 0.3 mg/nil의 동도로 쩌리하고 24시간 후 MTT assay를 실시하여 cell viability를 측정하였다. 실험결과 COS 0.
- 원심 분리하여 얻은 pellet을 증류수로 3번 washing하고 8, 000 rpm에서 4℃, 20분 동안 원심분리한후 동결 건조하였다. Crude 콘키올린을 8 M의 urea(l:50, W/V) 에 37℃에서 2시간 동안 반응시켜 가용성 콘키올린을 추출하였다 (Fig. 1). 추출된 가용성 콘키올린의 분말 굴 패각으로부터의수득률은 0.
- , Piscataway, NJ, USA)를 사용하여 단백질의 발현 정도를 확인하였다. Densitometric analysis를위 해 image analyzing system (Ultra-Violet Products Ltd., Upland, CA, USA)을 사용하였다.
- 3 mg/ml의 농도로 세포에 처리하여 6, 12, 18, 24시간의 시간대 별로 생성되는 NO의 양을 측정하였다. LPS군에서는 control군에 비교하여 NO 생성 량이 LPS 를 처리한 12, 18, 24시간 후 유의하게 증가하였으며, COS를 처리한 실험군에서는 12, 18, 24시간에서 유의한 NO 생성 저해를나타내었다(Fig. 2).
- LPS로 유도된 Raw 264.7 세포에서 COS의 NO 생성 저해능을 관찰하기 위하여 COS를 0.1, 0.3 mg/ml의 농도로 세포에 처리하여 6, 12, 18, 24시간의 시간대 별로 생성되는 NO의 양을 측정하였다. LPS군에서는 control군에 비교하여 NO 생성 량이 LPS 를 처리한 12, 18, 24시간 후 유의하게 증가하였으며, COS를 처리한 실험군에서는 12, 18, 24시간에서 유의한 NO 생성 저해를나타내었다(Fig.
- NO 생성 저해에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여 immunoblot analysis를 이용하여 세포질 내에서의 iNOS 단백질의 발현을 조사하였다. LPS 처리 시에는 iNOS 단백질의 발현이 증가되었으나, LPS에 COS 0.
- NO 생성 저해에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여 immunoblot analysis를 이용하여 세포질 내에서의 iNOS 단백질의 발현을 조사하였다. LPS 처리 시에는 iNOS 단백질의 발현이 증가되었으나, LPS에 COS 0.
- RAW 264.7 세포로부터 생성된 NO의 양은 6, 12, 18, 24시간의 시간대 별로 각각 측정하였으며, 각 실험군당 well수는 6으로하였다. 96 well plate에 세포 배 양 상등액과 Griess 시 약을 1:1로혼합하여 넣고 15분 동안 반응시킨 후 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, Huntsville, AL)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- RAW 264.7 세포에서 COS의 NO 생성 저해 정도를 관찰하기 위하여 cos를 0.1, 0.3 mg/ml의 농도로 세포에 처 리하여 생성되는 NO의 양을 측쩡하였다. LPS군에서는 control군에 비교하여 NO 생성 량이 LPS를 처 리한 12, 18, 24시간 후 유의하게 증가하였으며, COS를 처리한 실험군에서는 12, 18, 24시간에서 유의하게 NO 생성을 저해하였다.
- COS에 의한 PGE2의 생성 저해.가 COX-2 단백질 저해로 인한 것인지를 관찰하기 위하여 immunoblot analysis를 이용하여 세포질 내에서의 COX-2 단백질의 발현을 조사하였다. LPS 처리 시에는 COX-2 단백질의 발현이 증가되었으나, LPS에 COS 0.
- 3 mg/ml을 각각 넣고 1시간후 LPS (2 ug/ml)를 처리하여 배양하였다. 대조군으로 어떠한처치도 하지 않은 군은 CON군으로 설정하였다.
- 각 실험군당 well수는 6으로 하였다. 배양 후 상등액을 제거하고 DMSO를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 formazan을 용해시 킨 후 Titertek Multiskan Automatic ELISA microplate reader (Model MCC/340, HuntsvHle, AL)를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 증가시킨다. 본 실험에서 LPS는 PGE2의 생성을 유의성있게 증가시 켰으며, COS 0.1, 0.3 mg/rnle LPS로 유도된 PGE2 를 유의성 있게 감소시켰다(Fig. 6).
- LPS군에서는 control군에 비교하여 NO 생성 량이 LPS를 처 리한 12, 18, 24시간 후 유의하게 증가하였으며, COS를 처리한 실험군에서는 12, 18, 24시간에서 유의하게 NO 생성을 저해하였다. 이 실험결과가 COS의 세포독성으로 인한 컸인지를 관찰하기 위하여 COS를 0.1, 0.3 mg/nil의 , 농토로 처 리하고 24시간 후 MTT assay를 실시하여 cell viability 를 측정하였다. 실험결과 COS의 0.
대상 데이터
- Louis, MO, US A) 에서 구입하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Junsei Chemical Co., Ltd. (Tokyo, Japan)에서 구입하였으며 iNOS antibody는 BD biosciences (San Jose, CA, US A) 에서 구입하였고 COX-2 antibody는 Cayman (Ann Arbor, Mi, US A) 에서 구입하였다.
- Dulbecco's modified eagle's medium (DMEM), fetal bovine serum (FBS), penicillin, streptomycine GibcoBRL (Eggenstein, Germany)에서 구입하였다. E.
- 구입하였다. E. coli lipopolysaccharide (LPS), 3-(4/5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5- diphenyl-tetrazolium bromide (MTT), Griess reagent는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, US A) 에서 구입하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Junsei Chemical Co.
- Ostrea gigas 콘키올린 (COS)은 다음과 같이 제조하였다 (Fig. 1). 분말 굴 패각을 6.
- RAW 264.7 세포는 한국세포주은행 (KCLB, Seoul, Korea)에서 분양받아 10% FBS, 100 U/ml penicHlin, 100 ug/ml streptomycin이 함유된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. RAW 264.
데이터처리
- 실험 결과는 mean±S.D로 나타내었으며 t-test 방법흐로 통계적 유의성 검정을 조사하였다. 유의수준은 p < 0.
이론/모형
- -70℃에서 보관하였다. TNF-a, IL-6는 각각 ELISA Kit (Pierce endogen, Rockford, IL, USA)를 사용하여 측정하였고 PGE2는 R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 측정하였으며/ 실험의 방법은 manufacturers instruction에 따랐다. 각 실험군당 well수는 3으로 하였다.
성능/효과
- 이는 LPS와 COS를 동시에 처리하였을 때 PGE2의 생성이 저해된 결과와 일치함을 보여주고 있다. COS에 의한 COX-2 단백질 발현 저해는 PGE2 생성 저해와 매우 유사한 경향을 나타냄으로써 PGE2 생성 저해는 COX-2 단백질 발현 저해를 경유한 것임을 확인할 수 있었다.
- 3 mg/ml을 처리한 실험군에서는 iNOS의 발현이 현저히 감소하여, LPS와 COS를 동시에 처리하였을 때 iNOS 단백질의 양이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. COS에 의한 iNOS 단백질 발현 저해는 NO 생성 저해와매우 유사한 경향을 나타냄으로써 NO 생성 저해는 iNOS 단백질 발현 저해를 경유한 것임을 확인할 수 있었다.
- NO 생성저해에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여 immunoblot analysis를 이용하여 세포질 내에서의 iNOS 단백질의 발현을 조사하였다. LPS 처리 시에는 iNOS 단백질의 발현이 뚜렷하게 증가되었으나, LPS에 COS 0.3 mg/ml을 처리한 실험군에서는 iNOS의 발현이 현저히 감소하여, LPS와 COS를 동시에 처리하였을 때 iNOS 단백질의 양이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다. COS에 의한 iNOS 단백질 발현 저해는 NO 생성 저해와매우 유사한 경향을 나타냄으로써 NO 생성 저해는 iNOS 단백질 발현 저해를 경유한 것임을 확인할 수 있었다.
- 발현을 조사하였다. LPS 처리 시에는 iNOS 단백질의 발현이 증가되었으나, LPS에 COS 0.3 mg/ml을 처리한 실험군에서는 iNOS의 발현이 현저히 감소하여, LPS와 COS를 동시에 처리하였을 때 iNOS 단백질의 양이 감소되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 7). COX-2는 PGE2를 생성시키는데 LPS 처리 시에는 COX-2 단백질의 발현이 증가되었으나, .
- 3 mg/ml의 농도로 세포에 처 리하여 생성되는 NO의 양을 측쩡하였다. LPS군에서는 control군에 비교하여 NO 생성 량이 LPS를 처 리한 12, 18, 24시간 후 유의하게 증가하였으며, COS를 처리한 실험군에서는 12, 18, 24시간에서 유의하게 NO 생성을 저해하였다. 이 실험결과가 COS의 세포독성으로 인한 컸인지를 관찰하기 위하여 COS를 0.
- 3 mg/rnle LPS로 유도된 TNF-a 및 IL-6를 CQS농도 의존적으로 유의성 있게 감소시켰다. 따라서 COS에 의한 TNF-ct 및 IL-6의 생성 저해는 전염증성 cytokine의생성 저해를 나타내는 것임을 확인할 수 있었다.
- IL-6는 또한 염증 부위에서 항상 높은 수치를 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 실험에서 LPS는 IL-6의 생성을 유의성 있게 증가시켰으며, COS 0.1, 0.3 nig/mle LPS로 유도된 IL-6를 CCS 농도 의존적으로 유의성 있게 감소시켰다(Fig. 5).
- 증가시킨다. 본 실험에서 LPS는 PGE2의 생성을 유의성있게 증가시 켰으며, COS 0.1, 0.3 mg/rnle LPS로 유도된 PGE2 를 유의성 있게 감소시켰다(Fig. 6).
- 대식세포와 비만세포에서 분비되는 TNF-a는 종양세포에 세포독성을 나타내며 만성염증성 반응과 관련되어 있다. 본 실험에서 LPS는 TNF-a의 생성을 유의성있게 증가시 켰으며 COS 0.1, 0.3 mg/mle LPS로 유도된 TNF-a 를 콘키올린 농도 의좂적으로 유의성 있게 감소시켰다(Fig. 4).
- 3 mg/nil의 , 농토로 처 리하고 24시간 후 MTT assay를 실시하여 cell viability 를 측정하였다. 실험결과 COS의 0.1, 0.3 mg/rnl 농도에서 유의한 세포독성을 나타내었으나, COS는 세포생존율에 비교하여 NO에 대한 유의한 생성억제를 나타내었다 (p<0.05). NO 생성저해에 관한 iNOS 단백질의 관련성을 조사하기 위하여 immunoblot analysis를 이용하여 세포질 내에서의 iNOS 단백질의 발현을 조사하였다.
- 이러한 연구결과는 굴 패각 콘키올린 (COS)이 LPS로 유도된염증 모델에서 NO, cytokines, PGE2 생성 및 iNOS, COX-2 단백질 발현을 저해함으로써 유의한 항염증 효과가 있음을 보여준다.
- 본 실험에서 lps는 TNF-a 및 IL-6의 생성을 유의성 있게 .증가시켰으며 COS 0.1, 0.3 mg/rnle LPS로 유도된 TNF-a 및 IL-6를 CQS농도 의존적으로 유의성 있게 감소시켰다. 따라서 COS에 의한 TNF-ct 및 IL-6의 생성 저해는 전염증성 cytokine의생성 저해를 나타내는 것임을 확인할 수 있었다.
- 1). 추출된 가용성 콘키올린의 분말 굴 패각으로부터의수득률은 0.61%임을 확인하였다.
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