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문제 정의
- 따라서 본.연구에서는 기능성 향장소재로서 활성이 기대되는 참굴의 저온 초음파 추출물로부터 펩타이드를 분리하고, 이들 펩타이드의 향장활성을 측정함으로써 굴의 기능성 향장소재로의 활용 가능성을 확인하고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
- (8)을 변형하여 시행하였다. CCD-986sk, HEL-299, Clone M- 3 세포들을 각각 2X1O4 ceHs/well 농도로 96-well plate에 접종한 후 각 well에 시료를 투여하여 CQ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. MTT 용액 (5|ig/mL)을 첨가하고 4시간 후 원심 분리하여 상등액을 제거하고 10L acid-iso-propanol(l% 0.
- PGE2 생성량은 Prostaglandin E, Express EIA Short kit(ACETM, 155019)를 이용하여 측정하였다(16). 항 PGE, 항체가 부착되어 있는 plate의 각 well에 회수한 상층액과 함께 PG^-acetylcho- linesterase tracer를 넣어 상온에서 18시간 배양한 후, 각 well에 남아있는 용액을 말끔히 털어낸 후, 0.
- 05% tween 20-phosphate buffer solution으로 각 well을 5회 세척하고 Ellman 시약 200 |1L 를 각 well에 넣은 후 7시간 배양하여 405nm에서 흡광도를 측정하였다. PGE^를 표준품으로 검량선을 작성하여 각 시료를 처리한 배양액 중의 PGE2 생성량을 구하였다.
- )로 여과하고 fraction별로 구분하였다. Spectrophotometer 측정을 통해 O.D값이 증가하는 시점을 기준으로 주피크를 모아 다시 MALDI-TOF MS(V3yager-DE™ PRP, Perseptive Biosystems, Framingham, MA, US A) 를 이용하여 분자량을 확인하였으며, 분자량별로 분리하여 시료로 사용하였다.
- 굴 단백질은 broad-range pre-stained marker(DokDo-Mark™, EBM-1032, Elpis-biotech, Daejeon, Korea)를 이용해 표지하고 SDS-PAGE(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)로 분자량을 측정한 후, lO'-lO5 Da의 분자량 부근을 용출할 수 있는 sepha- dex G-75(Sigma Chemical Co.)로 여과하고 fraction별로 구분하였다. Spectrophotometer 측정을 통해 O.
- melanin의 생성량을 비교할 수 있다(11). 따라서 본 연구에서는 추출물 투여가 Clone M-3 세포주의 멜라닌 생합성과 세포 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 세포 접종 후 3일간 시료를 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 mg/mL의 농도로 3일간 각각 처리하였다. 배지를 제거하고 세포를 PBS(phosphate buffered saline) 로 세척한 후 각 well에 ImL씩 IN NaOH를 가하고 교반하여 세포막을 융해함으로써 멜라닌 성분을 녹여 나오게 하여 가시광선 영역대 중 가장 파장이 짧은 푸른색의 가시광선 영역인 400nm에서 흡광도를 측정하여 생성량을 비교하였다(12).
- 2 mg/mL로 처리하였다. 배지는 4일 간격으로 교환해주었으며 관찰은 10일과 15일, 20일, 25일, 30일에 실시하였다. FBS와 DMEM의 양과 종류는 통일하여 오차가 없도록 하였다.
- 0 mg/mL의 농도로 3일간 각각 처리하였다. 배지를 제거하고 세포를 PBS(phosphate buffered saline) 로 세척한 후 각 well에 ImL씩 IN NaOH를 가하고 교반하여 세포막을 융해함으로써 멜라닌 성분을 녹여 나오게 하여 가시광선 영역대 중 가장 파장이 짧은 푸른색의 가시광선 영역인 400nm에서 흡광도를 측정하여 생성량을 비교하였다(12).
- 섬유아세포인 CCD-986sk에 대한 직접적 영향을 알아보고 선행된 세포독성 실험의 결과를 뒷받침하기 위하여 시료처리 후 광학현미경 (C-mount, Olympus Co., Tokyo, Japan)을 이용하여 총 30일간 형태학적 관찰을 실행하였다(9). 섬유아세포를 75T flask 에 working volume을 30ml£로 통일하여 DMEM(FBS 5%) 배지로 37℃ CO2 incubatorQeiotech Co.
- 세포 독성은 3-(4, 5-dimethythiazo-2-gl)-25-dipheny-tetrazolium bro mide(MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 즉정하는 mosmann 방법 (8)을 변형하여 시행하였다. CCD-986sk, HEL-299, Clone M- 3 세포들을 각각 2X1O4 ceHs/well 농도로 96-well plate에 접종한 후 각 well에 시료를 투여하여 CQ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다.
- 추출한 시료의 일부는 다시 초음파 주줄기 (ultrasonic extraction system, Asia industry, Incheon, Korea)를 이용하여 추출온도에서 40kHz의 초음파를 30분간 병행하였다. 얻어진 각각의 주출물들은 회전증발기(rotary vaccuum evaporator N-N series, Eyela, Japan)를 이용하여 여과 및 농축 후, 동결건조기 (Cleanvac 8B, Biotron, Bucheon, Korea)를 이용하여 -70℃, 0.1 ton에서 동결건조하여 분말 상태로 사용하였으며, 시료 중 단백질 정량을 위하여 BCA kit(Pierce Co., Rockford, IL, USA)를 이용하고 시료의 단백질 수율을 측정하였다.
- 인간 fibroblast인 CCD-986sk 세포를 10% FBS와 DMEM 배지에 현탁하여 1x10b ceiis/mL로 하였다. 이 현탁액에 aspirin을 5O|1M이 되도록 첨가하여 세포에 잔존하는 COX 효소의 활성을 비가역적으로 억제시켜 동일한 PGEj 양이 될 수 있도록 조절하였다. 다음 세포 현탁액과 시료를 96 weU 세포 배양관의 각각 well에 20gL씩 첨가하고 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 동안 UV 등에 필터를 이용하여 UVA.
- 건조한 굴은 추출 flask에 시료 200 g을 넣고 중량 대비 10배의 증류수를 넣어 수직 환류 냉각장치가 부착된 추출기를 이용하여 40℃ 에서 12시간씩 2회 반복 추출하였다. 추출한 시료의 일부는 다시 초음파 주줄기 (ultrasonic extraction system, Asia industry, Incheon, Korea)를 이용하여 추출온도에서 40kHz의 초음파를 30분간 병행하였다. 얻어진 각각의 주출물들은 회전증발기(rotary vaccuum evaporator N-N series, Eyela, Japan)를 이용하여 여과 및 농축 후, 동결건조기 (Cleanvac 8B, Biotron, Bucheon, Korea)를 이용하여 -70℃, 0.
대상 데이터
- Human dermal fibroblasts(HDFs)로 CCD-986sk(KCLB, 21947) 와 human embryonic lung cell인 HEL-299(KCLB, 10002.2), melanocyte인 Clone M-3 ceH(KCLB, 10023) 모두 동결 바이알로구입하여 각 배지에 10% fetal bovine serum(FBS), 1% penicillin- streptomycin을 첨가해 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 시료는 동해산 양식 참굴(Crassosfrea gigas)을 강원도 춘천시 소재 수협에서 구입하여 세절한 후에 열풍건조기 (mechanical circulation oven, Dong Yang Science, Bucheon, Korea)를 이용하여 3SC에서 열풍 건조하여 사용하였다. 건조한 굴은 추출 flask에 시료 200 g을 넣고 중량 대비 10배의 증류수를 넣어 수직 환류 냉각장치가 부착된 추출기를 이용하여 40℃ 에서 12시간씩 2회 반복 추출하였다.
- 세포배양에 필요한 시약으로 배지는 RPMI 1640(Gibco BRL Life Technologies, Grand Island, NY, USA), DMEM-F12(Gibco- BRL Life Technologies), DMEM(Gibco BRL Life Technologies) 을 사용하였고, 혈청은 fetal bovine serum(HyClone, Logan, Utah,USA)을 이용하였다. 그 외에 세포 배양에 필요한 시약으로 Hepes buffer(Sigma Chemical Co.
- 66, 197 Da의 주피크를 나타내었으며 양쪽으로 33, 088 Da과 13, 237 Da의 작은 피크를 확인할 수 있는데, 일반적으로 MALDI-TOF MS 피크의 값은 mass를 charge 값으로 나눈 값으로 나타내므로 각각 13, 237 Da과 33, 088 Da에 나타난 피크는 주피크인 66, 197 Da과 동일한 물질로 판단 할 수 있다. 실험에서는 주피크인 66kDa에서 분리한 펩타이드를 사용하였다.
- 발현량을 나타낸다(15). 인간 fibroblast인 CCD-986sk 세포를 10% FBS와 DMEM 배지에 현탁하여 1x10b ceiis/mL로 하였다. 이 현탁액에 aspirin을 5O|1M이 되도록 첨가하여 세포에 잔존하는 COX 효소의 활성을 비가역적으로 억제시켜 동일한 PGEj 양이 될 수 있도록 조절하였다.
데이터처리
- 실험결과는 SPSS program(ver. 12.0)의 T-test로 검정하였으며 모든 data는 평균土표준오차(mean土stamdard error)로 나타내었다.
이론/모형
- Tyrosinase 억제 효과는 dopachrome방법(13)을 이용하여 측정하였다. 150 卩L의 mushromm tyrosinase-150 unit(Sigma Chemical Co.
성능/효과
- 0 mg/mL 농도에서 각각 다음과 같은 수치를 나타내었다. HEL-299 세포에서는 각각 14.7%과 11.1 %를 나타내었으며, Cone M-3 세포에서는 22.4%와 22.8%를 나타냈고, CCD-986sk 세포에서는 모두 13% 이하의 세포독성을 나타내었다. 이상의 결과들을 종합해 볼때 굴추출물이 세포 수준에서 큰 독성을 나타내지 않으며 향장소재로 사용이 가능할 것으로 사료된다.
- 8%를 나타내었으며 형태학적 차이를 나타내지 않아 굴의 저온 추출물 및 펩타이드가 식품 또는 향장 소재로서 독성을 나타내지 않는 것으로 사료된다. Melanocyte* 이용한 멜라닌 생성량 측정을 통해 굴 펩타이드의 미백활성을 탐색한 결과 최고 627%의 멜라닌 생성 저해 효과를 나타내었으며, L0mg/mL의 농도에서 tqrosinase의 활성을 35%까지 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 피부 염증과의 관계를 알아보기 위하여 실행한 PG^ 생성 량 측정의 경우 특정 수용체(EP3)와 결합하면 알레르기 증상이 억제되는 것으로 밝혀졌는데, 연구의 결과를 바탕으로 특정 펩타이드와 결합으로 인한 PGE^의 생성 억제 가능성이 있으리라 사료된다.
- UV를 조사하고 시료를 넣어주지 않은 것과 UV를 조사하지 않고 시료를 넣어주지 않은 군에서는 각각 2, 647pg/mL과 691 pg/mL PGEj 발현을 나타내었다. UV를 조사한 것과 조사하지 않은 조건 모두에서 시료 첨가 후의 PGEz의 발현도는 미첨가 대조군에 비하여 모두 낮아지는 경향을 보였으며 농도 의존적으로도 낮아지는 경향을 보여, 정제한 펩타이드 처리 시 최종 LOmg/mL의 농도에서 UV를 조사하지 않았을 경우와 UV를 조사했을 경우에 각각 560 pg/mL와 1, 000pg/mL 이하의 PEG2 발현을 나타내었다. 이러한 결과는 UV로 인하여 IL-1 과 TNF와 같은 cytokine의 분비되는 것을 특정 펩타이드가 저해하였을 가능성과 차후 PLA2 활성을 직접 저해하였을 가능성, 또는 직접적 염증 물질인 arachidonic acid 가 phospholipid에서 분비되는 최종 과정을 막았을 가능성을 나타낸다.
- 이를 sephadex G-75 컬럼을 이용하여 분리하였으며 MALDI-TOF MS를 이용하여 분자량을 검정한 결과 66kDaW로 판단하였다. 굴 추출물 및 펩타이드의 세포독성을 측정한 결과 최고농도인 1.0mg/mL에서 모두 22.8%를 나타내었으며 형태학적 차이를 나타내지 않아 굴의 저온 추출물 및 펩타이드가 식품 또는 향장 소재로서 독성을 나타내지 않는 것으로 사료된다. Melanocyte* 이용한 멜라닌 생성량 측정을 통해 굴 펩타이드의 미백활성을 탐색한 결과 최고 627%의 멜라닌 생성 저해 효과를 나타내었으며, L0mg/mL의 농도에서 tqrosinase의 활성을 35%까지 저해하는 것을 확인할 수 있었다.
- 높은 수율을 나타내었다. 분리 단백질을 SDS-PAGE로 검정한 결과 70 kDa와 50 kDa 사이에 특정 피크를 나타내었다. 이를 sephadex G-75 컬럼을 이용하여 분리하였으며 MALDI-TOF MS를 이용하여 분자량을 검정한 결과 66kDaW로 판단하였다.
- UV를 조사한 것과 조사하지 않은 조건 모두에서 시료 첨가 후의 PGEz의 발현도는 미첨가 대조군에 비하여 모두 낮아지는 경향을 보였으며 농도 의존적으로도 낮아지는 경향을 보여, 정제한 펩타이드 처리 시 최종 LOmg/mL의 농도에서 UV를 조사하지 않았을 경우와 UV를 조사했을 경우에 각각 560 pg/mL와 1, 000pg/mL 이하의 PEG2 발현을 나타내었다. 이러한 결과는 UV로 인하여 IL-1 과 TNF와 같은 cytokine의 분비되는 것을 특정 펩타이드가 저해하였을 가능성과 차후 PLA2 활성을 직접 저해하였을 가능성, 또는 직접적 염증 물질인 arachidonic acid 가 phospholipid에서 분비되는 최종 과정을 막았을 가능성을 나타낸다. 또한 각 효소 또는 단백질에 경쟁적 binding함으로 인한 활성의 감소 또는 증강으로 인한 결과로 추측할 수도 있다.
- 분리 단백질을 SDS-PAGE로 검정한 결과 70 kDa와 50 kDa 사이에 특정 피크를 나타내었다. 이를 sephadex G-75 컬럼을 이용하여 분리하였으며 MALDI-TOF MS를 이용하여 분자량을 검정한 결과 66kDaW로 판단하였다. 굴 추출물 및 펩타이드의 세포독성을 측정한 결과 최고농도인 1.
- 81%보다 약 11% 이상 추출 수율의 증진을 보였다. 조추출물의 조단백질 함량 또한 초음파 처리된 시료가 65%로 대조군의 59%에 비해 높은 함량을 나타냄에 따라 참굴의 추출에서 초음파 병행을 통해 고형분 및 단백질의 추출 수율을 증진할 수 있음을 확인하였다.
- 참굴 유래 단백질을 broad-range pre-stained marker를 표지하여 SDS-PAGE로 분자량을 측정한 결과, Fig. 1에서 보는 바와 같이 240-140kDa의 영역대에서 잔피크가 나타났으며 70kDa과 50 kDa 사이에서 특정 주피크를 나타내었다. 240 kDa과 140 kDa에 걸쳐서 나타난 피크는 굴의 단백질이 일반적으로 100kDa의 분자량을 가지는 것을 감안하면 굴의 단백질이 그대로 용출되었을 가능성이 크며 단백질에 비해 저분자인 펩타이드의 향장활성 탐색을 목표로 하였으므로 이후의 실험에서는 배제하고 수행하였다.
- 나타내었다. 초음파를 병행한 시료군의 주줄 수율이 52.49%로 초음파를 처리하지 않은 시료군의 40.81%보다 약 11% 이상 추출 수율의 증진을 보였다. 조추출물의 조단백질 함량 또한 초음파 처리된 시료가 65%로 대조군의 59%에 비해 높은 함량을 나타냄에 따라 참굴의 추출에서 초음파 병행을 통해 고형분 및 단백질의 추출 수율을 증진할 수 있음을 확인하였다.
- 초음파를 병행한 참굴 시료로부터 조단백질의 수율은 34% 이상으로 높은 수율을 나타내었다. 분리 단백질을 SDS-PAGE로 검정한 결과 70 kDa와 50 kDa 사이에 특정 피크를 나타내었다.
- 측정 시 세포생존율에는 큰 변화가 없었으며, 시료 첨가를 통한 멜라닌 생성량은 모든 시험군의 결과에서 농도 의존적으로 멜라닌 생성량을 감소시키는 것으로 나타났다. 최고농도인 1.0 mg/mL에서 40℃ 열수 추출물 및 초음파 병행추출물, 분리 펩타이드가 각각 84.0%, 82.5%, 62.7%로 대조군인 ascorbic acid가 나타낸 86.7%를 상회하는 것으로 나타났다. 특히 굴에서 분리한 펩타이드가 다른 시료들에 비해 높은 활성을 나타내었으며, 초음파 처리를 한 시료가 처리하지 않은 시료보다 더 높은 활성을 나타내어 초음파 처리를 통해 멜라닌 생성 억제활성에 증진 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다.
- 5에 나타내었다. 측정 시 세포생존율에는 큰 변화가 없었으며, 시료 첨가를 통한 멜라닌 생성량은 모든 시험군의 결과에서 농도 의존적으로 멜라닌 생성량을 감소시키는 것으로 나타났다. 최고농도인 1.
- 7%를 상회하는 것으로 나타났다. 특히 굴에서 분리한 펩타이드가 다른 시료들에 비해 높은 활성을 나타내었으며, 초음파 처리를 한 시료가 처리하지 않은 시료보다 더 높은 활성을 나타내어 초음파 처리를 통해 멜라닌 생성 억제활성에 증진 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 향장 미백과 관련이 깊은 멜라닌 생성량 측정을 통하여 굴 추출물 및 굴로부터 분리한 펩타이드가 향장 피부미백용 기능성 소재로 활용 가능성이 있음을 확인 할 수 있었다.
- 특히 굴에서 분리한 펩타이드가 다른 시료들에 비해 높은 활성을 나타내었으며, 초음파 처리를 한 시료가 처리하지 않은 시료보다 더 높은 활성을 나타내어 초음파 처리를 통해 멜라닌 생성 억제활성에 증진 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 향장 미백과 관련이 깊은 멜라닌 생성량 측정을 통하여 굴 추출물 및 굴로부터 분리한 펩타이드가 향장 피부미백용 기능성 소재로 활용 가능성이 있음을 확인 할 수 있었다.
후속연구
- 이는 직접적인 tyrosinase와의 연계성을 나타내는 결과로 참굴의 수용성 주출물 중 일부가 멜라닌합성 억제는 물론 tyrosinase 억제 활성의 기전임을 알 수 있다. 더욱이 농도 의존적으로 나타남에 따라 특정물질의 작용으로 볼 수 있으며 차후 물질 검정 단계를 거쳐 기존의 항장 소재들과의 정량적 비교가 필요할 것으로 사료된다.
- 8%를 나타냈고, CCD-986sk 세포에서는 모두 13% 이하의 세포독성을 나타내었다. 이상의 결과들을 종합해 볼때 굴추출물이 세포 수준에서 큰 독성을 나타내지 않으며 향장소재로 사용이 가능할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과를 통해 굴의 수용성 추출물 및 펩타이드가 미백 활성 및 피부면역에 활성을 가짐을 확인하였을 뿐 아니라 우리나라 참굴이 기존 화학합성물을 대체할 수 있는 천연 기능성 미백소재로 개발될 가능성을 가지고 있는 것으로 사료된다.
- 피부 염증과의 관계를 알아보기 위하여 실행한 PG^ 생성 량 측정의 경우 특정 수용체(EP3)와 결합하면 알레르기 증상이 억제되는 것으로 밝혀졌는데, 연구의 결과를 바탕으로 특정 펩타이드와 결합으로 인한 PGE^의 생성 억제 가능성이 있으리라 사료된다. 이상의 결과에서 시료의 활성은 농도의존적으로 경향을 나타남에 따라 특정 물질의 작용으로 불 수있으며 melanocyte의 멜라닌 생성량 저해능과 더불어 향후, 보다 면밀한 정제를 통한 물질 검정의 단계를 거치면 천연 피부미백용 향장소재로서 피부미백 및 피부 면역 활성을 안전하게 향상시킬 수 있는 기능성 소재로 활용이 가능할 것으로 사료된다.
- 또한 각 효소 또는 단백질에 경쟁적 binding함으로 인한 활성의 감소 또는 증강으로 인한 결과로 추측할 수도 있다. 이의보다 면밀한 연구를 위하여 이후 특정 잔기를 가진 peptide의 binding을 조사하고 그 활성을 탐색하여 메카니즘을 밝히는 실험이 진행되어야 하겠다.
- 특히 최근에는 해양생물 유래 펩타이드에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 특히 천연 저분자 펩타이드 중에서 camosine이나 anserine과 같은 히스티딘계 저분자 펩타이드는 항산화능, 글리케이터 저해능, 가교결합 저해능, 자유라디칼과 금속이온 소거능이 매우 높은 것으로 보고되고 있어 세포 노화 억제물질로의 개발이 기대되고 있다. 천연 펩타이드는 세포독성 및 염증성 부작용이 적을 뿐 아니라 산소와 물에 대하여 안정성을 가짐으로써 높은 보습력을 나타냄에 따라 향장소재로의 개발이 기대된다.
- Melanocyte* 이용한 멜라닌 생성량 측정을 통해 굴 펩타이드의 미백활성을 탐색한 결과 최고 627%의 멜라닌 생성 저해 효과를 나타내었으며, L0mg/mL의 농도에서 tqrosinase의 활성을 35%까지 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 피부 염증과의 관계를 알아보기 위하여 실행한 PG^ 생성 량 측정의 경우 특정 수용체(EP3)와 결합하면 알레르기 증상이 억제되는 것으로 밝혀졌는데, 연구의 결과를 바탕으로 특정 펩타이드와 결합으로 인한 PGE^의 생성 억제 가능성이 있으리라 사료된다. 이상의 결과에서 시료의 활성은 농도의존적으로 경향을 나타남에 따라 특정 물질의 작용으로 불 수있으며 melanocyte의 멜라닌 생성량 저해능과 더불어 향후, 보다 면밀한 정제를 통한 물질 검정의 단계를 거치면 천연 피부미백용 향장소재로서 피부미백 및 피부 면역 활성을 안전하게 향상시킬 수 있는 기능성 소재로 활용이 가능할 것으로 사료된다.
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