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문제 정의
- 이 연구의 목적은 물-오일 계면에서 특이적인 lipase 활성을 측정 할 수 있는 high-throughput assay 방법을 확립 하븐- 것이다. 이 방법은 pH에 따라 형광의 세기가 변하는 fluorescein 의 특성을 이용하여 lipase의 작용으로 방출되는 지방산으로 인한 pH 변화를 fluorescein의 형광 변화로 츸정하U 록 되어 있다.
- 이번 연구의 목적은 fluorescein을 이용한 high-through- put lipase assay 방법을 개발하는 것이다. 이 방법은 fluo- rescein의 형광변화가 4-MU에 비해 더욱 넓은 pH 범위에서 이루어진다는 사실에 착안한 것이다.
제안 방법
- 0 마이크로당량의 TAG를 가수분해하는 활성으로 정의하였다. 10xTK 완충용액의 pH는 필요에 따라 변경하였으며 효소 시료의 부피 역시 물과 효소 시료를 합한 부피를 120 ㎕로 유지하며 필요에 따라 변경하였다. 반응용액이 담긴microplate를 30분간 반응시키면서 Victor3 multilabel counter (PerkinElmer, USA)를 이용하여 1 분 간격으로 형광을 측정하였다, Excitation wavelength와 emission wavelength는 각각 490 nm와 514 nm로 하였으며 multilabel counter의 온도조절 장치를 이용하여 반응온도를 37℃로 유지하였다.
- 0 완충용액과 메탄올에 10 mM의농도로 녹여 냉 동실에 보관하였다. fluorescein과 4-MU 에 대해 pH 변화에 따른 형광의 세기 변화를 측정하기 위해 pH를 8.0, 7.0, 6.5, 6.0, 5.0으로 조정 한 0.1 M sodium phosphate 완충용액에 두 형광물질을 각각 1 pM의 농도로 녹여 F-2000 fluorometer (Hitachi, Japan) 로 형광을 측정하였다. 이때 bandwidth는 20 run로 하고 PM voltage는 700 V로 조정 하였다.
- 이때 bandwidth는 20 run로 하고 PM voltage는 700 V로 조정 하였다. fluorescein의 형 광을 측정 할 때는 excitation wavelength 와 emission wavelength를 각각 490 run 와 514 run 로 하고 4-MU의 경우에는 excitation wavelength와 emission wave-length를 각각 360 nm와 450 nm로 하였다.
- 5). 그러나 기질의 농도가 이와 같이 낮아진 조건에서는 시간에 따른 형 광 변화 그래프가 30분까지 직선을 유지하지 못하기 때문에 10분까지의 측정 데이터로 기울기를 구하였다.
- 4%로 하였다. 그리고 각 pH마다 C. rugosa lipase를 0, 2, 4, 6, 8, 10 unit씩 더한 여섯 종류의 반응 용액을 만들어 반응 속도를 측정하였다. 이때 pH 6.
- 0으로 다르게 조정한 세 종류의 혼합 용액을 만들었다. 그리고 각 pH마다 lipase를 0, 2, 4, 6, 8, 10 unit 씩 더한 여섯 종류의 반응 용액을 만들어 시간에 따른 주파수 변화를 관찰하였다. 그 결과 pH 6, 0과 7.
- 다음으로 표준 방법에 의해 서로 다른 pH에서 lipase 활성을 측정할 수 있는지 확인하기 위해 pH만 6.0과 7.0 그리고 8.0으로 다르게 조정한 세 종류의 혼합 용액을 만들었다. 그리고 각 pH마다 lipase를 0, 2, 4, 6, 8, 10 unit 씩 더한 여섯 종류의 반응 용액을 만들어 시간에 따른 주파수 변화를 관찰하였다.
- 따라서 pH 8.0의 조건에서 기질인 올리브 오일의 농도를 0.25%, 0.4%, 0.5%, 0.75%로 변화시 킨 반응 용액을 만들어 형광 변화를 관찰하였다. 그 결과 0.
- rugosa lipase는 pH 6-7 의 범위에서 활성에 큰 영향을 받지 않는 효소로 알려져 있다[1 이. 따라서 우리는 반응용액에서 기질로 사용된 올리브오일의 농도만 0.4%와 1%로 각각 증가시키고 10 unit의 lipase를 더하여 시간에 따른 형광 변화를 측정하였다. 그 결과 1%의 올리브 오일 농도에서 30분간 형광 변화가 직선으로 유지되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig.
- 3, open triangle). 따라서 이후 실험에서는 올리브 오일의 농도를 1%로 하여 표준 활성 측정 방법을 정하였다.
- 서로 다른 pH에서 표준곡선을 만들기 위해 pH를 6.0과 7.0 그리고 8.0으로 조정한 세 종류의 혼합 용액을 만들었다. 앞에서 언급한 것처럼 올리브 오일 농도를 pH 6.
- 이와 같은 오일 방울들은 효소와 접촉면적을 감소 시켜 반응속도를 느리 게 할 뿐만 아니라 표면에서 빛을 반사하여 형광 측정값을 불안정하게 할 수 있을 것이다. 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 혼합용액을 만들고 다시 한 번 10 초 동안 sonication 함으로써 다시 에멀션 상태로 전환시킨후 효소를 넣고 반응을 시작하도록 하였다. 그 결과 반응속도가 빨라졌으며 시간에 따른 형광이 규칙적으로 변하는 것을 볼 수 있었다(Fig.
- 처음에 올리브 오일의 농도를 0.2%로 하여 반응 용액을 만들고 시간에 따른 형광 변화를 측정하였다. 나머지 조건은 표준 활성 측정 방법과 동일하였고 pH는 7.
- 활성을 측정할 때마다 항상 효소를 넣지 않은 blank 용액을 만들어 각 측정값에서 blank 값을 빼 주었다. 초기반응속도를 측정하는 것이 일정한 시간이 지난 후의 형광변화를 측정하는 것보다 더 정확한 결과를 가져다 줄 수 있기 때문에 30분 또는 10분간 시간에 따른 형광변화 그래프의 기울기 값을 계산하여 반응속도를 구하였다.
대상 데이터
- Fluoresceine 10 mM stock solution을 증류수를 이용하여 사용 직전에 2 pM로 묽혀 사용하였다. 이 실험에서 사용된 Candida rugosa (C. rugosa) lipase는 Sigma에서 구입 하였으며 1 Unite pH 7.7, 37℃의 조건에서 1시 간에 1.0 마이크로당량의 TAG를 가수분해하는 활성으로 정의하였다. 10xTK 완충용액의 pH는 필요에 따라 변경하였으며 효소 시료의 부피 역시 물과 효소 시료를 합한 부피를 120 ㎕로 유지하며 필요에 따라 변경하였다.
성능/효과
- 75%로 변화시 킨 반응 용액을 만들어 형광 변화를 관찰하였다. 그 결과 0.4%까지 낮아졌을 때 형광의 세기가 효소의 농도에 비례하여 변하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 5). 그러나 기질의 농도가 이와 같이 낮아진 조건에서는 시간에 따른 형 광 변화 그래프가 30분까지 직선을 유지하지 못하기 때문에 10분까지의 측정 데이터로 기울기를 구하였다.
- 4%와 1%로 각각 증가시키고 10 unit의 lipase를 더하여 시간에 따른 형광 변화를 측정하였다. 그 결과 1%의 올리브 오일 농도에서 30분간 형광 변화가 직선으로 유지되는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 3, solid circle). 반면에 0.
- 0은 10분간 형광 변화로부터 반응 속도를 계산하였다. 그 결과 Fig. 6에서 보는 것처 럼 모든 pH에서 lipase 양에 비 례하여 반응속도가 선형으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이 방법은 pH 6-8의 범위에서 물-오일 계면에서의 lipase의 특이적인 활성을 고속으로 간편하게 측정하는데 사용될 수 있을 것으로 보인다.
- 그리고 각 pH마다 lipase를 0, 2, 4, 6, 8, 10 unit 씩 더한 여섯 종류의 반응 용액을 만들어 시간에 따른 주파수 변화를 관찰하였다. 그 결과 pH 6, 0과 7.0어서는 모든 lipase 농도에서 직선의 형광 변화가 관찰되었으며 직선의 기울기는 효소의 양에 비례하여 증가하였다. 반면에 pH 8.
- 이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 혼합용액을 만들고 다시 한 번 10 초 동안 sonication 함으로써 다시 에멀션 상태로 전환시킨후 효소를 넣고 반응을 시작하도록 하였다. 그 결과 반응속도가 빨라졌으며 시간에 따른 형광이 규칙적으로 변하는 것을 볼 수 있었다(Fig. 2, solid circle).
- 이 방법은 fluo- rescein의 형광변화가 4-MU에 비해 더욱 넓은 pH 범위에서 이루어진다는 사실에 착안한 것이다. 우리는 이번 연구를 통해 오일 에멀 션과 fluorescein을 포함하는 반응용액에 lipase 를 넣고 반응시키면 lipase의 양에 비례하여 형광 세기의 감소 속도가 증가한다는 사실을 확인할 수 있었다. 또한 반응물의 pH를 8로 조정 하였을 때뿐만 아니라 6이 나 7로 조정 하였을 때에도 그와 같은 상관관계를 관찰할 수 있었다.
- 활성의 측정은 오일 에멀션과 fluorescein 그리고 효소를 포함하는 반응 용액을 반응시키면서 일정한 간격으로 형광을 측정함으로써 이루어진다. 이 방법을 통해 형광의 세기가 효소의 양에 비례하는 속도로 감소하는 것을 관찰할 수 있었으며 시간에 따른 형광 변화 그래프로부터 계산한 반응 속도가 효소의 양에 선형으로 비 례한다는젔.을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 6에서 보는 것처 럼 모든 pH에서 lipase 양에 비 례하여 반응속도가 선형으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 이 방법은 pH 6-8의 범위에서 물-오일 계면에서의 lipase의 특이적인 활성을 고속으로 간편하게 측정하는데 사용될 수 있을 것으로 보인다.
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