[논문]유전자총에 의한 담배의 형질전환

김병오; 김경민; 오중열

유전자총에 의한 담배의 형질전환
Transformation of Tobacco by Gene-gun 원문보기

韓國資源植物學會誌 = Korean journal of plant resources, v.21 no.4, 2008년, pp.249 - 253

김병오 (경북대학교 생명자원과학대학 생물응용학과) , 김경민 (경북대학교 생명자원과학대학 환경원예학과) , 오중열 (경북대학교 생명자원과학대학 환경원예학과)

초록
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식물의 미토콘드리아에서 eukaryotic 유전자 발현하는 양상을 관찰한다는 것은 매우 중요하게 알여져 왔다. 본 실험에서는 식물의 미토콘드리아에서 발현하는 유전자와 GFP가 미토콘드리아에 발현하는지를 구명하였다. 미토콘드리아(mt)에서 발현 하는 AtBI-1 유전자와 GFP 유전자를 35S promoter를 가진 pBin vector에 재조합한 후, 유전자총을 이용한 형질전환법으로 담배의 잎과 cotyledon에 형질전환하여 재분화 된 shoot를 얻었다. mt에서 그 유전자가 발현 되는 것을 현미경하에서 GFP가 발광하는 것으로 확인하였다. 또한 PCR분석과 Southern분석에서도 미토콘드리아에서 AtBI-1 유전자가 발현함을 확인하였다. 따라서 본 연구의 결과로 mt에 관련된 유전자를 식물의 조직에 형질전환 하여 1개 이상의 유전자가 식물의 mt에 삽입되어 그 유전자의 특성이 발현되는데 이용되어 질수 있을것이라 생각된다.

Abstract ▼ AI-Helper

Since there is no report about more than one gene expression simultaneously in a single mitochondria, this report is very important to novel type of eukaryotic gene expression. In this study, investigated whether mitochondrial expressed gene and GFP that expression in mitochondria of plant expressed to mitochondria. Expression vector (pBin) containing AtBI-1 (mitochondrial expressed gene) and GFP driven by 35S promoter was bombarded by gene gun to leaves and cotyledon of tobacco. Regenerated shoot confirmed expression of AtBI-1 in mitochondria by GFP expression, PCR, and Southern analysis. Successful mitochondria of plant cell transformation in this report implies possible eukaryotic mitochondrial transformation including plants and animals, and moreover two or more gene expression which can be excellent applicable protocols to pharmaceutical field including antibody production.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

, 1999). 따라서 AtBI-1 유전자와 GFP 유전자를 식물형질전환에 가장많이 이용되는 pBin vector와 구조화 한 다음, Agrobacterium 형질전환법을 이용하지 않고 유전자총을 이용하여 담배조직에 형질전환하여 미토콘드리아에서 이 유전자가 발현되는 양상을 구명하려고 본 연구를 수행하였다.
관찰한다는 것은 매우 중요하게 알여져 왔다. 본 실험에서는 식물의 미토콘드리아에서 발현하는 유전자와 GFP가 미토콘드리아에 발현하는지를 구명하였다. 미토콘드리아(mt)에서 발현하는 AtBI-1 유전자와 GFP 유전자를 35S promoter# 가진 pBin vector에 재조합한 후, 유전자총을 이용한 형질 전환법으로 담배의 잎과 cotyledon에 형질전환하여 재분화 된 shoot를 얻었다.
4의 B에서 Southern 분석에 의해서도 재분화되는 식물조직의 genomic DNA에서는 밴드가 나타나지 않고 mtDNA에서는 1개 또는 2개의 밴드가 관찰되 었다. 이는 특이한 promoter를 이용하여 특정부위의 유전자 발현양상을 Agrobacterium 형질전환방법을 이용하여 Schoffl 등 (1989)과 Shirsat 등(1989)이 연구한 결과와 같이 유전자 총을 이용하여 목적으로 하는 조직에 유전자의 발현이 된 것과 같이 본 실험에서도 목적으로 하는 조직에 특이 유전자의 발현 방법을 확인할 수 있었다. 또한 Kim and Sul(2006)이 미토콘드리아 특이 발현 유전자인 cdf2-GFP를 효모를 이용하여 효모의 mt 발현 양상 연구와 일치하였다.

제안 방법

, 1999)를 분양받아 pUC₃₅S-NPG vector의 Sal I과 Nco I 자리에 cloning하였다. 35Spro-AtBI-GFP-NosT를 EcoR I과 Hind Ⅲ로 digestion 하여 EocR I/Hind Ⅲ로 digestion한 Bin 19 binary vector(Xiang et al., 1999)와 cloning 하였다 (Fig. 1.).
Bin-AtBI-GFP 유전자가 식물의 조직세포 중 미토콘드리아조직에서 발현양상을 조사하기 위하여 재분화 된 shoot를 이용하여 실체현미경(OLYMPUS, SEX12)의 할로겐(12V, 100W) 광원(OLYMPUS, LG-PS2)이 조사되는 곳에서 조사하였다.
8% agarose gel에 전기 영동 한 다음, capillary transfer 방법으로 nylon membrane에 전달시켰다. DNA가 전달된 membrane을 UV cross-linker로 DNA를 고정시킨 후 5X SSC, 5X Denhardt's solution, 0.1% SDS, 50mM Na-Pi(pH 6.5), 0.1mg/ml denatured salmon sperm DNA, 50% dextran sulfate가 첨가된 용액으로 42C에서 3시간 동안 prehybridization 한 다음 같은 용액에서 32P dCTP로 표식된 AtBI-1 probe를 첨가하여 12시간 이상 incubation하여 hybridization 하였다. Nylon membranee 50C의 1차 세정액(2x SSC, 0.
Genomic DNA와 mtDNA를 제한효소 EcoR I으로 절단하여 0.8% agarose gel에 전기 영동 한 다음, capillary transfer 방법으로 nylon membrane에 전달시켰다. DNA가 전달된 membrane을 UV cross-linker로 DNA를 고정시킨 후 5X SSC, 5X Denhardt's solution, 0.
2units Taq DNA polymerase를 사용하였다. PCR 반응은 PCR system 2, 700(Applied Biosystems, USA)에서 94C에서 30 초, 56C에서 30초, 72C에서 1 분으로 30cycle로 수행한 후 0.8%의 agarose를 사용하여 전기 영동 후에 증폭된 DNA band 들 을UV상에서 확인하였다.
PCR 분석에서 primer 조제는 AtBI-1 유전자의 expression 영역의 약 1.1 kB의 크기가 증폭되도록 5'-ATGGATGCGTT CTCTTCCTT-3'(FORWARD), 5'-AACAGGATTATCA TTTTCC T-3' (REVERSE)을 작성하였다. 항생제를 함유한 배지에서 재분화 된 shoot에서 분리된 20ng DNA와 10x buffer, 5mM dNTP, forward primer, reverse primer, 0.
mtDNA 추출은 Scotti(2001) 방법을 응용하여 아래와 같이 수행하였다. 재분화 된 shoot의 생체중 20mg을 16ml 튜브에 담고, 여기에 얼음에 보관된 5ml Homogenization buffer A를 넣어 16, 200rpm, 20초간 호모나제이션 하고 얼음에 보관된 5 ml Homogenization buffer B를 첨가한 후 잘 혼합하였다.
각각 추출한 genomic DNA와 mtDNA는 PCR과 Southern blot 분석을 실시하여 미토콘드리아에서 AtBI-1 유전자가 발현하는지를 확인하였다.
미토콘드리아 특이 발현 유전자를 가진 Bin-AtBI-GFP가 cloning된 E. coli host DH₅a를 10g/l trypton, 5g/l yeast extract, 5g/l NaCl이 첨가되고 pH 7.0으로 조정된 5ml LB 배지에 접종하고 37℃에서 12시간 배양한 후 QIAprep spin Miniprep kit(QIAGEN, German)로 plasmid DNA를 뽑고, UV spectrometer(UNICAM, England, UV2)의 OD 260nm 에서 DNA량을 조정하였다. 추출된 plasmid DNA를 코팅하기위하여 tungsten(Bio-Rad, USA, Tungsten M-10) 입자 60 mg을 70% EtOH로 세척하고 1ml 50% 읺ycer이로 현탁 하였다.
본 실험에서는 식물의 미토콘드리아에서 발현하는 유전자와 GFP가 미토콘드리아에 발현하는지를 구명하였다. 미토콘드리아(mt)에서 발현하는 AtBI-1 유전자와 GFP 유전자를 35S promoter# 가진 pBin vector에 재조합한 후, 유전자총을 이용한 형질 전환법으로 담배의 잎과 cotyledon에 형질전환하여 재분화 된 shoot를 얻었다. mt에서 그 유전자가 발현 되는 것을 현미경하에서 GFP가 발광하는 것으로 확인하였다.
유전자총을 이용하여 형질전환하기 위하여, 먼저 carrier bottler를 70% EtOH로 스프레이 하여 소독하고, 콤프레샤의 압력을 100 psi로 맞춘 다음 준비된 시료에 사출거 리를 10cm로 하여 실시하였다.
1 kB의 크기가 증폭되도록 5'-ATGGATGCGTT CTCTTCCTT-3'(FORWARD), 5'-AACAGGATTATCA TTTTCC T-3' (REVERSE)을 작성하였다. 항생제를 함유한 배지에서 재분화 된 shoot에서 분리된 20ng DNA와 10x buffer, 5mM dNTP, forward primer, reverse primer, 0.2units Taq DNA polymerase를 사용하였다. PCR 반응은 PCR system 2, 700(Applied Biosystems, USA)에서 94C에서 30 초, 56C에서 30초, 72C에서 1 분으로 30cycle로 수행한 후 0.

대상 데이터

18, 000rpm 20분간 centrifuge한 다음 상층 액은 버리고 20㎕ H2O를 넣고 녹인 다음 10mg/ml RNase A로 넣어 처리한 다음, 같은 량의 phen이을 넣고, ethanol 첨가하여 mtDNA를 회수하여 전기 영동에 의하여 mtDNA임을 확인한다. mtDNA 추출에 이용된 시약은 Homogenization buffer A [50mM Tris-HCl(pH₈.0), 1.3 M NaCl, 25mM EDTA(pH₈.0), 0.2% BSA, 0.05% cysteine, 56mM ^-mercaptoethanol], Homogenization buffer B [100 mM Tris-HCl(pH₈.0), 2.6 M NaCl, 50mM EDTA(pH₈.0), 0.4% BSA, 0.1% cysteine, 56mM ^-mercaptoethanol], Lysis buffer [25mM Tris-HCl (pH₈.0), 20mM EDTA(pH₈.0), 0.5% SDS], 10mg/ml Proteinase K, 2M Ammonium acetate, 10mM Tris-HCl (pH₈.0), 1mM EDTA, TE-saturated phenol/chloroform (50:50) 등을 만들어 사용하였다.
미토콘드리 아에서 발현하는 유전자인 AtBI-1(Kawai et al., 1999)를 분양받아 pUC₃₅S-NPG vector의 Sal I과 Nco I 자리에 cloning하였다. 35Spro-AtBI-GFP-NosT를 EcoR I과 Hind Ⅲ로 digestion 하여 EocR I/Hind Ⅲ로 digestion한 Bin 19 binary vector(Xiang et al.
유전자총으로 담배의 잎과 cotyledon에 코팅된 유전자를 사줄 시킨 후 50mg/l kanamycin과 0.5mg/l BAP, 0.1mg/l NAA가 함유된 MS(Murashige & Skoog, 1962) 배지로 이식하였다. 배양조건은 26±1C, 5,000 lux로 24시간 명조건으로 처리하였다.

이론/모형

재분화 된 shoot의 genomic DNA 추출 방법은 shoot의 생체중 20mg을 채취 한 후, Qiagen DNeasy Plant Mini Kit를 이용하여 DNeasy Plant Maxi 지침서에 의하여 추출하였다.

성능/효과

1 volume 2M ammonium acetate를 넣고 같은 량의 TE-saturated phenol/chloroform(50:50) 넣고 혼합한 후, 2 volume의 100% ethan이을 넣은 후 -20C에서 over- night하였다. 18, 000rpm 20분간 centrifuge한 다음 상층 액은 버리고 20㎕ H2O를 넣고 녹인 다음 10mg/ml RNase A로 넣어 처리한 다음, 같은 량의 phen이을 넣고, ethanol 첨가하여 mtDNA를 회수하여 전기 영동에 의하여 mtDNA임을 확인한다. mtDNA 추출에 이용된 시약은 Homogenization buffer A [50mM Tris-HCl(pH₈.
Bin-AtBI-GFP 유전자를 tungsten으로 코팅한 후 100 psi 로 담배의 잎과 hypocotyl 조직에 gene gun으로 사출한 후 50 ml/l kanamycin이 함유한 MS 배지에 치상한 30일 경과 후 식물체 재분화 및 식물의 미토콘드리아에서 GFP 유전자 발현을 조사한 결과이다(Table 1). 담배의 잎조직의 경우는 재분화 된 shoot가 19.
미토콘드리아(mt)에서 발현하는 AtBI-1 유전자와 GFP 유전자를 35S promoter# 가진 pBin vector에 재조합한 후, 유전자총을 이용한 형질 전환법으로 담배의 잎과 cotyledon에 형질전환하여 재분화 된 shoot를 얻었다. mt에서 그 유전자가 발현 되는 것을 현미경하에서 GFP가 발광하는 것으로 확인하였다. 또한 PCR분석과 South- ern분석에서도 미토콘드리아에서 AtBI-1 유전자가 발현함을 확인하였다.
그리고 본 실험 의 연구결과는 Pan 등(2001)이 mt와 관련 있는 유전자인 Arabidopsis thaliana ethylene-response element binding protein(AtEBP) 유전자가 효모에서의 발현양상과도 동일하였다. 따라서 지금까지 mt에 관련된 유전자를 담배의 조직을 이용하여 식물의 mt에 그 관련 유전자가 발현되는 것을 확인할 수가 있었다.
결과이다(Table 1). 담배의 잎조직의 경우는 재분화 된 shoot가 19.2% 이었고, hypocotyl의 경우는 22.8%로 나타났으며, 현미경하에서 GFP의 발현의 경우는 각각 5.4%와 6.7%로 나타났다. Shirsat 등(1989)이 보고한 완두의 성숙에 관련된 유전자를 특이 promoter와 구조한 후 Agrobacteriume 의한 형질전환 결과에서 얻어진 유전자의 발현에 성공한 실험과 같이 본 실험의 결과에서도 gene gun을 이용하여 목적으로 하는 조직에 AtBI-1 유전자가 발현됨을 확인할 수 있었다.
또한 PCR분석과 South- ern분석에서도 미토콘드리아에서 AtBI-1 유전자가 발현함을 확인하였다. 따라서 본 연구의 결과로 mt에 관련된 유전자를 식물의 조직에 형질전환 하여 1개 이상의 유전자가 식물의 mt에 삽입되어 그 유전자의 특성이 발현되는데 이용되어 질수 있을것이라 생각된다.
동일하였다. 따라서 지금까지 mt에 관련된 유전자를 담배의 조직을 이용하여 식물의 mt에 그 관련 유전자가 발현되는 것을 확인할 수가 있었다.
mt에서 그 유전자가 발현 되는 것을 현미경하에서 GFP가 발광하는 것으로 확인하였다. 또한 PCR분석과 South- ern분석에서도 미토콘드리아에서 AtBI-1 유전자가 발현함을 확인하였다. 따라서 본 연구의 결과로 mt에 관련된 유전자를 식물의 조직에 형질전환 하여 1개 이상의 유전자가 식물의 mt에 삽입되어 그 유전자의 특성이 발현되는데 이용되어 질수 있을것이라 생각된다.
유전자총으로 형 질전환 된 재분화 shoot에서 genomic DNA 와 mtDNA를 추출하여 AtBI-1 primer를 이용하여 PCR 분석을 수행한 결과(Fig. 4A), 약 1.1kb에서 밴드가 얻어졌다. 이는 재분화 된 shoot가 목적으로 하는 유전자의 발현이 되 었음을 지적해주는 것으로 생각되며, Fig.

후속연구

이상과 같이 본 실험의 연구결과는 식물의 mt 관련 연구 분야에 기초적 자료로 중요하게 제공하게 될 것으로 사료된다.

참고문헌 (14)

Cann, R. L., M. Stoneking and A. C. Wilson. 1987. Mitochondrial DNA and human evolution. Nature 325: 31-36

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Kawai, M., L. Pan, J. C. Reed and H. Uchimiya. 1999. Evolutionally conserved plant homologue of the Bax inhibitor-1 (BI-1) gene capable of suppressing Bax-induced cell death in yeast. FEBS Lett. 464: 143-147

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Kim, K. M. and I. W. Sul. 2006. Identification of artificial operon gene expression via yeast mitochondrial transformation. Kor. J. Life Sci. 16: 365-368

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Murashige, T. and F. Skoog. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-497

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Nei, M. and R. K. Kohen. 1983. Evolution of genes and proteins. In chapter 4 (Evolution of animal mitochondrial DNA), Sinauer Associates, Sunderland, Ma., USA
Pan, L., M. Kawai, L. H. Yu, K. M. Kim, A. Hirata, M. Umeda and H. Uchimiya. 2001. The Arabidopsis thaliana ethylene-response element binding protein (AtEBP) can function as a dominant suppressor of Bax-induced cell death of yeast. FEBS letters 508: 375-378

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Pehu, E. 1991. RFLP analysis of organellar genomes in somatic bybrids. In: Plant Tissue Culture Manual D6, pp. 1-8, Kluwer Academic Publishers, The Netherlands
Schoffl, F., M. Rieping, G. Baumann, M. Bevan and S. Angermuller. 1989. The function of plant heat shock promoter elements in the regulated expression of chimaeric genes in transgenic tobacco. Mo. gen. Genet. 217: 246-253

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Scotti, N., T. Cardi and L. Marechal-Drouard. 2001. Mitochondrial DNA and RNA isolation from small amounts of potato tissue. Plant Molecular Biology Reports 19: 67a-67h

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Shirsat, A., N. Wilford, R. Croy and D. Boulter. 1989. Sequences responsible for the tissue specific promoter activity of a pea legumin gene in tobacco. Mo. gen. Genet. 215: 326-331

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Strachan, O. and A. P. Read. 1996. Human Molecular Genetics, In chapter 7, BIOS Scientific Publisher Ltd., Magdalen Road, Oxford, UK
Vasil, I. K. and V. Vasil. 2006. Transformation of wheat via particle bombardment. Methods Mol. Biol. 318: 273-283

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Wolstenholmn, D. R. 1992. Animal mitochondrial DNA : Structure and evolution. Int. Rev. Cytol. 141: 173-216
Xiang, C., P. Han, I. Lutziger, K. Wang and D. J. Oliver. 1999. A mini binary vector series for plant transformation. Plant Mol. Biol. 40: 711-717

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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