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문제 정의
- 본 연구에서는 초고압 추출 공정의 활성 증진 효과를 알아보기 위해 당귀의 자외선 차단 효과 및 피부 미백활성 실험을 실시하였다. 인간의 섬유아세포인 CCD-986sk를 이용한 세포독성 실험에서 1.
- 따라서 본 연구에서는 최근 국내 식·의약품 산업에서 이용되고 있는 초고압 추출 기술을 이용하여 추출한 당귀 추출물의 자외선 차단 효과 및 피부 미백활성에 대한 증진 효과를알아보고, 더 나아가 향장소재와 관련된 분야에 활용하기 위한 기초 자료로 이용하고자 연구를 수행하였다.
제안 방법
- 또한 당귀는 혈류 개선 효과가 있어 혈액 순환을 도와 노화방지, 주름개선 및 조직재생에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서이러한 당귀의 조직재생을 통한 자외선 차단효과와 피부 미백효과에 대해 알아보기 위하여 유용성분의 효과적 용출이 기대되는 초고압 처리 후 그 효능을 비교하였다.
- 초고압 추출은 당귀 100g을 비닐 팩에 증류수와 함께 넣어 공기가 들어가지 않도록 잘 밀봉한 후, 초고압 추출 장치 (Ilshin autoclave, Korea)를 이용하여 500Mpa의 압력으로 각각 5분과 15분간 초고압 공정을 실시하였다. 초고압 추출이 끝난 당귀는 수직환류냉각기가 부착된 추출 flask에 넣고 각각 10배수가 되도록 증류수를 보충한 다음, 60℃에서 12시간 2회 반복 추출하고 초음파 추출공정을 30분 동안 병행하여 완료하였다 (Kim et al.
- 대조군으로 사용된 일반 추출물은 100g의 당귀를 수직환류냉각기가 부착된 추출 flask에 넣고 10배수의 증류수를 사용하여 60℃에서 12시간 동안 2회 반복 추출하는 방법으로 수득하였다. 얻어진 각각의 추출물들은 감압여과 후 농축·동결건조를 통해 분말을 얻어 실험에 사용하였다.
- 세포 독성은 3-(4, 5-dimethythiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide (MTT) 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 방법인 mosmann법 (Mosmann, 1983)을 변형하여 실시하였다. CCD-986sk 세포를 2×104 cells/well의 농도로 96 well plate 에 접종한 후 각 well에 시료를 투여하여 CO 배양기에서 242시간 배양하였다.
- 5×105cells/㎖의 농도로 35㎜ dish에 약 80% confluency에 도달할 때까지 배양하였다. UV 조사 전에원래의 배지를 제거한 후 PBS로 세척하여 배지 내 serum 성분을 제거한 다음 UV등 (Coralife, 35W, UV)에 필터를 이용하여 UVA (6.3J/㎠)를 24시간 조사하였다. UVA 조사 후 배양배지는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에 당귀 추출물을 1㎎/㎖의 농도로 투여하여 24시간 동안 배양하였다.
- 3J/㎠)를 24시간 조사하였다. UVA 조사 후 배양배지는 FBS를 첨가하지 않은 DMEM 배지에 당귀 추출물을 1㎎/㎖의 농도로 투여하여 24시간 동안 배양하였다.
- 150㎕의 mushroom tyrosinase-150 unit, 225㎕의 2.5mM L-tyrosine, 225㎕의 0.4M hepes buffer (pH 6.8), 그리고 300 의 ethanol 용액 혹은 시료 (1㎎/㎖) 용액을 섞은 후 배양 전과 15분간 배양 후 각각의 흡광도를 475㎚에서 측정하여 억제되는 정도를 살펴보았다. Tyrosinase의 억제정도는 다음과 같이 계산하였다.
- , 2006). 따라서 본 연구에서는 Clone M-3 세포 접종 후 3일간시료를 처리하고 배지를 제거한 다음 세포를 PBS로 세척하고, 각 well 당 1㎖의 1N NaOH를 첨가한 후 교반하여 세포막을 융해함으로써 melanin 성분을 녹여 나오게 하여, 가시광선 영역대 중 가장 파장이 짧은 푸른색 가시광선 영역인,400㎚에서 흡광도를 측정함으로써 생성량을 비교하였다.
- 당귀 추출물을 각각 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0㎎/㎖의 농도로 처리하여 48시간 배양한 후 MTT 방법으로 세포의 생존율을 관찰하였다. Fig.
- , 1997). 이러한 UVA에 의해증가되는 MMP-1 발현에 미치는 당귀 추출물의 영향을 알아보고자 HSFs에 UVA를 조사하고 시료를 첨가하여 24시간 배양한 후 MMP-1 발현 저해 효과를 ELISA로 측정하였다. 1.
- Clone M-3 세포주의 melanin 생성 세포로서 추출물 투여 시 melanin 생합성과 세포 생존율에 미치는 영향을 알아보기 위하여 각각 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0㎎/㎖의 농도로 3일간 처리하여 melanin 생성량을 측정하였다. 실험 결과 melanin 생성률은 세포생존율과 형태학적 변화 없이 15분간 초고압 처리한 60 초음파 추출물의 경우 0.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 당귀는 2006년 9월 평창에서 채취한 것을 구입하여 실온에서 음건시킨 후 분쇄하여 사용하였다.
- 얻어진 각각의 추출물들은 감압여과 후 농축·동결건조를 통해 분말을 얻어 실험에 사용하였다.
- 에서 구입하여 사용하였다. Human skin fibroblasts (HSFs) 와 melanocyte는 각각 CCD-986sk과 Clone-M3 (KCLB No. 10053.1)를 한국세포주은행 (KCLB)으로부터 동결 상태로 구입하여 이용하였다. 한국세포주은행으로부터 구입한 HSFs와 Clone M-3세포는 각각 DMEM과 RPMI1640 배지에 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone Co.
- 1)를 한국세포주은행 (KCLB)으로부터 동결 상태로 구입하여 이용하였다. 한국세포주은행으로부터 구입한 HSFs와 Clone M-3세포는 각각 DMEM과 RPMI1640 배지에 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone Co.)과 1% penicillin- streptomycin을 첨가하여 37℃, 5% CO 조건에서 배양하여사용하였다. 그 외 실험에 사용된 모든 시약들은 Sigma Chemical Co.
데이터처리
- 당귀 추출물의 자외선 차단 효과 및 피부 미백효과는 Microsoft excel의 student t-test에 의해 유의성을 검정하였다. 또한 각 활성 실험 등에 대한 각 실험결과는 triplicate determinations에 의한 Mean±SD로 표시했으며 각 평균치 간의 차이는 student t-test에 의해 p=0.
- 검정하였다. 또한 각 활성 실험 등에 대한 각 실험결과는 triplicate determinations에 의한 Mean±SD로 표시했으며 각 평균치 간의 차이는 student t-test에 의해 p=0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
- gigas on human skin fibroblast (CCD-986sk). Each value were compared with control at P<0.05 by Student t-test.
이론/모형
- UVA 조사에 의해 유도되는 MMP-1 발현량 측정은 Dunsmore등이 사용한 방법 (Dunsmore et al., 1996)을 이용하여 실시하였다. UVA를 조사 후 시료를 처리하여 24시간 배양한 배지를 96 well plate에 분주하고 4℃에서 하룻밤 동안반응시켰다.
- Tyrosinase 억제 효과는 dopachrome방법을 이용하여 측정하였다. 150㎕의 mushroom tyrosinase-150 unit, 225㎕의 2.
성능/효과
- 49%로 가장 높은 세포독성을 나타내었다. UVA 처리에 따른 MMP-1 발현 저해 효과 측정에서 1.0㎎/㎖ 첨가를 통해 15분간 초고압 처리한 60℃ 초음파 추출물이 UV를 조사하지 않은 대조군과 비교하여 122.2%를 나타내며 양성대조군인 ascorbic acid의 121.3%와 근사한 수치의 발현 억제 효과를 나타내었다. 그 외 다른 시료들도 134.
- 3%와 근사한 수치의 발현 억제 효과를 나타내었다. 그 외 다른 시료들도 134.5% 이하로 발현하며 높은 저해율을 나타냄에 따라 당귀가 UVA에 대한 MMP-1 발현 저해 효과가 있음을 나타내었다. Tyrosinase 억제 효과에서는 양성대조군인 ascorbic acid가 1.
- 4%를 나타내어 양성대조군인 ascorbic acid에 비해 더 높은 활성을 나타내었다. 이상의 결과를 통하여 당귀가 자외선 차단 및 피부 미백 관련 향장 소재로의 활용 가능성이 있으며, 초고압 처리를 통해 향장활성의증가가 가능함을 확인하였다.
- 당귀의 추출 수율은 Table 1에 나타내었다. 모든 조건 중 15분간 초고압 처리한 것이 12.24%로 5.98%를 나타낸 일반 60℃ 추출에 비해 2배 이상 높은 추출 수율을 나타내었으며, 초고압을 5분 처리한 것이 11.49%의 추출 수율을 보이며 15 분 초고압 처리와 근사한 수치를 나타내었다. 이는 초고압 처리를 통해 시료의 조직과 세포막 변형이 일어나고 용매의 세포 내 침투가 용이해지면서 이에 따른 기존 성분의 용출량 증가 및 기존의 일반 추출법으로는 용출되지 않았던 새로운 성분이 용출되기 때문인 것으로 사료된다.
- 1에 나타낸 결과를 통해 모든 조건에서 세포독성이 농도의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있다. 최고농도인 1.0㎎/㎖에서 초음파를 병행한 60℃ 추출물이 21.27% 로 가장 낮은 세포독성을 나타내었고, 15분간 초고압 처리한 60℃ 초음파 병행 추출물이 23.49%로 가장 높은 세포독성을 나타내었다. 이는 식용으로도 널리 사용되는 복분자 추출물이나 타낸 세포독성 수치 (Kwon et al.
- 이러한 UVA에 의해증가되는 MMP-1 발현에 미치는 당귀 추출물의 영향을 알아보고자 HSFs에 UVA를 조사하고 시료를 첨가하여 24시간 배양한 후 MMP-1 발현 저해 효과를 ELISA로 측정하였다. 1.0㎎/㎖의농도에서 측정한 결과, 양성대조군인 ascorbic acid가 121.3% 를 나타내어 가장 억제된 발현률을 보였고, 15분간 초고압 처리한 60℃ 초음파 병행 추출물이 ascorbic acid와 근사한 122.2%를 나타내어 시료 중에서 가장 낮은 발현률을 나타내었다. 그 외의 다른 시료들도 134.
- 2%를 나타내어 시료 중에서 가장 낮은 발현률을 나타내었다. 그 외의 다른 시료들도 134.5% 이하의 값을 나타내 비교적 낮은 발현률을 보임에 따라 당귀 추출물에 UVA에 대한 MMP-1 발현 저해 효과가 있음을 나타내었다. 이는 교원질 파괴에 관여하는 외부적 스트레스인 UVA에 의해 발생된 유해인자를 효과적으로 제거함으로써 MMP-1의 발현을 효과적으로 조절한 것이라 사료된다.
- 0㎎/㎖ 농도로 첨가 했을 때의 저해율을비교하여 Table 2에 나타내었다. 모든 시료에서 저해율이 농도의존적으로 점차 증가하는 것을 확인하였으며, 양성대조군인 ascorbic acid가 1.0㎎/㎖의 농도에서 70.8%로 가장 높은저해율을 나타낸 것을 확인할 수 있다. 당귀 시료 중에서는초고압을 15분간 처리한 60℃ 초음파 추출물이 ascorbic acid 에 근사한 수치인 69.
- 4%로 가장 높은 저해율을 나타내었다. 다른 시료들도 55% 이상의 높은 저해율을 나타냄에 따라 당귀가 피부 미백활성에 효과를 갖고 있으며, 초고압 처리를 통해 활성의 증진이 가능함을 확인할 수 있었다.
- 0㎎/㎖의 농도로 3일간 처리하여 melanin 생성량을 측정하였다. 실험 결과 melanin 생성률은 세포생존율과 형태학적 변화 없이 15분간 초고압 처리한 60 초음파 추출물의 경우 0.2~1.0㎎/㎖의 농도까지 각각 92.4%, 89.3%, 86.4%, 84.6%, 82.4%의 생성량을 나타내었다. 최고농도인 1.
- 4%의 생성량을 나타내었다. 최고농도인 1.0㎎/㎖에서 초음파 병행 60℃ 추출물과 5분 초고압 처리 60℃ 초음파 추출물이 각각 85.6%와 84.2%의 생성량을 나타냄에 따라 일반 60℃ 추출물을 제외한 당귀 추출물이 모두 86.7%의 생성량을 나타낸 양성대조군인 ascorbic acid에 비해 높은 생성 저해율을 나타내었다. 이를 통해 당귀가 melanin 생성량 억제에 효과가 있음을 확인하였다.
- 7%의 생성량을 나타낸 양성대조군인 ascorbic acid에 비해 높은 생성 저해율을 나타내었다. 이를 통해 당귀가 melanin 생성량 억제에 효과가 있음을 확인하였다.
- 인간의 섬유아세포인 CCD-986sk를 이용한 세포독성 실험에서 1.0㎎/㎖ 농도의 시료 첨가를 통해 초음파 병행 60℃ 추출물이 21.27%로 가장 낮은 세포독성을 나타내었으며, 15분간 초고압 처리한 60℃ 초음파 병행 추출물이 23.49%로 가장 높은 세포독성을 나타내었다. UVA 처리에 따른 MMP-1 발현 저해 효과 측정에서 1.
- 8% 로 가장 높은 저해율을 나타내었다. 당귀 시료 중에서는 초고압을 15분간 처리한 60℃ 초음파 추출물이 ascorbic acid에 근사한 수치인 69.4%로 가장 높은 저해율을 나타내었고, 그 외의 시료들도 모두 55% 이상의 높은 저해율을 나타내었다. 시료 첨가를 통한 Clone M-3 세포주의 melanin 생성 억제실험에서 1.
- 4%로 가장 높은 저해율을 나타내었고, 그 외의 시료들도 모두 55% 이상의 높은 저해율을 나타내었다. 시료 첨가를 통한 Clone M-3 세포주의 melanin 생성 억제실험에서 1.0㎎/㎖ 농도 첨가를 통해 15분간 초고압 처리한 60℃ 초음파 추출물이 82.4%를 나타내어 양성대조군인 ascorbic acid에 비해 더 높은 활성을 나타내었다. 이상의 결과를 통하여 당귀가 자외선 차단 및 피부 미백 관련 향장 소재로의 활용 가능성이 있으며, 초고압 처리를 통해 향장활성의증가가 가능함을 확인하였다.
후속연구
- 이는 초고압 처리를 통해 시료의 조직과 세포막 변형이 일어나고 용매의 세포 내 침투가 용이해지면서 이에 따른 기존 성분의 용출량 증가 및 기존의 일반 추출법으로는 용출되지 않았던 새로운 성분이 용출되기 때문인 것으로 사료된다. 따라서 초고압 공정을 이용하면 천연물의 효율적 추출을 통한 수율 증진 및 신물질의 용출을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
- 현재까지 밝혀진 MMP 저해제로는 tissue inhibitor of metalloproteinases-2 (TIMP-2)가 있는데, 이는 기질 세포에서 분비되며 기능은 MMP 수용체에 경쟁적으로 결합하여 MMP의 활성화를 막음으로서 단백 분해능을 떨어뜨리는 것으로 알려져 있다. 이러한 결과는 향후 피부교원질 층 붕괴로 인한 주름살의 치료제로서 향장소재 연구에중요한 실마리를 제공할 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 연구 결과를 통해 melanin 생성은 줄이면서 세포독성은 낮아야 하는 향장미백제로서 당귀의 활용 가능성이 매우높을 것으로 사료된다.
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