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문제 정의
- 그리하여 著者는 PMA와 A23187로 자극된 RBL-2H3 세포에 미치는 黃連解毒湯의 영향을 糾明하기 위하여 다음과 같이 비교연꾸하였다.
- 이에 저자띈 黃連解毒湯이 알레르기 반응에 미차는 영향에 관한 연구를 실시하였다. 항알레르기 효과를 살펴보기 위하여 실험모델로서 RBL-2H3 cell line에 PMA와 A23187로 자극하여 비만 세포에서의 알레르기반응을 유도한 뒤 이에 미치는 黃連解毒湯의 영향에 대한 연구를 실시하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 연구를 실시하였다. 항알레르기 효과를 살펴보기 위하여 실험모델로서 RBL-2H3 cell line에 PMA와 A23187로 자극하여 비만 세포에서의 알레르기반응을 유도한 뒤 이에 미치는 黃連解毒湯의 영향에 대한 연구를 실시하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- 및 2 mg/m"를 세포에 처리하였다. 1 시간동안 배양한 후 A23187 (1 pM)을 처리한 군과 처리하지 않은 군으로 나누어 처리하고 8 시간동안 배양하였다. 배양이 끝난 후에 상층액을 분리하여 5,000 rpm에서 2분간 원심분리하여 분리된 상층액을 -70t 에 보관하였다.
- 배양이 끝난 후에 상층액을 분리하여 5,000 rpm에서 2분간 원심분리하여 분리된 상층액을 -70t 에 보관하였다. I L-4 kit (BD Biosciences Pharmingen, USA)를 사용하여 ELISA법으로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 누출된 I L4의 양을 계산하였다.
- 립을 측정하는 간접적인 방법으로 널리 사용되는 방법이다. RBL-2H3 cells의 생존률에 영향을 미치지 않는 1 mg/ml과 2 mg/rnl의 HHT 농도에서 E-hexosaminidase의 activity에 미치늠 영향을 조사하였다. 그 결과 RBL-2H3 cells 로부터의 P -hexosaminidase의'출량은 정상 세포에서 6.
- 12,000 rpm에서 10 분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 pellete DEPC (diethyl pyrocarbonate)-DW 20 u1 에 녹여 RT-PCR에 사용하였다. RT-PCR kit (AccuPower RT/PCR PreMix, Bioneer, Korea)를 사용하여 94 C에서 5 분간반응시 킨 후 94C 에서 30 초간 denaturation시키고/ 56~62C 에서 30 초간 annealing시킨 다음/ 72 C 에서 1분간 extension시키는 cycle을 25~30 회 반복한 뒤/ 마지막 extensione 72 C 에서 5 분간 PCR machine (GeneAmp, PCR system 9700, USA) 에서 수행하였다. 각 PCR products는 2% agarose g이에 loading하여 100 V 조건에서 30 분간 전기영동을 통하여 분석하였다.
- RT-PCR kit (AccuPower RT/PCR PreMix, Bioneer, Korea)를 사용하여 94 C에서 5 분간반응시 킨 후 94C 에서 30 초간 denaturation시키고/ 56~62C 에서 30 초간 annealing시킨 다음/ 72 C 에서 1분간 extension시키는 cycle을 25~30 회 반복한 뒤/ 마지막 extensione 72 C 에서 5 분간 PCR machine (GeneAmp, PCR system 9700, USA) 에서 수행하였다. 각 PCR products는 2% agarose g이에 loading하여 100 V 조건에서 30 분간 전기영동을 통하여 분석하였다. 각각의 primer의 염기서열은 다음과 같다.
- 배양액을 제거한 후 5 mg/ml MTT (Amresco, USA)를 200 ml씩 각 well에 넣고 잘 섞어 준 후 최대 4 시간 37C incubator에서 배양한 후 MTT를 제거하고 DMSO (Amresco, USA)를 300 ml 씩 분주하여 well에 생성된 formazin이 잘 녹을수 있게 충분히 흔들어 모두 녹인 후 96 well plate에 150 ml 씩옮긴 후 ELISA reader (Molecular Devices, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 본 실험에서는 RBL-2H3 cells를 사용하여 세포독성과 생존율에 영향을 미치지 않는 범위에서 B-hexosaminidase의 activity, I L4와 TNF- a를 측정하여 mast cell 활성 화에 대한 黃連解毒湯의 영향을 관찰하였다.
- 4) 로 2 번 세척한 다음 각 well 당 extracellular buffer와 HHT (0, 1 및 2 mg/ml)를 처리한 후 1 시간동안 반응시켰다. 이후 PMA (50 nM)와 A23187 (1 pM)을 사용하여 세포를 37C 5% CO2 incubator에 1 시간동안 반응시키고 ice bath에서 10 분간 incubation 시켜 반응을 종결시켰다. 상층액 20 ml를 96 well plate에 옮기고, pellete triton X-100 (0.
대상 데이터
- RBL-2H3 세포는 한국세포주은행 (Korea Cell Line Bank, KCLB)에서 분양받아서 배양하였다.
- Rat basophilic leukemia cell line 인 RBL-2H3 cells는 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양받았으며, 세포의 배양을 위하여 RBL-2H3 cells는 10% heat-inactivated FBS (Gibco BRL, USA)과 1% penicillin 및 streptomycin (Gibco BRL, USA)을 포함한 DMEM (Gibco BRL, USA) 배지에서 37C, 5% CO2 조건하에서 배양하였으며 세포의 증식에 따른 과밀도 현상을 해소하기 위하여 0.05% trypsin-EDTA solution (Gibco BRL, USA)을 처리하여 세포를 부유시킨 다음 계대 배양하였다.
- 본 실험에 사용된 anti-DNP (dinitrophenyl) IgE (immunoglobulin), DNP-HSA (human serum al bumin)/ PMA (phorbol 12-myristate) 및 A23187 (Calcium Ionophore)은 Sig ma 로부터/ FBS (fetal bovine serum), penicillin, streptomycin, DMEM (Dul becco's modification Eagle medium) 및 trypsin-EDTA solutione Gibco BRL로부터/ MTT (tetrazolium bromide salt) 및 DMSO (dimethylsulfoxide)는 Amresco로부터/ I L (interleukin)/ kit 와 TNF -a kit는 BD (Biosciences Pharmingen)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 약재는 동의대학교 부속 한방병원에서 구입(주, 광명제약)하여 精選한 것을 사용하였고, 黃連解毒湯 (Hwangyounliaedog-tang, 이하 HHT)의 처방 구성씀《方藥台 編》5)을 따랐으며, 處方의 1 貼 內容과 分量은 아래와 같다 ( Table 1).
데이터처리
- 成績은 SPSS 12.0 통계 프로그램 패키지를 사용하여 평균치 - 표준오차로 나타내었고 유의수준은 PV0.05로 하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 one way-ANOVA와 Scheffe test 검정을 실시하였다.
- 05로 하였다. 각 실험군 간의 통계학적 분석은 one way-ANOVA와 Scheffe test 검정을 실시하였다.
이론/모형
- B-hexosaminidase의 activity는 Dastych 등'과 Schwartz 등, ) 의 방법에 의해 측정하였다. RBL-2H3을 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁시킨 후 24 well plate에 3 x lO'cell/well의 농도로 분주한 다음 37C 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다.
- RBL-2H3 cells were stimulated by A23187 for 8 h after pre-treated with HHT (0, 1, and 2 mg/ml). COX-1 and COX-2 mRNAs were expressed by RT-PCR method.
- 배양이 끝난 후에 상층액을 분리하여 5000 rpm에서 2 분간 원심분리하여 분리된 상층액을 -70V에 보관하였다. TNF- a kit (BD Biosciences Pharmingen, USA)를 사용하여 ELIS A법로 450 nm 에서 흡광도를 측정하여 누출된 TNF- a의 양을 계산하였다.
성능/효과
- 반면 COX-2 mRNA의 경우 정상군에서도 발현이 뚜렷하였으나 이에 비해 HHT 2 mg/ml 단독 처리한 세포에서 발현이 감소하는경향을 나타내었으며, A23187으로 자극한 세포에서 발현이 증가하는 경향을 보였다. HHT (1 and 2 mg/rnl)을 전처 리한 세포에서븐 A23187으로 자극한 세포에 비해 밸현이 감소하는 경향을 나타내었다(Fig. 5). 이러한 결과는 HHT>} COX-1의 발현을 증가시키는 동시에 COX-2를 천택적으로 억제하여 알레르기 염증을억 제하는 작용이 있는 것으로 판단된다.
- RBL-2H3 cells로부터 COX-1과 COX-2의 mRNA발현에 미치는 영향을 관찰한 결과 COX-1 mRNA의 경우 정상군에 비해 HHT 2 mg/ml 단독 처리한 세포에서 발현이 증가하였으며, A23187으로 자극한 세포와 HHT(1 and 2 mg/ml)을 전처리한군에서 모두 발현이 증가하였다. 반면 COX-2 rrNA의 경우 정상군에서도 발현이 뚜렷하였으나 이에 비해 HHT 2 mg/ml 단독 처리한 세포에서 발현이 감소하는 경향을 나타내었으며, A23187으로 자극한 세포에서 발현이 증가하는 경향을 보였다.
- RBL-2H3 cells의 독성 및 생존률에 미치는 영향을 알아보기위한 MTT assay에서 아무런 처리를 하지 않은 세포의 흡광도는 1.94 - 0.04이 었으며, HHT 1 mg/ml 2 mg/ml및 4 mg/ml의 농도를 처리한 세포에서 감각 2.00 -0.02, 2.03 -0.10, 1.88 -0.04의 흡광도를 나타내어 HHT의 모든 농도에서 유의성 있는 변화가 나타나지 않았다(Fig. 1).
- 반면 PMA와 A23187로 자극하기 1시간 전 HHT 1 mg/m2과 2 mg/mC의 농도를 처리한 세포에서.각각 13.05 -.26%와 14.97 -0.96%로 억제하는 것으로 나타났으며, PMA와 A23187로만 자극한 세포에 비하여 유의한(p<0.05) 감소를 보였다(Fig. 2).
- RBL-2H3 cells의 생존률에 영향을 미치지 않는 1 mg/ml과 2 mg/rnl의 HHT 농도에서 E-hexosaminidase의 activity에 미치늠 영향을 조사하였다. 그 결과 RBL-2H3 cells 로부터의 P -hexosaminidase의'출량은 정상 세포에서 6.68 - 0.41%이었으며, HHT 2% 단독 처리한 세포에서 7.00 -0.88%로 정상 세포에비해 유의성있는 변화가 나타나지 않았다. PMA와 A23187로 자극한 세포에서 23.
- 활성화 시킨다. 그 결과 세포 내 골격 및 세포 내 이동에 관여하는 미세소관과 미세섬유가 활성화되어 비만세포의 과립을 세포막 가까이로 이동시켜 결과적으로 세포막 융합을 일으키게됨으로써 비만세포 탈과립 및 히스타민 유리현상이 일어난다고 알려졌다
- 분비가 유의하게 억제되었다. 따라서 黃連解毒湯 추출물이 TNF- a의 발현을 억제하여 염증을 억제하는 기전을 가지고있음을 알 수 있다(Fig. 4).
- 있음을 확인하였다. 또한 COX-2를 특이적으로 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 이와 같은 결과는 mast cell 및 basopM 등의 면역세포의 탈과립을 억제하고 알레르기 염증반응과 관련된 cytokine등을 억제하는 기전에 의한 결과로 판단되며, 黃蓮解毒湯이 알레르기의 발병을 예방하고 억제하는 효과가 있을 것으로 생각된다.
- 05) 증가를 나타내었다. 반면 A23187로 자극하기 1시간 전 HHT 1 mg/ml과 2 mg/ml의 농도를 처리한 세포에서 각각 1.90 - 0.03 ng/ml과 1.39 - 0.12 ng/ml로 억제하는것으로 나타났으며, A23187로만 자극한 세포에 비하여 유의한 (p<0.05) 감소를 보였다(Fig. 3).
- 05) 증가를 나타내었다. 반면 A23187로자극하기 1시간 전 HHT 1 mg/ml과 2 mg/ml의 농도를 처리한세포에서 각각 0.95 - 0.05 ng/ml과 0.60 - 0.08 ng/ml로 억제하는 것으로 나타났으며, A23187로만 자극한 세포에 비하여 유의한(pV0.05) 감소를 보였다(Fig. 4).
- 반면 COX-2 mRNA의 경우 정상군에서도 발현이 뚜렷하였으나 이에 비해 HHT 2 mg/ml 단독 처리한 세포에서 발현이 감소하는경향을 나타내었으며, A23187으로 자극한 세포에서 발현이 증가하는 경향을 보였다. HHT (1 and 2 mg/rnl)을 전처 리한 세포에서븐 A23187으로 자극한 세포에 비해 밸현이 감소하는 경향을 나타내었다(Fig.
- 모두 발현이 증가하였다. 반면 COX-2 rrNA의 경우 정상군에서도 발현이 뚜렷하였으나 이에 비해 HHT 2 mg/ml 단독 처리한 세포에서 발현이 감소하는 경향을 나타내었으며, A23187으로 자극한 세포에서 발현이 증가하는 경향을 보였다. HHT (1 and 2 mg/ml)을 전처리한 세포에서는 A23187으로 자극한 세포에 비해 발현이 감소하는 경향을 나타내었다(Fig.
- 05) 증가를 나타내었다. 반면 PMA와 A23187로 자극하기 1 시간 전 HHT 1 mg/mM 2의 농도를 처리한 세포에서 각각 13.05 -2.26%와 14.97 0.96%로 억제하는 것으로 나타났으며, PMA와 A23187로만 자극한 세포에 비하여 유의한(p<0.05) 감소를 보였다(Fig. 2).
- 비만세포에서 유리된 TNF- a는 국소의 혈관내피세포에 작용하여 ELAM-1의 발현 및 백혈구의 혈관외유주를 유도하는 것으로써 특히 알레르기 국소의 염증반응에 중요한 역할을 하고 있다꾀. 본 실험에서 RBL-2H3 cells의 TNF- a 생성에 미치는 HHT의 영향에 대해 조사한 결과 RBL-2H3 cells 로부터의 TNF- a의 분비 량은 아무런 처리를 하지 않은 군에서는측정이 불가능하였다.
- 본 실험에서는 黃連解毒湯 추출물이 TNF- a 생산에 미치는 영향을 관찰하기 위해 실험을 진행한 결과 RBL-2H3 cells를 A23187로 단독 자극핸 군에서 모두 TNF- a 분비가 현저하게 증가되었고, 黃連解毒湯 추출물 전처리로 인하여 A23187로 유발된 TNF- a의 분비가 유의하게 억제되었다. 따라서 黃連解毒湯 추출물이 TNF- a의 발현을 억제하여 염증을 억제하는 기전을 가지고있음을 알 수 있다(Fig.
- 본 실험에서는 黃連解毒湯이 RBL-2H3 cells로부터 COX-1 과 COX-2의 mRNA발현에 미치는 영향율 관찰한 결과 COX-1 mRNA의 경우 정상군에 비해 HHT 2 mg/rnl 단독 처리한 세포에서 발현이 증가하였으며, A23187으로 자극한 세포와 HHT(1 and 2 mg/rnl)을 전처리한 군에서 모두 발현이 증가하였다. 반면 COX-2 mRNA의 경우 정상군에서도 발현이 뚜렷하였으나 이에 비해 HHT 2 mg/ml 단독 처리한 세포에서 발현이 감소하는경향을 나타내었으며, A23187으로 자극한 세포에서 발현이 증가하는 경향을 보였다.
- 알레르기 반응에 미치는 黃連解毒湯의 영향을 연구한 결과 PMA plus A23187로 자극한 RBL-2H3 세포주에서 P -hexosaminidase, I L4와 TNF- a의 생성과 분비를 저해하는 효과가 있음을 확인하였다. 또한 COX-2를 특이적으로 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
- 5). 이러한 결과는 HHT>} COX-1의 발현을 증가시키는 동시에 COX-2를 천택적으로 억제하여 알레르기 염증을억 제하는 작용이 있는 것으로 판단된다.
- 이상의 실험결과에서 黃連解毒湯은 알레르기 반응에 유의한억제효과가 있는 것을 알 수 있다.
- 또한 COX-2를 특이적으로 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. 이와 같은 결과는 mast cell 및 basopM 등의 면역세포의 탈과립을 억제하고 알레르기 염증반응과 관련된 cytokine등을 억제하는 기전에 의한 결과로 판단되며, 黃蓮解毒湯이 알레르기의 발병을 예방하고 억제하는 효과가 있을 것으로 생각된다.
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