본 연구에서는 콩의 배축(hypocotyls)에서 분리된 4종의 soyasaponin(Aa, Ab, bg, DDMP)에 대해 RBL-2H3 세포를 이용하여 항알레르기 활성을 확인하고자 하였다. RBL-2H3 세포에서 soyasaponin 화합물들의 세포독성을 확인해 본 결과, 4종 모두 세포독성이 없었고 ${\beta}$-hexosaminidase assay를 통해 비만세포의 탈과립 억제 효능을 확인해 본 결과 대조군으로 사용한 Ketotifen fumarate($IC_{50}$: 38.77mM)와 비교하여 4종 모두 ${\beta}$-hexosaminidase 억제 효능이 있는 것을 확인하였다. 또한, soyasaponin 화합물들은 RBL-2H3 세포에서 탈과립 후 유리되는 대표적인 물질인 histamine의 분비 억제에도 효능이 있음을 확인하였고 이 중 Soyasaponin DDMP가 가장 효능이 우수한 것으로 판단된다.
본 연구에서는 콩의 배축(hypocotyls)에서 분리된 4종의 soyasaponin(Aa, Ab, bg, DDMP)에 대해 RBL-2H3 세포를 이용하여 항알레르기 활성을 확인하고자 하였다. RBL-2H3 세포에서 soyasaponin 화합물들의 세포독성을 확인해 본 결과, 4종 모두 세포독성이 없었고 ${\beta}$-hexosaminidase assay를 통해 비만세포의 탈과립 억제 효능을 확인해 본 결과 대조군으로 사용한 Ketotifen fumarate($IC_{50}$: 38.77mM)와 비교하여 4종 모두 ${\beta}$-hexosaminidase 억제 효능이 있는 것을 확인하였다. 또한, soyasaponin 화합물들은 RBL-2H3 세포에서 탈과립 후 유리되는 대표적인 물질인 histamine의 분비 억제에도 효능이 있음을 확인하였고 이 중 Soyasaponin DDMP가 가장 효능이 우수한 것으로 판단된다.
Soyasaponins are glycosylated, which gives rise to a wide diversity of structures and functions. We evaluated for inhibitory effects of 4 soyasaponins on antigen-induced degranulation in RBL-2H3 Cells. 4 soyasaponins had shown dose-dependently inhibited histamine and ${\beta}$-hexosaminid...
Soyasaponins are glycosylated, which gives rise to a wide diversity of structures and functions. We evaluated for inhibitory effects of 4 soyasaponins on antigen-induced degranulation in RBL-2H3 Cells. 4 soyasaponins had shown dose-dependently inhibited histamine and ${\beta}$-hexosaminidase.
Soyasaponins are glycosylated, which gives rise to a wide diversity of structures and functions. We evaluated for inhibitory effects of 4 soyasaponins on antigen-induced degranulation in RBL-2H3 Cells. 4 soyasaponins had shown dose-dependently inhibited histamine and ${\beta}$-hexosaminidase.
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문제 정의
따라서, 본 연구에서는 콩의 가공과정에서 발생되는 종피와 배아 등의 혼합 부산물로부터 배아를 별도로 분리하고, 이로부터 isoflavone과 soyasaponin을 동시에 분리 할 수 있는 기술을 연구, 개발하였으며, 분리된 soyasaponin 4종(Aa, Ab, βg, DDMP)에 대한 생리활성 연구와 알레르기 반응에 중요한 역할을 하는 비만세포의 탈과립 억제 효과를 확인하였다.
제안 방법
HPLC는 Shimadzu LC-20AD pump, CTO-20AC oven, Sil 20AC auto-sampler, SPD-M20A photodiode array detector, CBM-20A system controller, FRC-10A fraction collector, LC Workstation software로 구성하여 saponin을 분리하였다. column 은 ODS 계열의 Shim-pack Phenomenex (21.
1% BSA) 으로 세척하고 10분 동안 반응시켰다. soyasaponin을 25, 50, 그리고 100 mM 농도로 20분간 처리 후 50 ng/mL DNP-BSA를 20분간 반응시킨 후 얼음 위에 두어 반응을 정지시켰다. 탈과립에 의해 세포 밖으로 분비된 β-hexosaminidase 양을 측정하기 위해 96 well plate에 상등액과 1 mM P-니트로페닐-아세틸-β-D-글루코사미니드를 동량으로 넣고 1시간 동안 반응시킨 후 0.
Soyasaponin의 각 농도별 억제율은 Table 1에 나타냈으며 농도 의존적으로 억제 효과를 보였다. 또한 알레르기 즉시반응의 지표인 탈과립에 대한 억제효과를 확인하기 위해 탈과립 후 유리되는 대표물질인 histamine 분비능을 측정하였다. β-Hexosaminidase assay 측정과 동일한 방법으로 histamine 분비를 유도한 후 상등액 25 mL와 0.
06 g을 넣고 진탕하여 원심 분리하였다. 분리된 Butanol층에 0.1 N HCl 용액과 n-heptan을 넣어 원심분리를 통해 물층을 얻고, 얻어진 물층에 다시 1 N NaOH와 OPT (o-phthaldialdehyde) 용액을 혼합하여 37℃에서 반응시킨 후 3N HCl 용액을 넣고 반응하여 fluorometer (Victor3, perkin Elmer, USA)를 통해 360 nm (excitation)와 450 nm (emission)에서 형광값을 측정하였다(Kwon과 Song, 2012). 4종의 soyasaponin이 histamine 분비에 미치는 영향을 확인해 본 결과 soyasaponin Aa는 25 µM에서 62.
025% trifluoroacetic acid)를 사용하여 B용매를 0분에서 90%으로 시작하여 50분에 50%으로 감소시키고 60분까지 50%를 유지한 후 60분에서 61분까지 90%로 증가시켜 15분간 유지하여 column을 95% B용액에 평형화였다. 이동상 유속은 7.0 mL/min로 조절하고 injection volume 200 mL 주입하며 PDA detector의 파장은 209 nm를 사용하며 완전분리 유무는 SPDM20A photodiode array detector를 이용하여 확인하였다(Fig. 1).
대상 데이터
Column은 ODS 계열의 Shim-pack Phenomenex (21.20×250 mm)을 사용하였다.
본 실험에 사용한 4종의 soyasaponin은 잘 건조된 콩에서 껍질을 제거한 후 hypocotyl을 분리하여 분말화하였다. hypocotyl 분말 20 g에 80% methanol 200 mL을 가하고 24시간 동안 실온에 방치하여 saponin을 추출하였다.
항원-항체 반응에 의한 β-hexosaminidase 분비에 미치는 영향을 확인하기 위하여 ATCC (American Type Culture Collection, USA)에서 구입한 RBL-2H3 세포를 15% Fetal Bovine Serum을 포함하는 MEM 배지를 넣고 37℃ 5% CO2 조건에서 배양하였다.
이론/모형
분리된 4종의 soyasaponin의 RBL-2H3 세포에서 세포 생존율 및 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 MTT((3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide) assay를 실시하였다. RBL-2H3 세포를 96 well plate에 1×104/well 세포수로 분주 하여 soyasaponin 4종을 각각 농도별(0, 3.
성능/효과
β-Hexosaminidase 분비에 미치는 soyasaponin의 효과를 IC50값으로 확인해 본 결과 soyasaponin Aa는 94.01 mM, soyasaponin Ab 는 54.36 mM, soyasaponin bg는 56.66 mM, soyasaponin DDMP는 38.15 mM 로 soyasaponin 4종 중 soyasaponin DDMP가 비만세포의 탈과립 억제 효능이 가장 우수한 것으로 나타났다.
4종의 soyasaponin이 histamine 분비에 미치는 영향을 확인해 본 결과 soyasaponin Aa는 25 µM에서 62.42%, 50 mM에서 62.95%, 100 mM에서 69.18%의 억제 효능을 보였고 soyasaponin Ab는 25 mM에서 2.15%, 50 mM에서 58.85%, 100 mM에서 70.83%의 억제 효능을 보였다.
RBL-2H3 세포를 96 well plate에 1×104/well 세포수로 분주 하여 soyasaponin 4종을 각각 농도별(0, 3.125, 6.25, 12.5, 25, 50, 100 mM)로 24시간 처리하여 세포 생존율을 측정한 결과 soyasaponin 4종 모두 모든 농도에서 세포독성이 관찰되지 않았다(Supplementary Fig. 1).
그리고 β-hexosaminidase assay 효능과 마찬가지로soyasaponin 4종 중 soyasaponin DDMP 가 histamine 분비 억제 효과 또한 가장 우수한 것으로 나타났다(Fig. 2).
83%의 억제 효능을 보였다. 또한 soyasaponin bg는 25 mM에서 1.53%, 50 mM에서 57.94%, 100 mM에서 76.52%의 억제 효능이 있었고 soyasaponin DDMP 의 경우 25 mM에서 73.8%, 50 mM에서 74.79%, 100 mM에서 79.40%로 억제 효과를 보였고 농도의존적으로 유의성 있는 결과를 나타내었다. 그리고 β-hexosaminidase assay 효능과 마찬가지로soyasaponin 4종 중 soyasaponin DDMP 가 histamine 분비 억제 효과 또한 가장 우수한 것으로 나타났다(Fig.
이러한 결과를 통하여 soyasaponin 4종은 RBL-2H3세포에서 세포독성이 없으며 β-hexosaminidase와 histamine 분비를 억제함으로써 항알레르기 효능을 가지는 것으로 사료된다.
후속연구
그러므로 탈과립 억제를 통한 비만세포 활성화 조절은 알레르기 반응의 예방과 치료에 중요한 자료로 활용될 수 있을 것이다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
soyasaponin는 어떤 효과가 있는가?
콩은 우리나라뿐만 아니라 전세계적으로 다양한 전통 및 가공식품으로 이용되고 있으며, 단백질, 지방 등의 함량이 높고 isoflavone 및 soyasaponin 같은 생리활성물질들이 다량 함유되어 있다. 콩의 대표적 생리활성 물질로 isoflavone 이 많이 알려졌으나, 최근 콩에 함유된 soyasaponin의 혈중 콜레스테롤 감소효과, 항산화활성, 항바이러스, 간독성 물질제거, 항종양활성, 면역증진 효과 등 여러 생리활성 기능이 밝혀지면서 신규 식의약 소재로 많은 주목을 받고 있다.
Soyasaponin A, B 계열은 각각 어떤 특징이 있는가?
A계열 soyasaponin은 종실의 배 부분에만 존재하고 항 영양적 요소로 콩가공식품의 쓴맛, 떫은맛 등의 불쾌한 맛을 나타내고 소화율을 감소시키는 원인으로 알려져 있다. B계열 soyasaponin 은 배와 자엽에 존재하고, 콩이 나타내는 대부분의 생리활성에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, B계열 soyasaponin 중에서도 DDMP 사포닌이 중요하게 평가되고 있다(Yang 등, 2015).
비만세포는 알레르기 질환에서 왜 중요한 역할을 하는가?
비만세포는 대부분의 알레르기 질환에 중요한 역할을 하는 세포로 알려져 있다. 알레르기 반응은 IgE가 비만세포의 표면 수용체(highaffinity receptor for IgE, FcεRI)와 결합되어 있어 알레르기 원인물질인 항원이 재차 유입되게 되면 비만세포 표면의 고친화성 IgE 수용체(FcεRI)에 항원이 결합하게 된다. 이때 비만세포가 활성화가 되면 비만세포의 탈과립이 유도되어 과립내 존재하던 히스타민, 사이토카인 그리고 케모카인과 같은 알레르기 유발 물질들이 세포 밖으로 분비되어 알레르기 반응을 일으키게 된다(Huang 등, 2008; Toshio, 2012).
참고문헌 (10)
Alma JN, Ferdi E, Leon MK, Johan G, Frans PN, and Frank AR (2008) Mechanisms of allergy and asthma. Eur J Pharmacol 585, 354-60.
Huang H, Tong X, Deng H, Fu L, and Zhang R (2008) Inhibition of the antigen-induced activation of RBL-2H3 cells by gab2 siRNA. Cell Mol Immunol 5, 433-8.
Kwon HS and Song CH (2012) Effect of Scutellaria barbata pharmacopuncture extract on degranulation and inflammatory mediator release in RBL-2H3 cells. Korean J Acupunct 29, 406-20.
Morikawa T, Xu F, Matsuda H, and Yoshikawa M (2010) Structures of novel norstilbene dimer, longusone A, and three new stilbene dimmers, longusols A, B, and C, with antiallergic and radical scavenging activities from Egyptian natural medicine Cyperus longus. Chem Pharm Bull 58, 1379-85.
Toshio T (2012) Efficacy of Flavonoids for patients with Japanese Ceder Pollinosis. Current Insights in Pollen Allergens 103, 1-22.
Xiax S, Jiang J, Shim DW, Kim TK, Kang TB, and Lee KH (2014) Antiallergic effect of ethanolic extract of Flos Sophora japonica L. on $Ca^{+}^{+}$ ionophore stimulated murine RBL-2H3 cells. J Korean Soc Food Sci Nutr 43(3), 349-54.
Yang SH, Ahn EK, Lee JA, Shin TS, Tsukamoto C, Suh JW et al. (2015) Soyasaponins Aa and Ab exert an anti-obesity effect in 3T3-L1 adipocytes through downregulation of $PPAR\alpha$ . Phytother Res 29(2), 281-7.
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