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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 천연자원으로부터 GST 유도 활성을 가지는 물질을 탐색하기 위한 목적으로 항산화 활성을 나타내는 감초의 추출물을 이용하여 GST의 유도 활성을 밝히고자 하였다.
- 본 연구팀에서는 항산화 활성을 가지면서 신경세포를 보호하는 활성을 가지고 있는 약용식물인 석곡, 형기], 감초 그리고 작약18-19)추출물을 대상으로 PC 12 세포주를 이용하여 GST 유도활성을 갖는 추출물의 탐색을 시도하였다. 그 결과 감초 추출물로부터 강력한 GST 유도 활성을 확인 할 수 있었다.
제안 방법
- LDH 측정에 의한 세포독성 확인. 감초의 methanol 추출물, ethanol 추출물, acetone 추출물이 세포손상에 미치는 영향을 측정하기 위한 방법으로 lactate dehydrogenaseQ^DH) release assay를 실시하였다.
- 5% Triton X-100 용액을 50 B 첨가하여 40 rpm으로 10분 동안 shaking시켜 세포벽을 깨트린 다음, 같은 방법으로 LDH reagent 50㎕를 첨가하여 반응시키고, 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 무처리 대조군과 비교한 값을 나타내었다.
- , Tokyo, Japan) 에서농축하여 용매 추출물을 얻었다. Methanol 추출물에서 다음 단계의 분획물을 얻기 위하여 용매의 극성을 달리하여 순차적으로 용매 분획하였다. 즉, hexane과 물을 같은 비율로 혼합 후 분획 추출하여 hexane^ 분리하였고, 동일한 방법으로 diethyl ether, ethyl acetate 및 물 층으로 분획하여 얻어진 각각의 용매 분획물을 감압 농축시켜 용매를 제거한 분획물들을 얻었다.
- 외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 라디칼 소거능, 총 페놀 함량과 환원력 등을 통한 항산화 활성과 산화적스트레스 상태에서 신경세포 보호 효과를 가지는 4종의 약 g 식물 추출물을 선별할 수 있었고, 이를 이용하여 GST 유도 활성을 측정하였다. PC12 세포주를 96 well plate에 24시간 배양하여 4종의 약용식물 methanol 주줄물을 세포주 배양액의 2% 농도로 처리하여 GST 유도 활성을 측정하였다. 그 걸과, Table 1 에 나타낸 것과 같이 아무것도 처리하지 않은 대조구에 비해석곡 추출물 처리군은 1.
- 감초의 methanol 추출물, ethanol 추출물, acetone 추출물이 세포손상에 미치는 영향을 측정하기 위한 방법으로 lactate dehydrogenaseQ^DH) release assay를 실시하였다. PC12 세포주를 Ix105 cells/m/로 맞춘 후, 100㎕씩 96-well plate에 분주하여 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 뒤, 10, 50jig/m/의 농도로 제조한 감초의 용매별 추출물을 세포주에 처리하였다. 24시간 배양한 다음, 배양액을 새로운 96-well plate에 50 B 분주하고, 이 배양액에 LDH reagent를 5(M씩 첨가하여 상온에서 정치시킨 후, 20 분간 반응하였다.
- 3). 각 분획물의 용내를 제거한 후, 10, 50 jig/m/a] 농도로 제조하여 PC12 세포주에 처리하였을 때 GST 유노활성을 검색하였다. Table 2 에 타나낸 깃과 같이 감초 분획물의 GST 유도활성은 hexane층 10㎕/m/과 50㎕/m/에서 약 226배, 3.
- 추출물 및 분획물 제조. 감초 5 g에 methanol, ethanol, acetone 용매를 100 m/ 가하여 3일 동안 상온에서 정치시켜 추출한 후, 여과지 (5C. 110 mm, Advantec, Tokyo Roshi Kaish, Ltd., Tokyo, Japan)로 여과하였다. 이 추출여액을 회전 감압농축기 (EYELA N-1000, Tokyo Rikakikai Co.
- 감초 methanol 분획물의 세포내 GST 유도활성. 감초 추출물의 GST 유도활성을 타나내는 물질의 독성을 확인하기 위하여 각 용내별 추출물 중에서 GST 유도활성이 가장 좋았던 methanol 추출물을 극성도에 따라 hexane, diethyl ether, ethyl acetate, watei로 분획하여 그 분획물을 얻었다(Fig. 3). 각 분획물의 용내를 제거한 후, 10, 50 jig/m/a] 농도로 제조하여 PC12 세포주에 처리하였을 때 GST 유노활성을 검색하였다.
- 감초 용매별 추출물에 대한 PC12 세포주의 형태학적인 관찰을 위해 6-well plate에 2xl()5 cells/wel로 24시간 동안 배양하였다. 감초의 methanol 추출물, acetone 추출물을 각각 50 ㎍/m/ 처리하고 24시간 후, phase contrast microscope(TS 100-F, Nikon, Tokyo, Japan)로 각 well의 세포 형태를 관찰하고 100배로 사진 촬영하였다.
- LDH 측정에 의한 세포독성 확인. 감초의 methanol 추출물, ethanol 추출물, acetone 추출물이 세포손상에 미치는 영향을 측정하기 위한 방법으로 lactate dehydrogenaseQ^DH) release assay를 실시하였다. PC12 세포주를 Ix105 cells/m/로 맞춘 후, 100㎕씩 96-well plate에 분주하여 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 뒤, 10, 50jig/m/의 농도로 제조한 감초의 용매별 추출물을 세포주에 처리하였다.
- 신경세포는 외부환경에 민감하게 자극을 받으면 신경 상해를 입는 것과 동시에 세포사의 발생으로인한 세포의 형태학적인 변화가 나타난다. 따라서 감초의 용내별 추출물이 PC12 세포주의 형태학적 변화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 광학 현미경 하에서 관찰하였다(Fig. 2A). 그걸 과, 대조구와 비교하였을 때 감초 methanol 추출물과 acetone 추출물을 각각 50 jig/m/ 처리한 군에서 세포의 형태학적인 큰 변화가 유도되지 않은 깃을 확인 할 수 있었다.
- 세포내 GST 활성 측정. 세포내 GST 활성은 glutathione S- transferase assay kit에서 제시하는 방법으로 측정하였다?4) 6- well plate에 2xl05 cells/mZ로 24시간 배양 후, 농도별로 각 추출물을 처리 하고 24시 간 배 양하였다. 그리고 5, 000 rpm으로 원심분리 하여 상등액을 버리고 세포만을 얻어서 200 B의 phosphate buffered saline(PBS)를 첨가하였다.
- 여기에 GST 활성 측정을 위한 반응액 [Dubecco's PBS, 200 mM glutathione (환원형)와 100mM l-chlorbenzene(CDNB)]을 180 B 첨가하고 각 시료를 20 B 첨가하여 흔들어 준 다음 340 nm 에서 흡광도를 측정하였다.
- 본 연구팀은 국내 . 외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 라디칼 소거능, 총 페놀 함량과 환원력 등을 통한 항산화 활성과 산화적스트레스 상태에서 신경세포 보호 효과를 가지는 4종의 약 g 식물 추출물을 선별할 수 있었고, 이를 이용하여 GST 유도 활성을 측정하였다. PC12 세포주를 96 well plate에 24시간 배양하여 4종의 약용식물 methanol 주줄물을 세포주 배양액의 2% 농도로 처리하여 GST 유도 활성을 측정하였다.
- 일차적으로 GST 유도 활성을 검색한 결과, 감초 추출물이 가장 높은 GST 유도 활성을 보였으며, 감초를 이용하여 GST 유도 활성에 관여하는 활성 주성분을 탐색하기 위하여 용내별로 추출하여 GST 유도활성을 살펴보았다. 그 걸과, Fig.
- Methanol 추출물에서 다음 단계의 분획물을 얻기 위하여 용매의 극성을 달리하여 순차적으로 용매 분획하였다. 즉, hexane과 물을 같은 비율로 혼합 후 분획 추출하여 hexane^ 분리하였고, 동일한 방법으로 diethyl ether, ethyl acetate 및 물 층으로 분획하여 얻어진 각각의 용매 분획물을 감압 농축시켜 용매를 제거한 분획물들을 얻었다. 각 추출물 및 분획물은 5 mg/m/S DMSO(dimethyl sulfoxide) 에녹여 적당한 농도로 희석하여 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- 세포주 및 배양. 본 실험에 사용된 세포주는 rat pheochromocytoma PC 12로써 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 사용된 배지는 DMEM medium에 10% FBS, 5% HS 및 lOOunit/m/의 penicillin, 100un/m/의 streptomycin 을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37°C, 5% CO, incubator(MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
- 시약 및 실험재료. 본 실험에서 사용된 석곡nobile Lindley), 형개 (Schizonepeta temiifblia Briquet), 감초 (Glycyrrhiza uralensis Fischer), 작약(paenoia lactiflora Pall)은 2006년 H월 경남 마산시 (주)금강제약으로부터 제공받아 추출하여 실험에 사용하였다. GST 유도 활성을 측정하기 위해서사용된 시약으로 GST assay kit는 Sigma Chemical Co.
- 세포내 GST 유도 활성. 본 연구팀은 국내 . 외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 라디칼 소거능, 총 페놀 함량과 환원력 등을 통한 항산화 활성과 산화적스트레스 상태에서 신경세포 보호 효과를 가지는 4종의 약 g 식물 추출물을 선별할 수 있었고, 이를 이용하여 GST 유도 활성을 측정하였다.
- 본 실험에 사용된 세포주는 rat pheochromocytoma PC 12로써 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 사용된 배지는 DMEM medium에 10% FBS, 5% HS 및 lOOunit/m/의 penicillin, 100un/m/의 streptomycin 을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37°C, 5% CO, incubator(MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
- (St Louis, MO, USA) 제품을 구입하였다. 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), horse serum(HS) 및 penicillin-streptomycin 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NT, USA)에서 구입하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 자료의 처리는 SPSS-PC+ 통계 package를사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치士표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석 (ANOYA)을 시행하여 F값을 구하고 Scheffer test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 이내의 수준에서 평가하였다.
성능/효과
- 기배의 유의성 있는 GST 유도 활성을 확인할 수 있었다. 걸과적으로 감초 methanol 추출물은 PC 12 세포주에서 농도 의존적으로 GST 유도 활성을 보였으며, 감초 ethanol 추출물과 acetone 추출물 보다 methanol 추출물이 더 효율적으로 GST 유도 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
- 추출하여 GST 유도활성을 살펴보았다. 그 걸과, Fig. 1에서 보는 깃과 같이 감초 methanol 추출물 lOjig/mM 50 jig/m/ 농도에서 대조구에 비하여 1.21배, 2.23배로 GST 유도활성이 나타났으며, 감초 ethanol 추출물 lOjig/mM 50jig/m세서는 0.60 배, 1.05배 (data not shown), 감초 acetone 추출물 10 jig/mM 50jig/m/농도에서 1.07배, 1.기배의 유의성 있는 GST 유도 활성을 확인할 수 있었다. 걸과적으로 감초 methanol 추출물은 PC 12 세포주에서 농도 의존적으로 GST 유도 활성을 보였으며, 감초 ethanol 추출물과 acetone 추출물 보다 methanol 추출물이 더 효율적으로 GST 유도 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- PC12 세포주를 96 well plate에 24시간 배양하여 4종의 약용식물 methanol 주줄물을 세포주 배양액의 2% 농도로 처리하여 GST 유도 활성을 측정하였다. 그 걸과, Table 1 에 나타낸 것과 같이 아무것도 처리하지 않은 대조구에 비해석곡 추출물 처리군은 1.48배, 형개 추출물 처리군은 2.20배의 GST 유도 활성을 보였고, 감초 추출물 처리군은 3.13배와 작약 추출물 처리군은 1.14배의 GST 유도 활성을 보였다.
- 갖는 추출물의 탐색을 시도하였다. 그 결과 감초 추출물로부터 강력한 GST 유도 활성을 확인 할 수 있었다. 본 연구에서 사용된 감초(Glycyrrhiza uralensis Fischer)는 콩과에 속하는 다년생 식물로서 단맛 성분인 glycyrrhizin을 6-14% 함유하고 있으며, 끠)거의 모든 한약의 구성성분으로 쓰여 그 안전성이 이미 입증되어 있다.
- 2A). 그걸 과, 대조구와 비교하였을 때 감초 methanol 추출물과 acetone 추출물을 각각 50 jig/m/ 처리한 군에서 세포의 형태학적인 큰 변화가 유도되지 않은 깃을 확인 할 수 있었다. 그리고 세포의 손상 정노를 확인하는 방법 중의 하나인 LDHQactate dehydrogenase)의 방출 양을 측정한 걸과에서도 대조구에서 23.
- 그걸 과, 대조구와 비교하였을 때 감초 methanol 추출물과 acetone 추출물을 각각 50 jig/m/ 처리한 군에서 세포의 형태학적인 큰 변화가 유도되지 않은 깃을 확인 할 수 있었다. 그리고 세포의 손상 정노를 확인하는 방법 중의 하나인 LDHQactate dehydrogenase)의 방출 양을 측정한 걸과에서도 대조구에서 23.1%, 감초 methanol 추출물 10jig/m/와 50 jig/m/ 처리군에서 20.8%, 21.2%의 LDH의 방출량을 확인 할 수 있었으며, 감초 acetone 추출물 10jig/m/와 50 jig/m/ 처리군에서 22.1%, 22.1% 의 LDH의 방출량을 확인할 수 있었다(Fig. 2B).
- 67배로 활성을 나타내었다. 이상의 걸과로부터 감초 추출물의 비극성 화합물들이 GST 유도활성에 관여하고 있음을- 알 수 있었다.
- 이상의 결과로부터 감초 메탄올 및 아세톤 추출물은 유의적인 차이는 나타나지 않았으나 10jig/m/와 50㎕/m/ 농도에서 세포 손상을 유발하지 않으며, 감초 추출물이 독-이적으로 GST의유도 활성을 증가시킨다는 깃을 알 수 있었다.
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