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문제 정의
- 이와 같이 다양한 약리 작용이 기대되는 함초의개발은 많은 부가가치 창출이 기대되나 생리활성에 대한 기초 자료가 부족하므로 과학적이고 실증적인 연구가 필요하다고 사료된다. 따라서 본 연구에서는 함초로부터 조추출물, 다당체I, 다당체 II를 얻어 마우스의 면역세포 활성화에 미치는 효과를 규명하고자 한다.
- 실험동물의 사육조건은 실내 온도 25℃, 습도는 50% 전후로 하였고, 명암은 12시간(day light 06:00~18:00)을 주기로 조절하였다. 본 연구는 실험동물의 사육에 대한인제대학교 동물실험윤리위원회의 가이드라인을 토대로 진행하였다.
- 이와 관련하여 우리나라에서는 건강증진을 위한 생리 활성 물질 탐색과 기능성 식품 개발에 관한 연구로서 해양식물에 대한 관심이 증대되고 있는 실정이다 [24, 8], 해양자원 식물은 항암(2), 면역증강[21], 혈당강하[22], 체중 조절[13], 지질대사 개선[23]등의 다양한 효과가 있는 것으로 알려지면서 생체생리 활성 물질을 얻을 수 있는 좋은 소재로 각광받고 있다. 최근 이러한 생리활성 기능이 기대되는 해양자원식물 중 하나인 함초에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 본 연구에서도 함초의 여러 가지 생리 활성효과 중 면역증강 효과를 검증해보고자 한다.
제안 방법
- 따라서, 비장 세포에서 T세포만을 따로 분리하여 함초 추출물을 첨가한 후에 직접적으로 증식반응을 유도하는지를 알아보았다. Nylon wool을 이용하여, 비장세포 중에서 부착성을 가진 日 세포와 대식 세포를 제거한 다음, 순수한 T세포만을 분리하여 5x105 cells/welt을 넣고 시료를 농도별로 첨가하여 24, 48 및 72시간 배양하여 증식 정도를 측정하였다. Fig.
- 건조된 함초를 잘게 분쇄하여 고온, 가압 조건 하에서 3시간 동안 열수 추출한 후에 filter paper(Whatman No. 1)로 여과하여 조 추출물인 Crude S. herbacea polysaccharide extract(CSP)를 얻었다. Filter paper 여과 후고온 가압 멸균 시킨 2차 증류수로 Sephadex G-50(Sigma, USA)을 칼럼 (2.
- Dutton 등[6, 19]이 보고한 바와 같이 우리 몸의 전체 림프구 중 비장에 분포되어 있는 림프구는 T 세포가 60%, B 세포가 30% 정도로 T 세포의 비율이 높다. 따라서, 비장 세포에서 T세포만을 따로 분리하여 함초 추출물을 첨가한 후에 직접적으로 증식반응을 유도하는지를 알아보았다. Nylon wool을 이용하여, 비장세포 중에서 부착성을 가진 日 세포와 대식 세포를 제거한 다음, 순수한 T세포만을 분리하여 5x105 cells/welt을 넣고 시료를 농도별로 첨가하여 24, 48 및 72시간 배양하여 증식 정도를 측정하였다.
- 비장을 이용하였다. 먼저 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640으로 씻은 다음 핀셋과 멸균 슬라이드를 이용하여 단일세포 부유액을 만들었다. 단일 세포 부유액을 RPMI 1640으로 2회 세척한 다음 lysing buffer(BD PharmLyse™ Lysis Buffer)에 3분간 현탁시켜 적혈구를 제거하고 다시 원심세척한 다음 5 X 105 cells/mL 농도가 되게 희석한 후 96 well plate에 well 당 90 uL씩 첨가하여 세포 증식능 즉정에 이용하였다.
- 먼저, 함초 추출물을 투여한 군과 투여하지 않은 대조군으로 나누어 비장세포 증식능을 측정하였고, 세포 배양 시mitogen(림프구 비특이 활성제)인 Con A(5 ug/mL)와 LPS(15 ug/mL)를 각 well에 첨가하였고 이에 대한 대조군으로 mitogen 대신 3차 증류수를 동량 첨가하여 비장 세포증식 계수를 구하여 비교하였다. 마우스에서 분리한 비장 세포를 5xl05 cells/well로 넣고 mitogen을 첨가하여 24, 48 및 72시간 배양하여 증식 정도를 비교한 결과는 Fig.
- 모든 실험동물에 대한 체중은 시험물질 투여 개시 직전에 1회 측정하였고, 투여개시 이후에는 매일 1회씩 동일한 시간에 측정하였다. 실험 종료 후 실험동물에 대해 urethane (3 g/kg body weight; Sigma Chemical Co.
- 무균적으로 비장을 적출하여 비장의 무게를 측정한 두] , 실험 동물체중의 차이에 따른 변이를 없애고 이를 표준화하기 위하여 적출 비장의 무게와 마우스의 체중을 바탕으로 아래의 공식에 따라 비장지수를 구하였다[4].
- 분리한 마우스의 비장세포를 10% FBS-RPMI 1640배지 1 이에 희석하여 nylon wool column(Polysciences, Inc.)에넣고 37℃, 5% CO2 incubator에 60분간 배양한 후, nylon wool column을 37℃로 미리데워진 배지로 세척하여 비 부착성인 T세포만을 순수 분리하여 사용하였다[25].
- 중요한 의미를 갖는다[5]. 비장 세포의 증식반응을 알아보기 위하여, 분리한 비장세포를 5xl05 cells/well로 넣고 시료를 농도별로 첨가하여 24, 48 및 72시간 배양하여 증식 정도를 비교한 결과는 Fig. 3과 같다.
- 비장세포 증식 능 측정 : 식이 섭취가 생체 내에 미치는 영향을 알아보기 위한 방법으로 장기 또는 혈액을 채취하여 시험관 내 실험을 하는 연구가 다양하게 진행되고 있다 [9, 10], 이 중 비장 세포는 혈액에서 유래된 항원에 대한 면역 반응이 개시되고 발전되는 부위로서 말초림프 기관에 속하며, 그 크기나 세포의 수가 직접적인 지표로 이용될 수 있으므로 대표적인 면역지표로 사용된다[26, 12], 시험관내 실험 결과 함초 추출물이 마우스 비장 세포 및 T 세포 증식 능에 영향을 미치는 것으로 나타났으日로, 이 결과를 바탕으로 함초 추출물을 마우스에 경구투여하여 비장세포 증식능을 관찰하였다. 먼저, 함초 추출물을 투여한 군과 투여하지 않은 대조군으로 나누어 비장세포 증식능을 측정하였고, 세포 배양 시mitogen(림프구 비특이 활성제)인 Con A(5 ug/mL)와 LPS(15 ug/mL)를 각 well에 첨가하였고 이에 대한 대조군으로 mitogen 대신 3차 증류수를 동량 첨가하여 비장 세포증식 계수를 구하여 비교하였다.
- 2).상기의 분자량을 포함한 다당체 혼합물을 얻기 위하여 CSP를 IkD membrane을 사용하여 한외 여과시킨 후 S. herbacea polysaccharide I(SP 얻었으며, CSPf- gel filtration chroma- tography시킨 후다당체로 추정되는 해당 분획을 수집하여 S. herbacea polysaccharide II(SP II» 얻었다 (Fig. 1). 함 초 추출물의 SPI 활성은 선행연구 결과[1기에서 보고한 바와 같이 항당뇨 및 지질대사 개선 등의 효과가 있음이 확인된바 있다.
- 생체 내 실험에서는 함초의 3개 추출물(CSP, SPI, SPU)을 3차 멸균 증류수로 용해시킨 후 적정 농도로 희석하여 사용하였다. 마우스를 임의 배치법에 의해 대조군과 투여 군으로 나누었으며 , 실험군마다 6마리씩 사용하였다.
- 세포 증식 측정은 Cell Titer 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega, USA)를 사'하였으며 , 세포배양액 100 uL에 Cell titer 용액을 20 uL씩 첨가하여 S간 동안 배양한 다음 Fluorescence Multi-Detection Reader(Synergy HT, BIOTEK, USA)로 490 nm에서 O.D. 값을 측정하여 증식 정도를 측정하였다.
- 5, 1, 2, 4 mg/mL가 되도록 조제된 각각의 추출물을 10 uL씩각 well에 분주한 후 37℃, 5% CO2 incubatoi에서 24, 48, 72시간 배양하였다. 세포 증식 측정은 Cell Titer 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega, USA)를 사용하였으며, 세포배양액 100 uL에 Cell titer 용액을 20 uL씩 첨가하여 4冲간 동안 배양한 다음 Fluorescence Multi-Detection Reader(Synergy HT, BIOTEK, USA)로 490 nm에서 O.D.값을 측정하여 증식 정도를 측정하였다.
- 시험관 내 실험에서는 함초의 3개 추출물(CSP, SPI, SPU)을 3차 증류수에 용해시킨 다음 Sin이e Filter Unit(Sartorius Minisart®, Germany)4로 여과시킨 후 고온 가압멸균하여 실험하고자 하는 농도가 되도록 희석하여 세포 배양 시 첨가하였다.
- 측정하였다. 실험 종료 후 실험동물에 대해 urethane (3 g/kg body weight; Sigma Chemical Co., St. Louis)을복강에 주사하여 마취하에 복강을 절개하여 주요 장기인 간장, 신장(좌, 우), 흉선, 비장을 적출하여 중량을 측정하였다.
- 이들 마우스는 1주일간 실온에서 물과 사료를 충분히 공급하고, 가능한 스트레스를 최소화하여 사육하면서, 생후 7~8주 된 암컷을 사용하였다. 실험동물의 사육조건은 실내 온도 25℃, 습도는 50% 전후로 하였고, 명암은 12시간(day light 06:00~18:00)을 주기로 조절하였다. 본 연구는 실험동물의 사육에 대한인제대학교 동물실험윤리위원회의 가이드라인을 토대로 진행하였다.
- 준비된 96 well plate에 세포를 90 uL씩 분주하고 각 군당 양성 대 조군으로서 concanavalin A(Con A, 5 ug/mL)와 lipopolysaccharide(LPS, 15 ug/mL)를 각각 10 uL씩 분주하고 대조군에는 3차 멸균 증류수를 동량 분주한 후, 각 plate 는 37℃, 5% CO2 incubator에서 24, 48, 72시간 배양하였다. 세포 증식 측정은 Cell Titer 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega, USA)를 사'하였으며 , 세포배양액 100 uL에 Cell titer 용액을 20 uL씩 첨가하여 S간 동안 배양한 다음 Fluorescence Multi-Detection Reader(Synergy HT, BIOTEK, USA)로 490 nm에서 O.
- 준비된 96 weU plate에 세포 90 uL와. 최종 농도가 0.5, 1, 2, 4 mg/mL가 되도록 조제된 각각의 추출물을 10 uL씩각 well에 분주한 후 37℃, 5% CO2 incubatoi에서 24, 48, 72시간 배양하였다. 세포 증식 측정은 Cell Titer 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega, USA)를 사용하였으며, 세포배양액 100 uL에 Cell titer 용액을 20 uL씩 첨가하여 4冲간 동안 배양한 다음 Fluorescence Multi-Detection Reader(Synergy HT, BIOTEK, USA)로 490 nm에서 O.
- 각각의 분획은 페놀-황산법으로 총당량을 측정하였고, blue dextran(Sigma, USA)을 standards. 하여 CSP로부터 분리되어 나온 다당체의 분자량을 추정하여 다당체 인 S. herbacea polysaccharide I(SP I)을얻었다. 다당체인 S.
- 마우스를 임의 배치법에 의해 대조군과 투여 군으로 나누었으며 , 실험군마다 6마리씩 사용하였다. 함초의 3개 추출물(CSP, SPI, SPII)을 투여 직전 3차 멸균 증류수에 현탁하여 마우스 체중 10 g당 함초 추출물 현탁액 0.1 mL를 투여할 수 있는 농도로 조제한 다음, LD50(25, 550 ㎎/㎏)와 EPA의 면역 독성지침서(U. S. EPA, 1996)를 기준으로 하여 결정한 용량을 하루 1회(200 ㎎/㎏ body weight) 7일간 경구 투여하였다. 대조군에는 동량의 3차 멸균 증류수를 같은 방법으로 투여하였다.
대상 데이터
- herbacea polysaccharide I(SP I)을얻었다. 다당체인 S. herbacea polysaccharide H(SP II)은 CSP를 한외여과기 (ProFlux M12, Millipore, USA)에서 1 kD membrane(Millipore, US A)을 사용하여 여과한 후에 얻었다(Fig. 1, 2).
- 마우스를 임의 배치법에 의해 대조군과 투여 군으로 나누었으며 , 실험군마다 6마리씩 사용하였다. 함초의 3개 추출물(CSP, SPI, SPII)을 투여 직전 3차 멸균 증류수에 현탁하여 마우스 체중 10 g당 함초 추출물 현탁액 0.
- 면역세포의 증식에 미치는 효과를 측정하기 위하여 마우스의 비장을 이용하였다. 먼저 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640으로 씻은 다음 핀셋과 멸균 슬라이드를 이용하여 단일세포 부유액을 만들었다.
- 본 실험에 사용한 동결건조된 실험 재료는 (주)다사랑으로부터 건조된 함초를 구입한 후 분말화하여 사용하였다. 건조된 함초를 잘게 분쇄하여 고온, 가압 조건 하에서 3시간 동안 열수 추출한 후에 filter paper(Whatman No.
- 실험동물은 효창 사이언스로부터 특정병원체부 재 (specific pathogen free) Balb/c 口]우스를 공급받아 사용하였다. 이들 마우스는 1주일간 실온에서 물과 사료를 충분히 공급하고, 가능한 스트레스를 최소화하여 사육하면서, 생후 7~8주 된 암컷을 사용하였다.
- 이들 마우스는 1주일간 실온에서 물과 사료를 충분히 공급하고, 가능한 스트레스를 최소화하여 사육하면서, 생후 7~8주 된 암컷을 사용하였다. 실험동물의 사육조건은 실내 온도 25℃, 습도는 50% 전후로 하였고, 명암은 12시간(day light 06:00~18:00)을 주기로 조절하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 통계 프로그램인 SAS(Statistic Analysis Systeme를 이용하여 평균과 표준편차를 구하였다. 통계 처리는 one-way analysis of variance(ANOVA)에 의해 수행하였고 p<0.
- 이용하여 평균과 표준편차를 구하였다. 통계 처리는 one-way analysis of variance(ANOVA)에 의해 수행하였고 p<0.05 수준에서 Student f-tes에 의해 유의차를 검증하였다.
이론/모형
- Aliquot of polysaccharide extract dissolved in distilled water was applied to sephadex G-50 column chromatography. Fractions were collected and monitored by phenol-HzSQ method.
- 5 mL씩의 분획을 얻었다. 각각의 분획은 페놀-황산법으로 총당량을 측정하였고, blue dextran(Sigma, USA)을 standards. 하여 CSP로부터 분리되어 나온 다당체의 분자량을 추정하여 다당체 인 S.
- 함초조^^#인 Crude S. herbacea polysaccharide extract (CSP)를 sephadex G-50으로 충전된 칼럼에 주입하여 gel filtration chromatography로 다당체분획을 확인하였으며, 이 분획은 페놀-황산법으로 총당량을 측정하여 16-30 KDa와 250-3300 Da의 분자량으로 추정되었다 (Fig. 2).상기의 분자량을 포함한 다당체 혼합물을 얻기 위하여 CSP를 IkD membrane을 사용하여 한외 여과시킨 후 S.
성능/효과
- Nylon wool을 이용하여, 비장세포 중에서 부착성을 가진 日 세포와 대식 세포를 제거한 다음, 순수한 T세포만을 분리하여 5x105 cells/welt을 넣고 시료를 농도별로 첨가하여 24, 48 및 72시간 배양하여 증식 정도를 측정하였다. Fig. 4에 나타난 것과 같이, 분리된 T 세포는 함초 추출물을 첨가하여 배양한 경우 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비해 농도 의존적으로 세포 증식반응이 나타났으며, 함초 추출물에 의한 T 세포증식 능의 변화를 살펴보면, 4 mg/mL 농도에서 24시간 배양한 경우 CSP, SPI, SPII군 모두 세포 증식 능이 176.76, 350.39, 330.08 수준으로 향상되어 유의적인 수치를 나타내었다.
- T 세포의 증斗위 실험에서 함초 추출물이 비장 세포의 증식을 유도하는 효과가 있는 것으로 나타났다. 이때, 증식하는 비장 세포는 T 세포 또는 B 세포 중 하나일 가능성이 높다.
- 나타내었다. 그리고, 함초 추출물을 투여하고 mitogen을 처리하지 않은 경우에는 세포 증식능이 저하되었으나, Con A나 LPS로 처리 시에는 72시간 배양시 SPI 군에서 각각 최대의 증식능 (65.38±2.55, 54.55±2.86)을 보였다. 특히 SPI과 SPII군이 CSI군보다 세포 증식능이 효과적이었다.
- 7배 촉진시키는 효과가 있음을 보고하였고, Kang 등[14}은 큰 느타리버섯 조다당체가 비장 세포 및 B 세포 증식을 직접적으로 유도한다고 보고하였다. 이상의 결과와 본 연구의 결과로 판단하면 함초 추출물 중 특히 SPI과 SPII가 비장세포를 자극하여 T 세포와 B 세포 증식을 촉진하여 면역능을 증진시키는 것으로 사료된다.
- 즉, 간장 중량, 신장 중량 및 흉선 중량은 각 군간에 다소 차이는 있으나 유의성 있는 변화는 관찰되지 않았으며, 비장 중량은 대조군(0.077±0.006), CSP군(0.097±0.021), SP I군(0.095±0.021), SPII군 (0.080±0.014)^로 나타나 정상 대조군에 비해 함초 추출물투여 군이 다소 증가 경향은 보였으나 유의적 차이는 없었다.
- 체중 증가량은함초 추출물을 공급하지 않은 대조군과 함초 추출물을 공급한 실험군 간에 유의적 차이는 없었으나 실험기간 동안 실험군의 체중이 계속적으로 증가하는 경향을 보였다. Jo 등 [13]의 연구에 의하면 함초 추출액 투여시 투여량이 증가할수록 체중 증가율이 감소되어 함초가 체중 증가 억제에 영향을 미친다고 보고한 것과 달리 본 실험 결과에서 체중 증가 경향을 보인 것은 실험군의식이 조성이 양호하고 실험 마우스의 성장발육이 활발한 시기 때문으로 사료된다.
- 특히 SPI과 SPII군이 CSI군보다 세포 증식 능이 효과적이었다. 적응 면역』는 B 세포에 의해 생성되는 체액성면역과 T 세포에 의해 매개되는 세포성 면역의 두 유형이 있는데, 함 초 추출물 중 특히 SPI과 SPII가 T 세포를 자극하여 세포 증식을 촉진시킨 것으로 보아 세포성 면역에 자극효과가 우수함을 확인할 수 있었으나, B 세포와 관련이 있는 체액성 면역과 T 세포와 관련이 있는 세포성 면역 중 어떤 반응을 더 효과적으로 유도하는지에 대해서는 알수 없었다.
- 특히 SPI과 SPII군이 CSI군보다 세포 증식 능이 효과적이었다. 적응 면역』는 B 세포에 의해 생성되는 체액성면역과 T 세포에 의해 매개되는 세포성 면역의 두 유형이 있는데, 함 초 추출물 중 특히 SPI과 SPII가 T 세포를 자극하여 세포 증식을 촉진시킨 것으로 보아 세포성 면역에 자극효과가 우수함을 확인할 수 있었으나, B 세포와 관련이 있는 체액성 면역과 T 세포와 관련이 있는 세포성 면역 중 어떤 반응을 더 효과적으로 유도하는지에 대해서는 알수 없었다.
- 32 수준으로 향상되어 유의적인 수치를 나타내었다. 특히 SPI과 SPII군이 CSP 군보다 세포 증식능이 효과적이었다. 다당체와 관련하여 Kim 등[15] 은 상백 피로부터 분리한 다당체의 경우 면역 세포인 B 및 T 세포의 증식을 최대 6.
후속연구
- 이상의 결과로부터 함초에서 추출된 다당체 SPI과 SPH 는 면역활성을 증강시키는 실질적 효과가 있음이 확인되었으며 , 이로써 앞으로 이 다당체가 면역증강 소재로 활용될 수 있을 것이 기대된다.
- 병, 갑상선염, 천식, 기관지염 및 간질환 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으나 이에 대한 체계적인 연구는 아직 미흡한 실정이다. 이와 같이 다양한 약리 작용이 기대되는 함초의개발은 많은 부가가치 창출이 기대되나 생리활성에 대한 기초 자료가 부족하므로 과학적이고 실증적인 연구가 필요하다고 사료된다. 따라서 본 연구에서는 함초로부터 조추출물, 다당체I, 다당체 II를 얻어 마우스의 면역세포 활성화에 미치는 효과를 규명하고자 한다.
- 적응 면역』는 B 세포에 의해 생성되는 체액성면역과 T 세포에 의해 매개되는 세포성 면역의 두 유형이 있는데, 함 초 추출물 중 특히 SPI과 SPII가 T 세포를 자극하여 세포 증식을 촉진시킨 것으로 보아 세포성 면역에 자극효과가 우수함을 확인할 수 있었으나, B 세포와 관련이 있는 체액성 면역과 T 세포와 관련이 있는 세포성 면역 중 어떤 반응을 더 효과적으로 유도하는지에 대해서는 알수 없었다. 이와 관련하여 보다 구체적인 것은 추후 실험을 수행하여야 할 것으로 사료된다.
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