선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 우리나라에서 생산되는 대표적인 갈조류는 참다시마(Laminaria japonica)로서 칼슘, 칼륨, 요오드, 아연 등 생체 대사에 관여하는 무기질이 풍부하게 함유되어 있다고 알려져 있으며, 현재까지 지질 대사 개선 효과, 항당뇨 활성(13), 해독 작용(14), 고혈압 예방, 항암(15), 항돌연변이(16), 항바이러스(17) 등 다양한 생리활성 효과가 보고되고 있다. 본 연구에서는 참다시마에서 다당체를 얻어 마우스 비장 세포의 면역 활성에 미치는 효과를 규명하고자 한다.
제안 방법
- C57BL/6 마우스에서 분리한 비장 세포를 단일화하여 10% FBS-RPMI 1640에 부유시킨 후, mitomycin C(MMC, 5 mg/mL)를 첨가하여 37℃ 수조에서 30분간 처리하였다. 그런 후 RPMI-1640 배지로 4℃ 250×g에서 8분간 5번 원심 분리에 의한 침전을 반복하여 세척한 다음 동종 항원 비장 세포 또는 표적 세포로 이용하였다.
- NK 세포는 세포 내 미생물에 의해 감염된 세포 및 암세포를 직접 살해하거나, 타 포식 세포를 활성화시킬 수 있는 사이토카인을 포함한 수용성 인자를 분비하는 세포로서 선천 면역에 주요한 역할을 담당하고 있는 면역 세포이다(24). LP 첨가에 의한 NK 세포의 활성에 대한 영향을 측정하기 위하여, Balb/c 마우스로부터 분리한 비장 세포를 IL-2로 자극하여 림포카인 활성 살해 세포(LAKs)로 분화시킨 후, YAC-1 림프종 세포를 표적 세포로 하여 LAKs의 활성을 측정하였다. 작동 세포와 표적 세포를 10:1 비율로 혼합한 뒤, LP를 농도별로 0.
- 각각의 분획은 페놀-황산법으로 총 당량을 측정하였고, L. digitata 유래의 laminarin(Sigma-Aldrich Chemical Co.)을 standard로 하여 L. japonica extract로부터 분리·정제되어 나온 다당체인 L. japonica polysaccharides(LP)를 얻었다(Fig. 1).
- 그런 후 50 µL의 stop solution을 각 well에 첨가하고 Fluorescence Multi-Detection Reader(Synergy HT, BIOTEK, Winooski, VT, USA)를 이용하여 490 nm에서 상등액 내에 있는 lactate dehydrogenase(LDH)의 양을 반영하는 O.D.값을 측정하여 세포 독성능을 산출하였다.
- 단일 세포 부유액을 RPMI-1640으로 2회 세척한 다음 lysing buffer(BD PharmLyseTM Lysis Buffer, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 3분간 현탁시켜 적혈구를 제거하고 다시 원심 세척한 다음 5×106 cells/mL 농도가 되게 희석한 후 96 well plate에 well 당 90 µL씩 첨가하여 세포 증식능 측정에 이용하였다.
- 동종 항원 반응 비장 세포가 동종 항원을 가진 세포를 인식해서 죽일 때, 죽은 세포가 분비하는 LDH의 양을 측정하여 살해 세포 독성 작용에 미치는 영향을 알아보았다. 표적 세포(target cells)로서 MMC로 증식을 억제한 alloantigen인 C57BL/6 마우스 비장세포를 사용하였고, 작동 세포(effector cells)로서 Balb/c 마우스 비장 세포를 사용하였다.
- 동종 항원에 반응하는 Balb/c로부터 분리된 비장 세포(effector cells)와 표적 세포(target cells)의 비율을 10:1로하여 96 well plate에 90 µL가 되게 분주한 후, 최종 농도가 0.25, 0.5, 1 mg/mL가 되도록 조제된 각각의 추출물을 10 µL씩 첨가하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 48시간 배양하였다.
- 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI-1640으로 씻은 다음 핀셋과 멸균 슬라이드를 이용하여 단일 세포 부유액을 만들었다. 단일 세포 부유액을 RPMI-1640으로 2회 세척한 다음 lysing buffer(BD PharmLyseTM Lysis Buffer, BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 3분간 현탁시켜 적혈구를 제거하고 다시 원심 세척한 다음 5×106 cells/mL 농도가 되게 희석한 후 96 well plate에 well 당 90 µL씩 첨가하여 세포 증식능 측정에 이용하였다.
- Effector cells과 target cells의 비율을 10:1로 하여 96 well plate에 100 µL가 되게 넣고 4℃ 250×g에서 5분간 원심 분리로 침전하여 37℃ 5% CO2 incubator 에서 8시간 배양하였다. 배양 시간이 종료되기 45분 전에 target maximum과 volume correcting control에는 lysis buffer를 첨가하여 세포 용해도가 최대가 되도록 하였다. 배양 후에 4℃ 250×g에서 5분간 원심 분리로 침전시킨 후 상등액 50 µL를 96 well plate에 옮기고 여기에 50 µL의 substrate mix buffer를 첨가하여 실온에서 알루미늄 호일을 덮어 30분간 반응시켰다.
- 배양 후에 배양 상등액을 100 µL 씩 회수하여 상등액에 포함된 IL-2의 양을 Mouse IL-2 ELISA kit (eBioscience, San Diego, CA, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 비장 세포 90 µL에 Con A를 10 µL씩 분주하고 대조군에는 3차 멸균 증류수를 동량 분주한 후, 각 well에 최종 농도가 0.25, 0.5, 1 mg/mL가 되도록 조제된 각각의 추출물을 첨가하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 48시간 배양하였다.
- 비장 세포의 증식 반응을 알아보기 위하여, 분리한 비장 세포를 5×106 cells/mL로 넣고 시료를 농도별로 첨가하여 48시간 배양하여 증식 정도를 비교하였다.
- 비장세포 증식 활성 효과와 T 세포가 분비하는 cytokine 양과의 관계를 알아보고자 T 보조 세포가 분비하는 cytokine인 IL-2를 측정하였다. 비장 세포에 Con A로 전처리한 후 LP를 농도별로 첨가한 경우와 비장 세포에 LP만을 농도별로 첨가한 경우 모두 농도 의존적으로 IL-2의 분비량이 증가함을 확인하였다.
- 세포 증식 측정은 CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega, Madison, WI, USA)를 사용하였으며, 세포 배양액 100 µL에 CellTiter 용액을 20 µL씩 첨가하여 4시간 동안 배양한 다음 Fluorescence Multi-Detection Reader(Synergy HT, BIOTEK, Winooski, VT, USA)로 490 nm에서 O.D.값을 측정하여 증식 정도를 측정하였다.
- 이들 마우스는 1주일간 실온에서 물과 사료를 충분히 공급하고, 가능한 스트레스를 최소화하여 사육하면서, 생후 4-7주 된 암컷을 사용하였다. 실험 동물의 사육 조건은 실내 온도 25℃, 습도는 50% 전후로 하였고, 명암은 12시간(day light 06:00-18:00)을 주기로 조절하였다. 본 연구는 실험 동물의 사육에 대한 인제대학교 동물실험 윤리위원회의 가이드라인을 토대로 진행하였다.
- japonica 추출물을 1 kD membrane으로 ultrafiltration한 후, 추출한 다당체 분획의 분자량은 gel permeation chromatography(GPC) column을 40℃로 유지하면서 RI detector를 이용하여 확인하였다. 이때 이동상은 증류수를 사용하였고, 1 mL/min의 유속으로 흘려주며 분석한 결과, 다량의 10,000-30,000 Da과 소량의 5,000-10,000 Da의 2가지 분획으로 나누어졌다. 그리고 Sephadex G-50으로 충전된 칼럼에 주입하여 gel filtration chromatography을 수행한 후, laminarin을 standard로 하여 페놀-황산법으로 다당체 분획을 분리·정제한 결과, LP의 분자량이 5,000-30,000 Da으로 밝혀졌다(18).
- 5, 1 mg/mL)로 첨가하여 마우스 비장 세포의 증식 활성을 측정한 결과, 비장 세포증식능이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 이러한 결과를 근거로 항원 특이적인 세포 독성 T 림프구(CTLs)의 활성과 IL-2에 의해 야기되는 비특이적인 림포카인 활성 살해 세포(LAKs)의 세포독성능을 측정하였다. 작동 세포와 표적 세포의 비율을 10:1로 혼합한 뒤, LP를 농도별로 첨가하여 세포 용해 시 발생되는 LDH를 측정한 결과, 동종 항원 반응 비장 세포의 살해 세포 작용이 유의적으로 증가하였으며, LAKs의 활성 또한 유의적으로 증가함을 확인하였다.
- 준비된 96 well plate에 concanavalin A(Con A, 10 µg/mL), interleukin(IL-2, 200 ng/mL) 및 alloantigen(anti-C57, 5×106 cells/mL)으로 전처리한 세포 90 µL와 최종 농도가 0.25, 0.5, 1 mg/mL가 되도록 조제된 각각의 추출물을 10 µL씩 각 well에 분주한 후 37℃, 5% CO2 incubator에서 48시간 배양하였다.
- 참다시마로부터 열수 추출하여 얻은 crude L. japonica 추출물을 1 kD membrane으로 ultrafiltration한 후, 추출한 다당체 분획의 분자량은 gel permeation chromatography(GPC) column을 40℃로 유지하면서 RI detector를 이용하여 확인하였다. 이때 이동상은 증류수를 사용하였고, 1 mL/min의 유속으로 흘려주며 분석한 결과, 다량의 10,000-30,000 Da과 소량의 5,000-10,000 Da의 2가지 분획으로 나누어졌다.
- 표적 세포(target cells)와 동종 항원에 반응하는 Balb/c로부터 분리된 비장 세포(effector cells)의 비율을 10:1로하여 96 well plate에 90 µL가 되게 분주한 후, 최종 농도가 0.25, 0.5, 1 mg/mL가 되도록 조제된 각각의 추출물을 10 µL씩 첨가하여 37℃ 5% CO2 incubator에서 48시간 배양하였다.
대상 데이터
- Balb/c 마우스에서 분리한 비장 세포를 IL-2로 자극한 뒤 effector cells(5×106 cells/mL)로 이용하였으며, 한국세포주은행에서 분양받은 생쥐 유래 YAC-1 임파종 세포를 표적 세포로 이용하였다.
- 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받은 생쥐 유래 YAC-1 임파종 세포의 배양을 위한 RPMI-1640 배지, fetal bovine serum(FBS) 등은 Gibco(Carlsbad, CA, USA)사에서 구입하였다. 생쥐 유래 YAC-1 임파종 세포는 10% FBS-RPMI 1640 배지를 이용하였으며, 5% CO2, 95% 습도 및 37℃ incubator에서 배양하였다.
- 실험 동물은 효창 사이언스(Daegu, Korea)로부터 특정 병원체 부재(specific pathogen free) Balb/c 마우스와 동종 번식(inbred) C57BL/6 마우스를 공급받아 사용하였다. 이들 마우스는 1주일간 실온에서 물과 사료를 충분히 공급하고, 가능한 스트레스를 최소화하여 사육하면서, 생후 4-7주 된 암컷을 사용하였다.
- 실험 동물은 효창 사이언스(Daegu, Korea)로부터 특정 병원체 부재(specific pathogen free) Balb/c 마우스와 동종 번식(inbred) C57BL/6 마우스를 공급받아 사용하였다. 이들 마우스는 1주일간 실온에서 물과 사료를 충분히 공급하고, 가능한 스트레스를 최소화하여 사육하면서, 생후 4-7주 된 암컷을 사용하였다. 실험 동물의 사육 조건은 실내 온도 25℃, 습도는 50% 전후로 하였고, 명암은 12시간(day light 06:00-18:00)을 주기로 조절하였다.
- 동종 항원 반응 비장 세포가 동종 항원을 가진 세포를 인식해서 죽일 때, 죽은 세포가 분비하는 LDH의 양을 측정하여 살해 세포 독성 작용에 미치는 영향을 알아보았다. 표적 세포(target cells)로서 MMC로 증식을 억제한 alloantigen인 C57BL/6 마우스 비장세포를 사용하였고, 작동 세포(effector cells)로서 Balb/c 마우스 비장 세포를 사용하였다. 작동 세포를 표적세포로 자극한 뒤, LP를 농도별로 첨가하여 세포 독성 T 림프구(CTLs)의 활성을 측정한 결과는 Table 1과 같다.
- 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 분양받은 생쥐 유래 YAC-1 임파종 세포의 배양을 위한 RPMI-1640 배지, fetal bovine serum(FBS) 등은 Gibco(Carlsbad, CA, USA)사에서 구입하였다. 생쥐 유래 YAC-1 임파종 세포는 10% FBS-RPMI 1640 배지를 이용하였으며, 5% CO2, 95% 습도 및 37℃ incubator에서 배양하였다.
데이터처리
- Significance was determined using the Student’s t-test versus the control group (*p<0.05).
- 모든 실험 결과는 통계 프로그램인 SAS(SAS Institute Inc., Cary, NC, USA)를 이용하여 평균과 표준 편차를 구하였다. 통계 처리는 one-way analysis of variance(ANOVA)에 의해 수행하였고 p<0.
- 통계 처리는 one-way analysis of variance(ANOVA)에 의해 수행하였고 p<0.05 수준에서 Student t-test에 의해 유의차를 검증하였다.
이론/모형
- 세포 독성능 시험은 Cyto Tox 96® Non-radioactivity Cytotoxicity Assay(Promega)를 이용하였다.
성능/효과
- Laminaria japonica의 polysaccharides(LP)가 마우스 비장 세포에서 현저한 면역 증강 활성을 보였다. Balb/c 마우스 비장 세포를 mitogen인 Con A, T cell growth factor인 IL-2 및 alloantigen인 anti-C57로 자극한 뒤, LP를 농도별(0.25, 0.5, 1 mg/mL)로 첨가하여 마우스 비장 세포의 증식 활성을 측정한 결과, 비장 세포증식능이 유의적으로 증가함을 확인하였다. 이러한 결과를 근거로 항원 특이적인 세포 독성 T 림프구(CTLs)의 활성과 IL-2에 의해 야기되는 비특이적인 림포카인 활성 살해 세포(LAKs)의 세포독성능을 측정하였다.
- LP를 0.25, 0.5, 1 mg/mL 첨가하여 배양한 경우 LP를 첨가하지 않은 대조군에 비해 27.13±2.07, 27.05±7.37, 28.88±3.82 수준으로 비장 세포 증식이 다소 증가하는 경향을 보였다.
- LP를 첨가하여 배양한 경우 27.58±3.00, 39.61±2.08, 61.96±4.90 수준으로 LP를 첨가하지 않은 대조군에 비해 유의적으로 비장 세포 증식능이 향상되었다.
- IL-2는 T 림프구, B 림프구 및 NK 세포와 같은 림프구의 분화와 증식에 관여하는 cytokine이며(28), IL-2의 분비량은 활성화된 T 림프구를 반영하는 지표로서 IL-2의 분비가 많으면 림프구의 증식이 증가된다(29). LP의 첨가로 인해 마우스 비장 세포에서 분비되는 IL-2의 생산량이 증가된 것으로 보아, 다시마 유래 다당인 LP가 마우스 비장 세포의 면역 세포를 자극하여 세포성 면역에 영향을 미치는 것으로 사료된다. 이는 선행 연구 결과에서 LP를 처리한 경우 CD4+ T 림프구의 활성이 증가한 것과 일치한다(18).
- Laminaria japonica의 polysaccharides(LP)가 마우스 비장 세포에서 현저한 면역 증강 활성을 보였다. Balb/c 마우스 비장 세포를 mitogen인 Con A, T cell growth factor인 IL-2 및 alloantigen인 anti-C57로 자극한 뒤, LP를 농도별(0.
- 그리고 Fig. 3에 나타난 것과 같이, 세포 배양시 T 림프구의 growth factor로 작용하는 IL-2를 전처리하여 T 림프구를 자극한 뒤 LP를 농도별로 처리한 후 비장 세포의 증식능을 측정한 결과, 농도 의존적으로 71.47±2.44, 84.27±6.11, 132±2.88 수준의 비장 세포 증식능을 보였다.
- 작동 세포와 표적 세포의 비율을 10:1로 혼합한 뒤, LP를 농도별로 첨가하여 세포 용해 시 발생되는 LDH를 측정한 결과, 동종 항원 반응 비장 세포의 살해 세포 작용이 유의적으로 증가하였으며, LAKs의 활성 또한 유의적으로 증가함을 확인하였다. 그리고 T 림프구의 활성에 직접적으로 관여하는 IL-2의 생산능을 측정한 결과, LP를 첨가한 경우 농도 의존적으로 IL-2의 생산량이 증가됨을 확인하였다. 이상의 결과로, 참다시마에서 획득한 LP가 마우스 비장 세포의 T 림프구 및 NK 세포의 증식에 영향을 미치는 면역 증강 활성을 가지고 있음을 입증하였다.
- 비장세포 증식 활성 효과와 T 세포가 분비하는 cytokine 양과의 관계를 알아보고자 T 보조 세포가 분비하는 cytokine인 IL-2를 측정하였다. 비장 세포에 Con A로 전처리한 후 LP를 농도별로 첨가한 경우와 비장 세포에 LP만을 농도별로 첨가한 경우 모두 농도 의존적으로 IL-2의 분비량이 증가함을 확인하였다. Fig.
- 비장 세포에 LP만을 첨가하여 IL-2 분비량을 측정한 경우 또한 대조군(0.77±0.04)에 비해 LP를 1 mg/mL 첨가한 경우 1.39±0.08 수준으로 유의적인 증가를 보였다.
- 그리고 T 림프구의 활성에 직접적으로 관여하는 IL-2의 생산능을 측정한 결과, LP를 첨가한 경우 농도 의존적으로 IL-2의 생산량이 증가됨을 확인하였다. 이상의 결과로, 참다시마에서 획득한 LP가 마우스 비장 세포의 T 림프구 및 NK 세포의 증식에 영향을 미치는 면역 증강 활성을 가지고 있음을 입증하였다.
- 바이러스 감염 및 항종양 면역 반응과 같은 생체 내 세포성 면역은 주로 T 림프구와 NK 세포에 의해서 매개가 된다(20,21). 이와 관련하여 Con A, IL-2 및 alloantigen으로 자극한 비장 세포의 LP에 대한 세포 증식능을 측정한 결과 유의적인 비장 세포 증식능이 관찰되었다. 이는 mitogen과 관련하여 Cho 등(22)이 다시마 분말 투여에 의한 당뇨쥐의 비장 세포 기능에 관한 연구에서 4주간의 투여에 의해 비당뇨군의 비장 세포 증식능이 촉진되었고, 특히 Con A 첨가에 의해 비장 세포 증식능이 3배까지 상승되었다는 보고와 유사하다.
- 작동 세포와 표적 세포를 10:1 비율로 혼합한 뒤, LP를 농도별로 0.25, 0.5, 1 mg/mL 첨가하여 48시간 배양한 후, 표적 세포에 대한 lysis 정도를 측정한 결과 대조군(5.50±0.28)에 비해 LP를 첨가한 경우 농도 의존적으로 16.57±2.07, 23.20±4.70, 43.87±2.72 수준의 유의적인 LAKs의 활성을 보였다(Table 1).
- 작동 세포와 표적 세포를 10:1 비율로 혼합한 뒤, LP를 농도별로 0.25, 0.5, 1 mg/mL 첨가하여 48시간 배양한 후, 표적 세포에 대한 lysis 정도를 측정한 결과 대조군으로 동종 항원 반응 비장 세포와 MMC 처리한 동종 항원 비장 세포만을 배양했을 때 분비되는 LDH의 양은 25±0.28이었으며, 여기에 1 mg/mL 농도의 LP를 첨가하였을 때 분비되는 LDH의 양은 32.29±1.03으로 나타나서, 동종 항원 반응 비장 세포의 살해 세포 작용이 유의적으로 증가되는 것을 확인할 수 있었다.
- 이러한 결과를 근거로 항원 특이적인 세포 독성 T 림프구(CTLs)의 활성과 IL-2에 의해 야기되는 비특이적인 림포카인 활성 살해 세포(LAKs)의 세포독성능을 측정하였다. 작동 세포와 표적 세포의 비율을 10:1로 혼합한 뒤, LP를 농도별로 첨가하여 세포 용해 시 발생되는 LDH를 측정한 결과, 동종 항원 반응 비장 세포의 살해 세포 작용이 유의적으로 증가하였으며, LAKs의 활성 또한 유의적으로 증가함을 확인하였다. 그리고 T 림프구의 활성에 직접적으로 관여하는 IL-2의 생산능을 측정한 결과, LP를 첨가한 경우 농도 의존적으로 IL-2의 생산량이 증가됨을 확인하였다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.