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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 유자가 인체의 선천성 면역 증강에 도움을 줄 가능성이 있는지를 알아보고자 유자를 30% 주정으로 추출하였고, in vitro 상에서 면역 증강의 기전을 알아보기 위한 목적으로 in vitro 면역 실험에서 주로 이용되는 마우스의 대식세포 유래 세포주인 RAW264.7을 이용하여 유자 주정추출물이 주는 면역 활성 영향을 평가하였다. 선천성 면역에 미치는 유자 추출물의 영향을 알아보기 위한 연구이므로 면역세포들이 위치하는 보조 면역장기 기관 중 하나인 비장(spleen)의 세포 증식에 유자 30% 주정추출물이 미치는 영향을 측정하였고 외부의 자극이 존재할 때 변화하는 전사인자인 NF-κB의 활성을 확인하였으며, 이로 인해 발현에 영향을 받을 수 있는 염증성 사이토카인과 염증 반응의 주요 요소인 cyclooxygenase(COX)-2와 prostaglandin E(PGE)2의 발현을 확인하였다.
- 이것이 과량 생성되면 전신적 염증을 유발하여 생체에 여러 부정적인 영향을 미칠 수 있으나 적정량의 산화질소 생성은 선천성 면역의 중요한 인자로 여겨진다(13). 따라서 본 연구에서는 정상대조군, LPS만을 처리한 양성대조군과 LPS를 처리하지 않고 CJE를 농도별로 처리한 실험군이 생성해내는 산화질소에 대해 측정하였다. CJE를 처리하였을 때 유도되는 산화질소와 LPS를 처리하였을 때 유도되는 산화질소의 분비량을 비교하여 CJE가 선천성 면역을 활성화시킬 정도의 산화질소를 생성하는지 확인하였고, 그 결과를 Fig.
- 선천성 면역에 미치는 유자 추출물의 영향을 알아보기 위한 연구이므로 면역세포들이 위치하는 보조 면역장기 기관 중 하나인 비장(spleen)의 세포 증식에 유자 30% 주정추출물이 미치는 영향을 측정하였고 외부의 자극이 존재할 때 변화하는 전사인자인 NF-κB의 활성을 확인하였으며, 이로 인해 발현에 영향을 받을 수 있는 염증성 사이토카인과 염증 반응의 주요 요소인 cyclooxygenase(COX)-2와 prostaglandin E(PGE)2의 발현을 확인하였다. 또한 병원균에 감염된 세포를 직접적으로 공격하여 인체의 방어 작용을 담당하는 NK세포 활성에 미치는 유자 주정추출물의 영향과 면역 증강의 가능성을 확인하고자 하였다.
- 유자는 우리나라 남해안 지방에서 나는 감귤류의 일종으로 뛰어난 향과 특유의 산미를 가지고 있고 주로 과육 및 과피를 사용해 유자청으로 제조되어 유자차로 이용되어 왔으며, 유자에 함유되어 있는 hesperitin, naringin, naringenin 등 다량의 플라보노이드 화합물에 의한 항산화 효능이 연구되었다(18). 또한 유자의 오일 내에 존재하는 limonene 성분은 면역세포인 호중구에서 항염증 효과가 있음이 보고되었으나(19), 유자의 선천성 면역기능에 대한 연구는 미비하여 유자 30% 주정추출물을 이용한 면역조절 효능을 평가하고자 하였다.
- 선천성 면역 반응의 중요 인자로 여겨지는 TNF-α나 IL-1β, IL-6, IL-10 등과 같은 사이토카인은 대식세포가 활성화되면 발현이 증가하게 되고 이를 통해 다른 면역세포들의 면역 반응을 촉진시키는 역할을 하게 되는데, CJE가이들 사이토카인 발현에 미치는 효과를 측정하기 위하여 다음의 실험을 계획하였다.
제안 방법
- 따라서 본 연구에서는 정상대조군, LPS만을 처리한 양성대조군과 LPS를 처리하지 않고 CJE를 농도별로 처리한 실험군이 생성해내는 산화질소에 대해 측정하였다. CJE를 처리하였을 때 유도되는 산화질소와 LPS를 처리하였을 때 유도되는 산화질소의 분비량을 비교하여 CJE가 선천성 면역을 활성화시킬 정도의 산화질소를 생성하는지 확인하였고, 그 결과를 Fig. 3에 나타내었다. 양성대조군은 대조군에 비해 약 4배가량 많은 양의 산화질소를 생성하였고 CJE는 25 μg/mL의 농도에서부터 300 μg/mL까지 산화질소의 분비가 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였으나, CJE 300 μg/mL와 500 μg/mL 사이에서는 산화질소의 증가에 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다.
- CJE의 RAW264.7 세포에 대한 최적 처리 농도를 결정하기 위하여 WST(Water Soluble Tetrazolium Salt) 시약인 EZ-CYTOX Cell Viability assay kit(DAEIL LAB SERVICE Co., Ltd., Seoul, Korea)을 이용하여 살아 있는 세포의 양을 측정하였다. RAW264.
- COX-2의 발현은 realtime PCR 기법을 통해 검증하였는데, RAW264.7 세포의 NF-κB 활성을 확인하기 위한 상기 실험과 같은 조건으로 처리한 뒤 RNeasy extraction kit(Qiagen)으로 제조사의 실험방법에 따라 RNA를 분리하였다.
- NF-κB의 활성을 확인하기 위해서는 세포 핵 내로 전좌된 NF-κB의 측정이 필요하므로 핵 단백 추출물을 얻은 다음 이 용균액을 이용하여 실험을 진행하였고, 측정은 Trans-AM NF-κB Chemiluminescence kit(Active Motif, Carlsbad, CA, USA)을 이용하였다.
- NK 세포와 YAC-1 세포를 96 well plate에 여러 농도별 CJE와 함께 분주하여 37°C, 5% CO2 조건에서 4시간동안 배양한 후 유리된 LDH를 LDH-Cytotoxicity Colorimetric assay kit Ⅱ(Biovision, Milpitas, CA, USA)로 kit의 protocol을 따라 측정하였다.
- RAW264.7 세포는 1×104 cells/well이 되도록 96 well cell culture plate(SPL Life Science, Pocheon, Korea)에 분주하여 안정화시킨 후 유자 추출물을 25, 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1,000 μg/mL의 농도가 되도록 DMEM 배지에 희석하여 48시간 동안 배양하였다.
- RAW264.7 세포를 1×104 cells/well이 되도록 96 well cell culture plate(SPL Life Science)에 분주하여 안정시킨 후 DMEM 배지에 희석한 CJE를 농도별(25, 50, 100, 300, 500 μg/mL)로 처리하였고, 양성대조군으로 1 μg/mL의 lipopolysaccharide(LPS, Sigma-Aldrich Co., St. Louis,MO, USA)를 처리하여 24시간 배양하였다.
- RAW264.7 세포를 60 mm cell culture dish에 5×106 cells/well의 농도로 분주하여 안정화시킨 후 CJE 25, 50, 100, 300, 500 μg/mL와 양성대조군으로 설정한 LPS 1 μg/mL를 4시간 동안 처리한 다음 RNeasy extraction kit(Qiagen, Gaithersburg, Maryland, USA)으로 제조사의 실험방법에 따라 RNA를 분리하였다.
- RAW264.7 세포를 60 mm culture dish에 5×106 cells/well의 농도로 분주하여 안정화시킨 다음 여기에 CJE는 농도별로, LPS는 1 μg/mL를 24시간 동안 처리하였다.
- )로 적혈구를 제거하였다. YAC-1 세포(NK-sensitivecell line)는 NK 세포에 의해 공격되는 세포로 YAC-1 세포가 NK 세포에 의해 공격을 받아 배지에 유리된 lactate dehydrogenase(LDH)를 측정하여 NK 세포의 활성을 측정하였다. NK 세포와 YAC-1 세포를 96 well plate에 여러 농도별 CJE와 함께 분주하여 37°C, 5% CO2 조건에서 4시간동안 배양한 후 유리된 LDH를 LDH-Cytotoxicity Colorimetric assay kit Ⅱ(Biovision, Milpitas, CA, USA)로 kit의 protocol을 따라 측정하였다.
- 따라서 선천성 면역 반응의 촉진, 증강의 가능성 및 그 기전을 확인하기 위해 NF-κB의 활성도, COX-2의 발현, PGE2의 생성량을 측정하였고 그 결과를 Fig. 2에 나타내었다.
- 또한 PGE2는 상등액을 이용하여 측정하는 실험으로, prostaglandin E2 parameter assay kit(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)을 구입하여 제조사의 실험 방법에 따라 측정하였다.
- 본 연구에서 측정한 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6는 대식세포에 분비되는 사이토카인인데, 이들을 측정함으로써 대식세포의 면역 활성을 예측할 수 있다.
- 7 세포를 60 mm cell culture dish에 5×106 cells/well의 농도로 분주하여 안정화시킨 후 CJE 25, 50, 100, 300, 500 μg/mL와 양성대조군으로 설정한 LPS 1 μg/mL를 4시간 동안 처리한 다음 RNeasy extraction kit(Qiagen, Gaithersburg, Maryland, USA)으로 제조사의 실험방법에 따라 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA로 PrimeScriptTM Reverse Transcriptase(Takara Bio Inc.)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(Roche Diagnostics)를 이용하여 real-time PCR을 PIKOREAL 96(Thermo Scientific) 기기를 이용하여 실시하였다.
- 7 세포의 NF-κB 활성을 확인하기 위한 상기 실험과 같은 조건으로 처리한 뒤 RNeasy extraction kit(Qiagen)으로 제조사의 실험방법에 따라 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA로 PrimeScriptTM Reverse Transcriptase(Takara Bio Inc., Shiga, Japan)를 사용하여 cDNA를 합성하였고, 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 FastStart Universal SYBRGreen Master(ROX)(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany)를 사용한 real-time PCR을 PIKOREAL 96(Thermo Scientific, Tewksbury, MA, USA) 기기를 이용하여 실시하였다. 분석에 사용한 각각의 primer의 염기서열은 GAPDH forward 5'-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA-3', reverse 5'-GCG GCA CGT CAG ATC CA-3', COX-2 forward 5'-CCA GCA CTT CAC CCA TCA GTT-3', reverse 5'-ACC CAG GTC CTC GCT TAT GA-3'이었다.
- 비장세포의 증식능에 미치는 유자 추출물의 영향을 측정하기 위하여 마우스에서 분리한 비장세포를 96 well plate에 1×105 cells/well이 되도록 분주하고 CJE를 농도별로 처리하였다.
- 비장은 40 μm size cells trainer(SPL Life Science)에서 마쇄하여 RPMI-1640(HyClone Laboratories)에 10% fetal bovine serum(FBS,HyClone Laboratories)과 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin(HyClone Laboratories)을 첨가한 배지로 세척한 후, red blood cell lysing buffer(Sigma-AldrichCo.)로 적혈구를 제거하였다.
- 선천성 면역 반응의 중요 인자로 여겨지는 TNF-α나 IL-1β, IL-6, IL-10 등과 같은 사이토카인은 대식세포가 활성화되면 발현이 증가하게 되고 이를 통해 다른 면역세포들의 면역 반응을 촉진시키는 역할을 하게 되는데, CJE가이들 사이토카인 발현에 미치는 효과를 측정하기 위하여 다음의 실험을 계획하였다. 산화질소 생성능의 평가 시험 방법과 마찬가지로 어떤 처리도 하지 않은 정상대조군, LPS만을 처리한 양성대조군, CJE를 농도별로 처리한 실험군이 발현해내는 사이토카인을 real-time PCR을 통하여 측정하였다. Fig.
- )을 넣어 상온에서 15분간 반응시킨 후 microplate reader(Molecular Devices)에서 흡광도 540 nm로 측정하였다. 산화질소의 농도는 질산화나트륨(sodium nitrite, NaNO2, Sigma-Aldrich Co.)을 이용하여 얻은 표준곡선으로 계산하였다.
- 선천성 면역에 미치는 유자 추출물의 영향을 알아보기 위한 연구이므로 면역세포들이 위치하는 보조 면역장기 기관 중 하나인 비장(spleen)의 세포 증식에 유자 30% 주정추출물이 미치는 영향을 측정하였고 외부의 자극이 존재할 때 변화하는 전사인자인 NF-κB의 활성을 확인하였으며, 이로 인해 발현에 영향을 받을 수 있는 염증성 사이토카인과 염증 반응의 주요 요소인 cyclooxygenase(COX)-2와 prostaglandin E(PGE)2의 발현을 확인하였다.
- 세포배양을 위한 배지의 조성을 RAW264.7 세포는 DMEM(HyClone Laboratories, Logan, UT, USA)에, YAC-1 세포는 RPMI-1640(HyClone Laboratories)에 각각 10%fetal bovine serum(FBS, HyClone Laboratories)과 100U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin(HyClone Laboratories)을 첨가하였고 37°C, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
- 양성대조군으로 Concanavalin A(Sigma-AldrichCo.) 1 μg/mL를 처리하여 48시간 배양하고 여기에 EZCYTOX Cell Viability assay kit(DAEIL LAB SERVICECo., Ltd.)을 처리하고 37°C, 5% CO2 조건에서 3시간 동안 반응시켜 microplate reader(Molecular Devices)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 염증반응의 주요 요소인 NF-κB, COX-2, PGE2의 발현능을 확인하기 위하여 다음과 같은 방법으로 실험을 진행하였다.
- 유자 30% 주정추출물(CJE)의 면역력 효능 평가의 안전범위 확인을 위해 마우스 유래 대식세포주인 RAW264.7을 이용하여 최저 농도 25 μg/mL에서부터 최고 농도인 1,000μg/mL로 48시간 동안 처리하였다.
- Concanavalin A(Con A)는 in vitro 상에서 마우스 T 세포의 자극을 위해 처리하는 물질로 T 세포의 활성화, 증식,CD4와 CD8 세포로의 분화를 유도하게 된다(11). 이러한 특징으로 인해 Con A를 양성대조군으로 사용하게 되었고 그와 비교하여 CJE 추출물이 마우스의 비장세포 증식에 어떤 영향을 주는지 측정하였다. Fig.
대상 데이터
- 6~7주령 male ICR 마우스는 오리엔트바이오(Seongnam, Korea)에서 구입하였고, 서울아산병원 아산생명과학연구원 실험동물실험실(IACUC 승인번호: 2014-12-177)의 연구 지침에 따라 이산화탄소를 이용한 안락사 방법을 통해 희생시켜 비장을 적출하였다. 비장은 40 μm size cells trainer(SPL Life Science)에서 마쇄하여 RPMI-1640(HyClone Laboratories)에 10% fetal bovine serum(FBS,HyClone Laboratories)과 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin(HyClone Laboratories)을 첨가한 배지로 세척한 후, red blood cell lysing buffer(Sigma-AldrichCo.
- RAW264.7 세포는 마우스 유래의 대식세포이고, YAC-1세포는 마우스 림프종 유래 세포로 두 세포주 모두 경희대학교 의학영양학과(Suwon, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 세포배양을 위한 배지의 조성을 RAW264.
- 본 연구에서는 유자가 선천성 면역력에 미치는 효과를 알아보기 위하여 유자 30% 주정추출물(CJE)을 사용하였으며 선천성 면역에 중요한 역할을 하는 대식세포를 이용해 실험하였다. CJE는 마우스 대식세포인 RAW264.
- 분석에 사용한 각각의 primer의 염기서열은 GAPDH forward 5'-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA-3', reverse 5'-GCG GCA CGT CAG ATC CA-3', COX-2 forward 5'-CCA GCA CTT CAC CCA TCA GTT-3', reverse 5'-ACC CAG GTC CTC GCT TAT GA-3'이었다.
- 분석에 사용한 각각의 primer의 염기서열은 GAPDHforward 5'-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA-3', reverse 5'-GCG GCA CGT CAG ATC CA-3', TNF-α forward 5'-CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACAA-3', reverse 5'-TGG GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC-3', IL-1β forward 5'-GGA GAA CCA AGC AACGAC AAA ATA-3', reverse 5'-TGG GGA ACT CTGCAG ACT CAA AC-3', IL-10 forward 5'-GGT TGCCAA GCC TTA TCG GA-3', reverse 5'-ACC TGC TCCACT GCC TTG CT-3', IL-6 foward 5'-GTT TTC TGCAAG TGC ATC ATC G-3', reverse 5'-GGT TTC TGC AAG TGC ATC ATC G-3'와 같다.
- 유자 30% 주정추출물(Citrus junos Sieb. ex Tanaka ethanol extract; CJE) 제조에 사용된 유자는 경일약업사(Yeongcheon, Korea)에서 구입하였고, 30%의 에탄올을 포함하는 정제수 혼합용액으로 추출한 후 추출액을 Whatman No.4 filter paper(Whatman plc, Kent, UK)로 여과하였다. 이를 감압농축기를 사용하여 추출용매를 제거한 후 동결건조 하여 분말 형태의 추출물을 다시 멸균한 3차 증류수에 녹여서 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3번 이상 반복하여 평균값과 오차를 구하여 나타내었고, 통계처리는 SPSS(Statistical Package forSocial Science, version 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 통계프로그램을 이용하여 one way ANOVA test로 분석하였으며, 실험군 간의 유의성은 Duncan's multiplerange test로 P<0.05 수준에서 비교하였다.
이론/모형
- )를 사용하여 cDNA를 합성하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(Roche Diagnostics)를 이용하여 real-time PCR을 PIKOREAL 96(Thermo Scientific) 기기를 이용하여 실시하였다. 분석에 사용한 각각의 primer의 염기서열은 GAPDHforward 5'-CAT GGC CTT CCG TGT TCC TA-3', reverse 5'-GCG GCA CGT CAG ATC CA-3', TNF-α forward 5'-CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACAA-3', reverse 5'-TGG GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC-3', IL-1β forward 5'-GGA GAA CCA AGC AACGAC AAA ATA-3', reverse 5'-TGG GGA ACT CTGCAG ACT CAA AC-3', IL-10 forward 5'-GGT TGCCAA GCC TTA TCG GA-3', reverse 5'-ACC TGC TCCACT GCC TTG CT-3', IL-6 foward 5'-GTT TTC TGCAAG TGC ATC ATC G-3', reverse 5'-GGT TTC TGC AAG TGC ATC ATC G-3'와 같다.
성능/효과
- 양성대조군은 대조군에 비해 약 4배가량 많은 양의 산화질소를 생성하였고 CJE는 25 μg/mL의 농도에서부터 300 μg/mL까지 산화질소의 분비가 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였으나, CJE 300 μg/mL와 500 μg/mL 사이에서는 산화질소의 증가에 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다.
- 500 μg/mL의 농도에서는 대조군에 비해 130%의 증식 활성을 보였지만 면역반응 매개체(immune modulator)인 LPS로 자극을 주었을 때보다는 낮은 증가를 보였다.
- CJE 처리에 의해 RAW264.7에서 TNF-α와IL-1β, IL-6의 유전자 발현은 LPS 처리군보다는 낮았으나CJE에 농도 의존적으로 증가하였고, 특히 300 μg/mL의 농도에서부터 유전자 발현이 증가하는 결과를 보였다.
- CJE 처리한 실험군에서도 농도 의존적인 경향을 보이며 활성도가 증가하는 것을 알 수 있었는데, 특히 300~500 μg/mL의 농도에서 유의미한 차이를 보였다.
- CJE 추출물은 NK 세포의 활성에 농도 의존적으로 영향을 주는 것으로 나타났으며, 특히 300μg/mL의 농도에서부터 정상대조군 대비 유의적인 차이를 보이는 것으로 나타났다.
- CJE가 면역반응에 미치는 영향을 측정하고 선천성 면역 증진의 가능성을 확인하기 위한 실험을 진행하였는데, NF-κB의 활성도, COX-2의 발현, PGE2의 분비는 CJE에 농도 의존적으로 증가하는 것을 알 수 있었다.
- 산화질소 생성능과 대식세포에서 분비되는 사이토카인인 TNF-α, IL-1β의 발현을 대조군에 비해 농도 의존적으로 증가시킨다는 결과를 얻었으나, IL-6에서는 통계적으로 약간의 유의성이 있는 증가를 보였고 IL-10은 정상대조군에 비해 거의 유의적인 차이를 보이지 않았다. CJE는 또한 NK 세포의 활성을 농도 의존적으로 증가시키고 비장세포의 증식능도 농도 의존적으로 증가시킨다는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 미루어보아 CJE는 인체의 대식세포 활성의 증가를 통해 선천성 면역력을 증가시킬 것으로 판단된다.
- CJE는 마우스 대식세포인 RAW264.7에서 1,000 μg/mL의 최고 농도까지 세포독성을 보이지 않았고, 전사인자 NF-κB와 염증성 매개물질인 COX-2, PGE2의 활성 및 발현 증강에 영향을 미치며, 특히 300 μg/mL의 농도에서부터 유의적 차이를 보이는 것으로 확인되었다.
- CJE만 처리한 실험군에서 CJE 농도 의존적으로 IL-1β의 발현이 증가하는 경향을 가진다는 결과를 얻었고, 특히 500 μg/mL의 농도에서는 LPS군과 비슷한 수준까지 증가하는 것을 확인하였다.
- CJE만을 농도별로 처리하였을 때 NF-κB 활성 결과와 마찬가지로 300~500 μg/mL의 농도에서 유의적인 차이를 보이며 COX-2의 발현이 증가하는 경향을 보였다.
- CJE의 NF-κB 활성, COX-2의 발현, PGE2의 분비 증강은 양성대조군인 LPS 처리군에 비해 모두 유의적으로 낮은 수치를 기록했다(P<0.05).
- CJE의 산화질소 분비능은 양성대조군인 LPS 처리군보다는 모두 유의적으로 낮았다(P<0.05).
- Fig. 2C는 PGE2의 분비를 측정한 결과로, 앞선 두 결과와 마찬가지로 정상대조군 대비 양성대조군에서 유의적으로(약 6배 이상) 증가하였고 300~500 μg/mL의 농도에서 유의미한 차이를 보이며 분비량이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
- Fig. 4B는 단핵구나 대식세포등에서 분비되어 T 세포를 활성화시키는 것으로 알려진 IL-1β의 발현을 측정한 결과로, LPS에 의해 양성대조군의 IL-1β 발현량이 정상대조군에 비해 약 2배가량 증가한 것을 알 수 있었다.
- Fig. 6의 결과에서 알 수 있듯이 CJE는 농도 의존적으로 마우스 비장세포의 증식을 촉진시키며, 특히 300 μg/mL의 농도에서부터 정상대조군 대비 유의적인 차이를 나타내는 것을 확인하였다.
- 4D는 Th2 세포에서 생성되는 사이토카인 IL-10의 발현을 나타낸 그래프인데, IL-10은 Th1 세포에서 생성하는 TNF-α나 IL-1β, IL-6의 생산을 억제적으로 조절하여 여러 가지 염증성 사이토카인 생성의 균형을 조절하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. IL-10의 발현은 정상대조군 대비 양성대조군에서만 약 2배가량 유의적으로 발현이 증가함이 나타났으며, 정상대조군과 양성대조군에 비해 CJE 처리군에서는 통계적으로 유의미한 차이는 보이지 않았다.
- 4C는 B 세포 분화 활성을 가진 사이토카인 IL-6의 발현을 확인한 그래프로, CJE 300 μg/mL 이하의 농도에서는 유의미한 변화를 보이지 못하였지만 300~500 μg/mL의 농도에서 정상대조군과 유의적인 발현량의 차이를 보이는 것을 확인하였다. 그러나 양성대조군의 발현량에 대하여 약 64% 정도의 발현량을 보였으며, 이는 정상대조군과 현격한 차이를 보이지는 못하였다. Fig.
- 본 연구에서 CJE의 대식세포의 산화질소 생성능은 양성대조군인 LPS에 의한 산화질소 생성능보다 높지는 않았지만 농도 의존적으로 증가하는 경향을 보였고 300 μg/mL의 농도에서부터 유의적인 차이를 보였으며, 500 μg/mL 이후의 농도에서는 그 증가가 크지 않아 산화질소 생성의 유효 농도는 300~500 μg/mL로 사료된다(데이터 제시 안함).
- 본 연구에서는 대식세포의 탐식작용(phagocytosis assay)을 직접적으로 측정하지는 않았지만, 대식세포가 활성화되었을 때 증가하는 지표인 NF-κB, COX2, PGE2, 산화질소, TNF-α, IL-1β 등의 유전자 발현 증가를 확인하였다.
- 산화질소 생성능과 대식세포에서 분비되는 사이토카인인 TNF-α, IL-1β의 발현을 대조군에 비해 농도 의존적으로 증가시킨다는 결과를 얻었으나, IL-6에서는 통계적으로 약간의 유의성이 있는 증가를 보였고 IL-10은 정상대조군에 비해 거의 유의적인 차이를 보이지 않았다.
- 세포 실험에 사용할 유자 추출물의 최적 농도를 결정하기위해 실시한 세포독성 시험에서 유자 30% 주정추출물(CJE)은 최저 농도 25 μg/mL에서부터 최고 농도 1,000 μg/mL까지 RAW264.7 세포에 처리한 결과 최고 농도에서도 48시간까지 독성을 나타내지 않았다.
- 세포에 처리된 CJE 추출물의 농도가 증가할수록 TNF-α의 발현이 증가하는 경향을 보였으나, 500 μg/mL의 농도에서 보인 결과가 정상대조군에 비해 유의적인 차이를 보였고 그 이하의 농도에서는 정상대조군과 유의미한 차이를 보이지는 못했다.
- 이러한 결과들을 통해 CJE가 NF-κB의 활성을 높이고 이를 통해 COX-2의 발현이 증가되도록 하여 PGE2의 분비에도 영향을 미친다는 것을 알 수 있었다.
- CJE는 또한 NK 세포의 활성을 농도 의존적으로 증가시키고 비장세포의 증식능도 농도 의존적으로 증가시킨다는 것을 확인하였다. 이러한 결과로 미루어보아 CJE는 인체의 대식세포 활성의 증가를 통해 선천성 면역력을 증가시킬 것으로 판단된다.
- 본 연구에서는 대식세포의 탐식작용(phagocytosis assay)을 직접적으로 측정하지는 않았지만, 대식세포가 활성화되었을 때 증가하는 지표인 NF-κB, COX2, PGE2, 산화질소, TNF-α, IL-1β 등의 유전자 발현 증가를 확인하였다. 이를 통해 CJE는 대식세포가 활성화되어 탐식작용과 같은 면역기능에도 도움을 줄 수 있을 것이라는 결론을 내리게 되었다. 또한 CJE는 NK 세포의 활성을 높이도록 도와주고 비장세포의 증식을 촉진시키는 것으로 Fig.
후속연구
- 이러한 결과는 CJE의 투여가 비장세포를 증식시키는 mitogen 활성이 있음을 보여주는 것으로, 외부의 항원에 노출되었을 때 CJE가 항원에 대한 면역반응을 유도하는 면역세포의 수를 증가시킴으로써 항원에 대한 효과적인 방어에 도움을 줄 것이며, 세포실험 상에서 면역증강에 도움을 줄 수 있는 농도는 300~500 μg/mL이므로 이를 바탕으로 추후에 실험동물을 이용한 in vivo 후속 연구를 통해 CJE를 이용한 면역증강 기능성식품 개발이 가능할 것으로 여겨진다.
- 최고 농도인 1,000 μg/mL로 48시간 처리한 결과 세포 생존율이 대조군과 거의 비슷하거나 오히려 세포생존에 도움을 주는 것으로 나타났으므로 추가적인 안전성 검증을 통하여 CJE의 식품으로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
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