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문제 정의
- 그러나, 현재까지 전통주 발효에 원형질체 융합방법을 이용하여 전분분해활성과 알코올 발효능을동시에 보유하는 효모융합체를 개발하고 이를 응용한 산업화는 아직 되어있지 않다. 따라서, 본 연구에서는 알코올 발효 능이 우수한 효모와 전분분해능이 우수한 효모를 원형질체 융합방법을 이용하여 새로운 효모 융합체를 개발하고 그중에서 두 가지 특성이 모두 우수한 융합체를 선발하여 관능적인 특성 변화 및 누룩대체 효과 가능성 등을 검토하고자 한다.
제안 방법
- 2일동안 배양한 것을 1세대로 하여 이 과정을 10세대 동안 반복하였다. 10세대의 배양액을 채취하여 적당한 배율로 희석한 후, YPD 고체배지와 SD 고체배지에 도말한 뒤 , 각각의 고체배지에 나타난 colony수의 비율로 융합 주의 유전적 안정성을 조사하였다.
- 전분분해능이 우수한 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주는 Trp의 영양요구성 marker가 있음을 확인하였고 알코올 발효능이 우수한 Saccharomyces cerevisiae KOY-1 균주에서 단수체로 분리된 KH-12 균주는 영양요구성 marker 를 보유하지 않아 KH-12 균주에 ethylemethane sulfonate (EMS>를 사용하여 genetic marker를 보유한 영 양요구성 변이주를 제조하였다. EMS 처리는 90% 이상의 사멸율을 나타내는 구간인 120분간 처리하였다. 그 결과 7주의 영양요구성 변이주를 획득하였고, 이들은 Trp와 로 확인되었다.
- 5 mL 첨가하여 1 시간동안 방치하였다. 상등액을 취해 YPD plate에 도말한 후 sporulation 배지에 배양하여 포자 형성유무를 확인하였다.
- 선발융합체의 알코올 발효능은 dextrose 기질로 제조한 YPD24 배지 (Fig. 3), soluble starch 기질로 제조한 YPS24 배지 (Fig. 4)에서 각각 조사하였다. 알코올 발효능이 우수한 모 균주인 Saccharomyces cerevisiae KOY-1 균주는 YPD24 배지에서 60시간 발효시 알코올 생성랑은 17 mg/mL이었지만, YPS24 배지에서는 알코올 생성이 거의 일어나지 않았다.
- 알코올 발효능 측정은 YPD24 배지에서 2일간 배양한 배양 상등액 100 mL를 이용하여 ethanol kit (Roche, German) 를 이용하여 측정하였다.
- 영양요구성 변이주 형성 확인을 위해 사용한 SD 배지는 0.67% (w/v) yeast nitrogen base w/o amino acid, 2% (w/v) dextrose로 이루어진 최소배지에 20종의 amino acid를 각각 첨가하여 제조하였다.
- 원형질체 재생 배지는 YPD 배지에 삼투안정제로 1.2 M sorbitol, 3% (w/v) aga를 첨가하여 사용하였다. 균주배양은 30℃ incubator(Vision scientific co.
- 처리된 현탁액을 원심분리(1,000 xg, 3 min)하여 상등액을 제거하고 protoplast bufferS- 세척한 후 희석하여 원형질체 재생배지에 도말한 뒤 colony 형성 유무를 확인하였고 융합 유무는 효모중의 total DNA 함량측정 비교를 통해 확인하였다. 융합체를 YPD 배지에서 배양한 후 0.5 N perchloric acid(244252, Sigma, USA) 10 tn止에 현탁한 후 70℃, 20분간 2회 처리하여 DNA를 주줄한 뒤 1% (w/v) diphenylamine (33149, Sigma, USA)과 2.75% (v/v) sulfuric acid가 함유되어 있는 diphenylamine solution에 의한 흡광도 값을 이용하여 다음 식에 의해 계산하였다.
- 40 fg/cell의 DNA 함량을 나타내었다. 이들을 사용해서 얻어진 융합체인 FA 776의 DNA 함량은 42.67 fg/cell로 나타났으며 이를 통하여 세포융합의 유무를 관찰하였다(Table 5).
- 전분분해능 측정을 위한 YPS 배지는 YPD 배지에서 dextrose를 제거하고 2% (w/v) soluble starch를 첨가하여 제조하였다. 알코올 발효능 측정을 위한 YPD24 배지는 dextrose 함량을 24% (w/v)로 제조하였다.
- 한다. 전분분해능이 우수한 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주는 Trp의 영양요구성 marker가 있음을 확인하였고 알코올 발효능이 우수한 Saccharomyces cerevisiae KOY-1 균주에서 단수체로 분리된 KH-12 균주는 영양요구성 marker 를 보유하지 않아 KH-12 균주에 ethylemethane sulfonate (EMS>를 사용하여 genetic marker를 보유한 영 양요구성 변이주를 제조하였다. EMS 처리는 90% 이상의 사멸율을 나타내는 구간인 120분간 처리하였다.
- 5 mL 첨가하여 30℃, 30분간 방치하였다. 처리된 현탁액을 원심분리(1,000 xg, 3 min)하여 상등액을 제거하고 protoplast bufferS- 세척한 후 희석하여 원형질체 재생배지에 도말한 뒤 colony 형성 유무를 확인하였고 융합 유무는 효모중의 total DNA 함량측정 비교를 통해 확인하였다. 융합체를 YPD 배지에서 배양한 후 0.
- 8 mL을 첨가하여 반응을 중지흐]였다. 형성된 변이주의 영양요구성 marker 탐색은 amino acid pool 을 이용하여 수행하였다(2).
- 효모를 0.05 M Tris-HCI(pH 7.5)로 세척한 다음, 0.05 M Tris-HCl buffer(pH 7.5)와 1.2 M sorbitol(T-1378, Sigma, USA)로 구성된 protoplast buffer에 현탁하였다. 1M 2-mercaptoethanol(M-3148, Sigma, USA) 0.
- 효모의 total DNA 함량의 비교를 통해 두 효모간 융합 유무를 관찰하였다. 선발융합체의 colony를 취하여 total DNA 함량을 비교한 결과, Saccharomyces cerevisiae 균주로부터 분리된 단수체 효모 KH-12는 26.
- 효모의 단수체 유도에 사용한 presporulation 배지는 10% (w/v) dextrose, 0.3% (w/v) peptone, 0.8% (w/v) yeast extract로 제조하였고, sporulation 배지는 1% (w/v) potassium acetate, 0.5% (w/v) dextrose, 0.1% (w/v) yeast extract 로 제조호였다[3].
대상 데이터
- not shown). 1차 선발된 융합체 10주의 알코올 발효능을 각각의 모균주인 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주, Saccharomyces cerevisiae KOY-1 균주와 비교하여 최종적으로 전분배지에서의 알코올 생성능이 가장 우수한 융합체 인 FA 776을 선발하였다(Fig. 2).
- 그 결과 7주의 영양요구성 변이주를 획득하였고, 이들은 Trp와 로 확인되었다. Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주는 Trp 영양요구성 marker/} 있기 때문에 Saccharomyces cerevisiae KH-12 균주는 Met 영양요구성 markei가 있는 변이주를 사용하였다.
- 단수체 유도 후, 총 13 개의 colony를 선발하여 효모의 total DNA 함량을 비교한 결과는 Table 1에 나타난 것처럼 모균주인 Saccharomyces cerevisiae KOY-1과 비교하였을 때 KH-12의 DNA 함량 이모 균주의 절반 정도임을 확인할 수 있었다. 따라서 marker 로 사용하기 위한 영양요구성 변이주 제조에는 분리된 단 수 체 KH-12를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 전분분해능이 우수한 Sacchammyces diastaticus KCTC 1804 균주는 한국유전자은행에서 분양받았고, 알코올 발효능이 우수한 Saccharomyces cerevisiae KOY-1 균주는 (주)국순당에서 분양받아 사용하였다.
- 전분분해능 측정을 위한 YPS 배지는 YPD 배지에서 dextrose를 제거하고 2% (w/v) soluble starch를 첨가하여 제조하였다. 알코올 발효능 측정을 위한 YPD24 배지는 dextrose 함량을 24% (w/v)로 제조하였다.
- 원형질체 융합과정을 통해 총 1,000주의 융합체를 획득하였고, 획득한 융합체의 전분 분해능을 모균주인 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주와 비교하여 전분분해능이 모 균주와 비슷하거나 혹은 높아진 효모 10주를 1차 선발하였다(data not shown). 1차 선발된 융합체 10주의 알코올 발효능을 각각의 모균주인 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주, Saccharomyces cerevisiae KOY-1 균주와 비교하여 최종적으로 전분배지에서의 알코올 생성능이 가장 우수한 융합체 인 FA 776을 선발하였다(Fig.
- 효모의 성장배지로 사용한 YPD 배지는 1% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) peptone, 2% (w/v) dextrose로 제조하였다. 전분분해능 측정을 위한 YPS 배지는 YPD 배지에서 dextrose를 제거하고 2% (w/v) soluble starch를 첨가하여 제조하였다.
이론/모형
- 영양요구성 marker를 보유한 선발균주의 원형질체 형성율은 증류수 같은 삼투압이 매우 낮은 용액내에서는 원형질체가 용균된다는 사실에 근거한 Yamamura의 방법 [19]을 사용하여 계산하였다. Kim[8]은 Saccharomyces cerevisiae 균주의 원형질체 형성율을 95%로 보고하였는데 본 실험에서는 Saccharomyces diastaicus KCTC 1804 균주의 원형질체 형성율은 97.
- 2 mL을 첨가하여 30P에서 15분동안 처리한 후 200 U/mL lyticase를 첨가하여 30℃에서 1시간동안 처리하였다. 원형질체 형성율은 Yamamura의 방법 [19]을 사용하여 다음 식에 의해 계산하였다.
- 5% (w/v) soluble starch, 배양상등액 50 mL를 조효소액으로 사용하였다. 이혼합액을 30P에서 30분간 반응시킨 후 Somogyi and Nelson 방법 [1가을 통해 환원당을 측정하였다.
- 효모융합은 Wilson 등의 방법 [18]을 기초로 하였다. 효모 융합에 사용한 polyethylene glycol solution(PEG)은 polyethylene glycol 4, 000(Yakuri, Japan)을 0.
성능/효과
- Sporulation 배지에서 배양한 후 단수체를 유도한 결과, malachite green으로 염색하였을 때, 포자는 대조염색과 비교하여 녹색으로 관찰되었다(Fig. 1). 알코올 발효능이 우수한 Saccharomyces cerevisiae KOY-1의 경우, 이배체 상태로 관찰되었고 전분 분해능이 우수한 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804의 경우, 단수체 상태인 것으로 관찰되었다.
- EMS 처리는 90% 이상의 사멸율을 나타내는 구간인 120분간 처리하였다. 그 결과 7주의 영양요구성 변이주를 획득하였고, 이들은 Trp와 로 확인되었다. Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주는 Trp 영양요구성 marker/} 있기 때문에 Saccharomyces cerevisiae KH-12 균주는 Met 영양요구성 markei가 있는 변이주를 사용하였다.
- 따라서 효모의 단수체 유도는 Saccharomyces cerevisiae KOY-1 에서만 실시하였다. 단수체 유도 후, 총 13 개의 colony를 선발하여 효모의 total DNA 함량을 비교한 결과는 Table 1에 나타난 것처럼 모균주인 Saccharomyces cerevisiae KOY-1과 비교하였을 때 KH-12의 DNA 함량 이모 균주의 절반 정도임을 확인할 수 있었다. 따라서 marker 로 사용하기 위한 영양요구성 변이주 제조에는 분리된 단 수 체 KH-12를 사용하였다.
- 알코올 발효능이 우수한 모 균주인 Saccharomyces cerevisiae KOY-1 균주는 YPD24 배지에서 60시간 발효시 알코올 생성랑은 17 mg/mL이었지만, YPS24 배지에서는 알코올 생성이 거의 일어나지 않았다. 따라서, 전분을 기질로 사용한 배지 내에서 Saccharomyces cerevisiae KOY-1 균주를 이용한 알코올 발효는 불가능흐}다는 사실을 확인하였다. 전분분해능이 우수한 모균주인 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주는 YPD24 배지에서 60시간 발효시 알코올 생성량은 11 mg/mL이었고, YPS24 배지에서의 알코올 생성량은 7 mg/mL이었다.
- 관찰하였다. 선발융합체의 colony를 취하여 total DNA 함량을 비교한 결과, Saccharomyces cerevisiae 균주로부터 분리된 단수체 효모 KH-12는 26.56 fg/cell, Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주는 25.40 fg/cell의 DNA 함량을 나타내었다. 이들을 사용해서 얻어진 융합체인 FA 776의 DNA 함량은 42.
- 1). 알코올 발효능이 우수한 Saccharomyces cerevisiae KOY-1의 경우, 이배체 상태로 관찰되었고 전분 분해능이 우수한 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804의 경우, 단수체 상태인 것으로 관찰되었다. 따라서 효모의 단수체 유도는 Saccharomyces cerevisiae KOY-1 에서만 실시하였다.
- 원형질체 융합율은 삼투안정제가 포함된 SD배지에서 생성된 colony 수를 삼투안정제가 포함된 YPD 배지에서 생성된 colony 수와의 비율로 계산하였고, 그 결과 원형질체 융합율은 1.79x10-4로 관찰되었다(Table 3). 이 결과는 Kim [18]이 보고한 6x IO% 보다 더 높은 원형질체 융합율을 나타내었다.
- 전분분해능이 우수한 모균주인 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주는 YPD24 배지에서 60시간 발효시 알코올 생성량은 11 mg/mL이었고, YPS24 배지에서의 알코올 생성량은 7 mg/mL이었다. 이 결과는 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주가 dextrose를 기질로 사용한 배지에서의 알코올 생성량은 Saccharomyces cerevisiae KOY-1 균주에 비해 떨어지지만, 전분을 기질로 사용한 배지에서는 Saccharomyces cerevisiae KOY-1 균주와는 반대로 알코올 발효가 가능하다는 사실을 확인할 수 있었다.
- 효모 융합체를 YPD 배지에서 2일간 배양한 것을 1세대로 하여 10세대 동안 반복한 두] , YPD 고체배지와 SD 고체 배지에 각각 도말하여 나타난 colony 수의 비율로써 융합체의 유전적 안정성을 조사한 결과, 선발된 융합체 FA 776은 10세대 계대 배양시 4.64%의 비율로 revertant로 복귀하여 비교적 유전적 안정성이 유지되는 것으로 사료되었다(Table 4).
- 효모융합체 FA 776의 경우 dextrose를 기질로 사용한 YPD24 배지에서 60시간 발효하였을 때의 알코올 생성량은 13 mg/mL, soluble starch를 기질로 사용한 YPS24 배지에서의 알코올 생성량은 13 mg/mL로, dextrose를 기질로 사용한 배지에서의 알코올 생성량이 Saccharomyces cerevisiae K0Y1 균주와 유사하였고, 전분을 기질로 사용한 배지에서의 알코올 생성량은 Saccharomyces diastaticus KCTC 1804 균주와 비교하였을 때 1.86배 향상된 알코올 발효능을보유하는 것으로 확인되었다(Table 6). 따라서 전분분해 활성을 가진 알코올발효 효모인 FA 776은 향후 전통주 발효 공정에서 누룩대체 효과 및 제품의 관능적인 특성 변화에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 보인다.
후속연구
- 86배 향상된 알코올 발효능을보유하는 것으로 확인되었다(Table 6). 따라서 전분분해 활성을 가진 알코올발효 효모인 FA 776은 향후 전통주 발효 공정에서 누룩대체 효과 및 제품의 관능적인 특성 변화에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 보인다.
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