본 연구에서는 헤마토코커스 플루비알리스(H. pluvialis)의 파쇄세포(cracked cell)로부터 추출된 아스타잔틴의 HPLC 분석방법을 확립하고, UV/visible 및 FT-IR 분광분석법을 이용하여 헤마토코커스 추출물과 합성 아스타잔틴의 구조적 특성을 조사하였다. 아스타잔틴을 메탄올 용매에 녹이고, 45분 정도 초음파로 처리할 경우 교반처리하는 경우 보다 1.5배 정도 용해율이 높아지는 것을 확인하였다. 에스터 형태로 존재하는 추출물 중의 아스타잔틴의 분석을 위해 cholesterol esterase를 이용해 헤마토코커스 추출물을 가수분해처리를 하여 유리형으로 전환시킨 후 HPLC 분석을 수행하였다. 아스타잔틴의 함량을 분석하기 위해 역상칼럼(C18)과 UV/visible 검출기를 사용하였고, 이동상은 메탄올과 물(95:5)의 혼합용매를 사용하여 분석하였다. 효소처리 후, 헤마토코커스 추출물의 흡수스펙트럼이 합성 아스타잔틴과 유사한 패턴으로 변화하는 것을 확인함으로써 헤마토코커스로부터의 아스타잔틴의 추출 및 분석조건을 확립하였다.
본 연구에서는 헤마토코커스 플루비알리스(H. pluvialis)의 파쇄세포(cracked cell)로부터 추출된 아스타잔틴의 HPLC 분석방법을 확립하고, UV/visible 및 FT-IR 분광분석법을 이용하여 헤마토코커스 추출물과 합성 아스타잔틴의 구조적 특성을 조사하였다. 아스타잔틴을 메탄올 용매에 녹이고, 45분 정도 초음파로 처리할 경우 교반처리하는 경우 보다 1.5배 정도 용해율이 높아지는 것을 확인하였다. 에스터 형태로 존재하는 추출물 중의 아스타잔틴의 분석을 위해 cholesterol esterase를 이용해 헤마토코커스 추출물을 가수분해처리를 하여 유리형으로 전환시킨 후 HPLC 분석을 수행하였다. 아스타잔틴의 함량을 분석하기 위해 역상칼럼(C18)과 UV/visible 검출기를 사용하였고, 이동상은 메탄올과 물(95:5)의 혼합용매를 사용하여 분석하였다. 효소처리 후, 헤마토코커스 추출물의 흡수스펙트럼이 합성 아스타잔틴과 유사한 패턴으로 변화하는 것을 확인함으로써 헤마토코커스로부터의 아스타잔틴의 추출 및 분석조건을 확립하였다.
The extraction and quantitative analysis conditions for astaxanthin from Haematococcus pluvialis, and the structural characteristics of H. pluvialis extract, H. pluvialis hydrolysate and synthetic astaxanthin were investigated using UV/visible and FT-IR spectrometers. Astaxanthin was dissolved in me...
The extraction and quantitative analysis conditions for astaxanthin from Haematococcus pluvialis, and the structural characteristics of H. pluvialis extract, H. pluvialis hydrolysate and synthetic astaxanthin were investigated using UV/visible and FT-IR spectrometers. Astaxanthin was dissolved in methanol, and then treated to enhance the solubility by sonication for 45 min. With sonication pretreatment, the solubility of astaxanthin increased up to 1.5 times compared to that without sonication. The extracts were hydrolyzed by cholesterol esterase for the analysis of H. pluvialis extract containing astaxanthin ester. A HPLC method using reverse phase C18 column with methanol-water (95:5, v/v) as mobile phase was developed to analyze astaxanthin. After hydrolysis, the absorption spectrum of H. pluvialis hydrolysat was changed to similar pattern to synthetic astaxanthin, confirming the extraction and analysis condition of astaxanthin from H. pluvialis.
The extraction and quantitative analysis conditions for astaxanthin from Haematococcus pluvialis, and the structural characteristics of H. pluvialis extract, H. pluvialis hydrolysate and synthetic astaxanthin were investigated using UV/visible and FT-IR spectrometers. Astaxanthin was dissolved in methanol, and then treated to enhance the solubility by sonication for 45 min. With sonication pretreatment, the solubility of astaxanthin increased up to 1.5 times compared to that without sonication. The extracts were hydrolyzed by cholesterol esterase for the analysis of H. pluvialis extract containing astaxanthin ester. A HPLC method using reverse phase C18 column with methanol-water (95:5, v/v) as mobile phase was developed to analyze astaxanthin. After hydrolysis, the absorption spectrum of H. pluvialis hydrolysat was changed to similar pattern to synthetic astaxanthin, confirming the extraction and analysis condition of astaxanthin from H. pluvialis.
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문제 정의
본 연구에서는 헤마토코커스 플루비알리스(H. pluvialis)의 파쇄세포(cracked cell)로부터 추출된 아스타잔틴의 HPLC 분석방법을 확립하고, UV/visible 및 FT-IR 분광분석법을 이용하여 헤마토코커스 추출물과 합성 아스타잔틴의 구조적 특성을 조사하였다. 아스타잔틴을 메탄올 용매에 녹이고, 45분 정도 초음파로 처리할 경우 교반처리하는 경우 보다 1.
제안 방법
FT-IR 스펙트럼 분석을 통해 합성 아스타잔틴과 에스터형 헤마토코커스 추출물과 가수분해 효소처리 헤마토코커스 가수분해물(유리형)의 구조적 차이를 검토하였다. Fig.
HPLC 시스템(Agilent 1100, Agilent Technologies Inc., CA, USA)을 이용하여 컬럼은 Apollo C18(5 μ, 4.6×250 mm, Alltech Associates, IL, USA), 검출기는 UV/visible 검출기(474 nm)를 사용하여 유속 1 mL/min로 하고 컬럼오븐 온도는 40℃에서, 이동상으로는 메탄올과 증류수를 95:5의 비율로 혼합한 용매를 사용하여 분석하였다.
UV/visible spectrophotometer(Cary 100 Conc, Varian, CA, USA)를 이용하여 실온에서 600～350 nm의 파장에서 흡광스펙트럼을 측정하였고, FT-IR spectrometer(Spectrum GX, Perkin Elmer, CT, USA)를 사용하여 실온에서 4000～400 cm-1에서 스펙트럼을 측정하여 구조를 확인하였다.
8 unit/mL의 농도에서는 큰 차이를 나타내지 않았고, 45～90분간 반응 시에도 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 따라서 헤마토코커스 추출물을 가수분해 처리 시 cholesterol esterase의 3.4 unit/mL를 첨가하고 45분간 반응 시킨 후 분석하였다. 헤마토코커스 추출물을 cholesterol esterase를 이용해 에스터 결합을 끊어 유리 아스타잔틴으로 전환시킨 후 분석 시 표준물질인 합성 아스타잔틴과 같은 시간대(RT=8.
5%(w/v)의 비율로 현탁시킨 후, 40℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 원심분리로 침전물을 회수하여 아세톤을 0.5%(w/v)의 농도로 첨가한 후 초음파처리(75 min, 40 kHz; Power sonic 510, Hwashin, Korea)하여 아스타잔틴을 추출하였다.
본 연구에서는 H. pluvialis cracked cell로부터 추출된 아스타잔틴의 함량 분석을 위해 HPLC 분석방법을 확립하였고, UV/visible 및 FT-IR 분광분석법을 이용하여 분광학적으로 헤마토코커스 추출물과 합성 아스타잔틴의 구조를 비교 분석하였다.
기존의 보고된 연구결과에서도 헤마토코커스에서 추출된 아스타잔틴은 cholesterol esterase 효소처리나 염기성 용매를 이용하여 에스터 결합을 제거하고 HPLC 분석을 수행하였을 때 아스타잔틴이 검출되는 것으로 보고되었다(15-19). 본 연구에서는 cholesterol esterase를 이용해 헤마토코커스 추출물을 가수분해처리를 하여 조제한 헤마토코커스 가수분해물(H. pluvialis hydrolysate)의 HPLC 분석을 수행하였다. 가수분해 시 cholesterol esterase의 최적 반응비와 시간을 확인하기 위해 1.
HPLC 분석조건은 C18 역상칼럼(Apollo C18)을 사용하고 유속은 1 mL/min, 이동상은 메탄올과 물의 혼합비는 95:5로 하였을 때, 추출물의 피크가 명확히 분리되었고 표준물질인 합성 아스타잔틴과 헤마토코커스 가수분해물의 분석이 원활히 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 아스타잔틴의 함량은 표준물질의 분석 유효범위인 12.5 ppm부터 0.78 ppm까지 작성된 검량선으로부터 산출하였다(Fig. 3). 기존의 보고된 아스타잔틴의 HPLC 분석에서도 일반적으로 C18 역상 칼럼을 사용하였고, 이동상은 메탄올, 아세토나이트릴, 다이클로로메탄과 물 중 2가지 이상 혼합된 용액이 주로 사용되었다(20-25).
에스터 형태로 존재하는 추출물 중의 아스타잔틴의 분석을 위해 cholesterol esterase를 이용해 헤마토코커스 추출물을 가수분해처리를 하여 유리형으로 전환시킨 후 HPLC 분석을 수행하였다. 아스타잔틴의 함량을 분석하기 위해 역상칼럼(C18)과 UV/visible 검출기를 사용하였고, 이동상은 메탄올과 물(95:5)의 혼합용매를 사용하여 분석하였다. 효소처리 후, 헤마토코커스 추출물의 흡수스펙트럼이 합성 아스타잔틴과 유사한 패턴으로 변화하는 것을 확인함으로써 헤마토코커스로부터의 아스타잔틴의 추출 및 분석조건을 확립하였다.
5배 정도 용해율이 높아지는 것을 확인하였다. 에스터 형태로 존재하는 추출물 중의 아스타잔틴의 분석을 위해 cholesterol esterase를 이용해 헤마토코커스 추출물을 가수분해처리를 하여 유리형으로 전환시킨 후 HPLC 분석을 수행하였다. 아스타잔틴의 함량을 분석하기 위해 역상칼럼(C18)과 UV/visible 검출기를 사용하였고, 이동상은 메탄올과 물(95:5)의 혼합용매를 사용하여 분석하였다.
합성 아스타잔틴, 헤마토코커스 추출물 및 효소처리 헤마토코커스 추출물의 구조적 차이를 검토하기 위해 UV/visible 스펙트럼과 FT-IR 스펙트럼을 분석하였다.
합성 아스타잔틴과 헤마토코커스 추출물(H. pluvialis extract)의 아스타잔틴 함량을 분석하기 위해 HPLC 분석조건을 확립하였다. 합성 아스타잔틴을 메탄올에 용해하여 단순히 교반한 후 HPLC 분석을 한 결과 HPLC 크로마토그램상 피크면적이 작아 정량분석에 어려움이 있었으며 합성 아스타잔틴의 용해도 향상을 위해 용매(아세토나이트릴, 클로로포름, 헥산, 메탄올)와 용해 조건(교반, 초음파 처리)을 변경하여 실험하였다.
pluvialis extract)의 아스타잔틴 함량을 분석하기 위해 HPLC 분석조건을 확립하였다. 합성 아스타잔틴을 메탄올에 용해하여 단순히 교반한 후 HPLC 분석을 한 결과 HPLC 크로마토그램상 피크면적이 작아 정량분석에 어려움이 있었으며 합성 아스타잔틴의 용해도 향상을 위해 용매(아세토나이트릴, 클로로포름, 헥산, 메탄올)와 용해 조건(교반, 초음파 처리)을 변경하여 실험하였다. 용매로서는 메탄올을 사용하였을 경우 HPLC 크로마토그램상 명확히 피크분리가 일어나는 것을 확인하였고, 용해조건은 용매에 넣고 단순히 교반하는 것보다 초음파처리를 하는 것이 용해가 잘 이루어지는 것을 알 수 있었다.
4 unit/mL를 첨가하고 45분간 반응 시킨 후 분석하였다. 헤마토코커스 추출물을 cholesterol esterase를 이용해 에스터 결합을 끊어 유리 아스타잔틴으로 전환시킨 후 분석 시 표준물질인 합성 아스타잔틴과 같은 시간대(RT=8.6 min)에서 피크가 검출되는 것을 확인하였다(Fig. 2(c)).
아스타잔틴의 함량을 분석하기 위해 역상칼럼(C18)과 UV/visible 검출기를 사용하였고, 이동상은 메탄올과 물(95:5)의 혼합용매를 사용하여 분석하였다. 효소처리 후, 헤마토코커스 추출물의 흡수스펙트럼이 합성 아스타잔틴과 유사한 패턴으로 변화하는 것을 확인함으로써 헤마토코커스로부터의 아스타잔틴의 추출 및 분석조건을 확립하였다.
대상 데이터
Cholesterol esterase는 Sigma사(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, 메탄올(methanol), 증류수, 아세토나이트릴(acetonitrile)은 Burdick & Jackson사(Muskegon, MI, USA)의 제품으로 모두 HPLC급을 사용하였다.
Louis, MO, USA)의 제품으로서 순도가 92% 이상인 것을 사용하였다. 아스타잔틴의 추출원료인 Haematococcus pluvialis cracked cell은 순도 1.5%의 Parry Nutraceutical사(Pudukkottai, India)의 제품을 사용하였고, 비교를 위해 사 용한 Phaffia rhodozyma 추출물은 아스타잔틴의 순도가 0.8%인 Astaxanthin Partners사(Yorkshire, UK)의 제품을 구입하였다. Cholesterol esterase는 Sigma사(St.
합성 아스타잔틴(astaxanthin)은 Sigma사(St. Louis, MO, USA)의 제품으로서 순도가 92% 이상인 것을 사용하였다. 아스타잔틴의 추출원료인 Haematococcus pluvialis cracked cell은 순도 1.
성능/효과
4(c)), 헤마토코커스 추출물은 408 nm에서 최대 흡수값을 나타냈고(Fig. 4(a)), cholesterol esterase를 이용하여 에스터기를 제거시켜 유리형으로 전환시킨 헤마토코커스 가수분해물은 409, 466 nm에서 최대 흡수값을 나타내었다(Fig. 4(b)).
HPLC 분석조건은 C18 역상칼럼(Apollo C18)을 사용하고 유속은 1 mL/min, 이동상은 메탄올과 물의 혼합비는 95:5로 하였을 때, 추출물의 피크가 명확히 분리되었고 표준물질인 합성 아스타잔틴과 헤마토코커스 가수분해물의 분석이 원활히 이루어지는 것을 확인할 수 있었다. 아스타잔틴의 함량은 표준물질의 분석 유효범위인 12.
pluvialis hydrolysate)의 HPLC 분석을 수행하였다. 가수분해 시 cholesterol esterase의 최적 반응비와 시간을 확인하기 위해 1.7～6.8 unit/mL의 농도에서 30～90분까지 반응시켜 분석한 결과 3.4～6.8 unit/mL의 농도에서는 큰 차이를 나타내지 않았고, 45～90분간 반응 시에도 차이가 없음을 확인할 수 있었다. 따라서 헤마토코커스 추출물을 가수분해 처리 시 cholesterol esterase의 3.
용매로서는 메탄올을 사용하였을 경우 HPLC 크로마토그램상 명확히 피크분리가 일어나는 것을 확인하였고, 용해조건은 용매에 넣고 단순히 교반하는 것보다 초음파처리를 하는 것이 용해가 잘 이루어지는 것을 알 수 있었다. 교반은 4시간 이상 실시하여도 초음파처리와 비교하여 크게 용해율이 증가하지 않음을 확인하였다. Fig.
2(b)). 기존의 보고된 문헌에 의하면 유리 아스타잔틴을 대부분 함유하는 갑각류나 효모의 경우 추출 후 가수분해를 하지 않고 역상칼럼에서도 분석이 되는 것을 볼 수 있었고(8,9,19), 본 연구에서도 헤마토코커스와 비교를 위해 효모(Phaffia rhodozyma)에서 추출한 아스타잔틴을 동일한 조건으로 분석하였을 때 cholesterol esterase를 처리한 후 오히려 함량이 감소되는 것을 확인할 수 있었다(데이터 제시 생략). 이것은 유리형의 아스타잔틴의 경우 오히려 cholesterol esterase 효소에 의해 변성이 일어나는 것을 보여주는 결과이다.
5(a)). 또한, 유리형 합성 아스타잔틴의 경우에는 1750 cm-1에서 C=O 결합 피크가 단일하게 나타났으나, 헤마토코커스 추출물의 스펙트럼에서는 C=O 피크 옆에 에스터 결합상의 alkyl chain에서 유래한 것으로 판단되는 피크 하나가 붙어서 나타났으며, 가수분해 후에는 피크가 없어진 것을 확인하였다. 헤마토코커스 가수분해물, 헤마토코커스 추출물 및 합성 아스타잔틴 간에 스펙트럼이 일치하진 않았으나, 유리형의 아스타잔틴을 함유할 것으로 추정되는 헤마토코커스 가수분해물과 합성 아스타잔틴과 같은 경우에는 피크의 양상이 비슷하게 나타났고, 헤마토코커스 추출물과 헤마토코커스 가수분해물은 구조적 차이를 나타냄을 확인하였다.
pluvialis)의 파쇄세포(cracked cell)로부터 추출된 아스타잔틴의 HPLC 분석방법을 확립하고, UV/visible 및 FT-IR 분광분석법을 이용하여 헤마토코커스 추출물과 합성 아스타잔틴의 구조적 특성을 조사하였다. 아스타잔틴을 메탄올 용매에 녹이고, 45분 정도 초음파로 처리할 경우 교반처리하는 경우 보다 1.5배 정도 용해율이 높아지는 것을 확인하였다. 에스터 형태로 존재하는 추출물 중의 아스타잔틴의 분석을 위해 cholesterol esterase를 이용해 헤마토코커스 추출물을 가수분해처리를 하여 유리형으로 전환시킨 후 HPLC 분석을 수행하였다.
이것은 유리형의 아스타잔틴의 경우 오히려 cholesterol esterase 효소에 의해 변성이 일어나는 것을 보여주는 결과이다. 에스터 형태의 아스타잔틴을 분석 시에는 가수분해처리를 통해 에스터 결합을 제거시킨 후 분석을 수행해야하는 것을 확인할 수 있었다.
합성 아스타잔틴을 메탄올에 용해하여 단순히 교반한 후 HPLC 분석을 한 결과 HPLC 크로마토그램상 피크면적이 작아 정량분석에 어려움이 있었으며 합성 아스타잔틴의 용해도 향상을 위해 용매(아세토나이트릴, 클로로포름, 헥산, 메탄올)와 용해 조건(교반, 초음파 처리)을 변경하여 실험하였다. 용매로서는 메탄올을 사용하였을 경우 HPLC 크로마토그램상 명확히 피크분리가 일어나는 것을 확인하였고, 용해조건은 용매에 넣고 단순히 교반하는 것보다 초음파처리를 하는 것이 용해가 잘 이루어지는 것을 알 수 있었다. 교반은 4시간 이상 실시하여도 초음파처리와 비교하여 크게 용해율이 증가하지 않음을 확인하였다.
또한, 유리형 합성 아스타잔틴의 경우에는 1750 cm-1에서 C=O 결합 피크가 단일하게 나타났으나, 헤마토코커스 추출물의 스펙트럼에서는 C=O 피크 옆에 에스터 결합상의 alkyl chain에서 유래한 것으로 판단되는 피크 하나가 붙어서 나타났으며, 가수분해 후에는 피크가 없어진 것을 확인하였다. 헤마토코커스 가수분해물, 헤마토코커스 추출물 및 합성 아스타잔틴 간에 스펙트럼이 일치하진 않았으나, 유리형의 아스타잔틴을 함유할 것으로 추정되는 헤마토코커스 가수분해물과 합성 아스타잔틴과 같은 경우에는 피크의 양상이 비슷하게 나타났고, 헤마토코커스 추출물과 헤마토코커스 가수분해물은 구조적 차이를 나타냄을 확인하였다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
아스타잔틴의 천연 공급원으로는 무엇이 있는가?
아스타잔틴의 천연 공급원으로는 게, 새우 등의 갑각류나 효모, 해양생물이 있다. 갑각류(게, 새우)에서 추출된 아스타잔틴은 추출이 용이한 장점은 있으나 높은 회분과 키틴 함량으로 사용이 제한되고 있다(6).
아스타잔틴은 무엇인가?
또한 노화억제와 질병치료에 영향을 미치는 기능성 식품과 천연물에 대한 관심이 높아지며, 항산화 물질에 대한 관심이 증가되고 있다. 그 중 지용성 비타민 E인 알파-토코페롤(α-tocopherol)에 비하여 항산화력이 550배에 해당하는 강력한 항산화 물질인 아스타잔틴(astaxanthin, 3,3'-dihydroxy-β,β'-carotene-4,4'-dione)은 갑각류, 조류 등의 해양생물에 존재하는 케토-카로티노이드(keto-carotenoid)로서 베타-카로틴(β-carotene)과 매우 유사한 구조를 지니고 있다(1). 이 물질은 면역증강(2), 항암효과(3,4), 시력보호(5) 등 여러 가지 다양한 기능성이 입증되면서 의약품이나 화장품, 식품 등의 소재로 활용이 기대되고 있는 물질이다.
아스타잔틴은 어떤 기능성들이 입증되면서 의약품이나 화장품, 식품 등의 소재로 활용이 기대되고 있는 물질인가?
그 중 지용성 비타민 E인 알파-토코페롤(α-tocopherol)에 비하여 항산화력이 550배에 해당하는 강력한 항산화 물질인 아스타잔틴(astaxanthin, 3,3'-dihydroxy-β,β'-carotene-4,4'-dione)은 갑각류, 조류 등의 해양생물에 존재하는 케토-카로티노이드(keto-carotenoid)로서 베타-카로틴(β-carotene)과 매우 유사한 구조를 지니고 있다(1). 이 물질은 면역증강(2), 항암효과(3,4), 시력보호(5) 등 여러 가지 다양한 기능성이 입증되면서 의약품이나 화장품, 식품 등의 소재로 활용이 기대되고 있는 물질이다.
참고문헌 (27)
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