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문제 정의
- 따라서 본 연구는 농도를 달리한 더덕 추출물이 마우스 비 장세포에 직접 작용하여 면역세포를 증식시키는 활성이 있는지 검색하고, 동시에 사이토카인(IL-1£, IL-6, TNF-a) 생 성 량을 측정하여 면역세포의 활성화에 관여함을 조사함으로 서 면역증진능을 갖는 천연식품 소재로서의 더덕의 면역증진 식품으로서의 활용 가능성을 확인하고자 실시하였다.
- 또, 톳과 수수 추출물이 마우스 비장세포와 사이토카인 생성을 증진시키는 것으로 알려져 있다7,8). 이러한 연구의 일환으로 우리나라 전통건강식품으로 널리 이용되고 있는 더덕을 소재로 면역증진효과를 확인하고자 하였다. 더덕은 도라지과에 속하는 다년생 만초에 속하며, 맛과 향이 독특하여 우리나라에서 오랫동안 식용으로 이용되고 있다.
제안 방법
- 2시간 후 각 well의 상층액을 걷어 비부착 세포(non-adherent cells)는 제거 하고 부착 세 포(adherent cells)만을 사용하였다. 사이토카인(IL-1£, IL-6, TNF-a) 분비량을 측정은 비부착성 세포는 제거하고 부착성 마우스 복강대식세포에 10%의 불활성화된 FBS를 함유한 RPMI 1640 용액을 900 # 넣고 최종농도가 10 "g/M와 250 "g/M가 되도록 더덕 추출물을 각 100 #씩 분주한 다음 37 C, 5% CO2 인큐베이터(Sanyo, St. Louis, MO, USA)에서 48시간배양하였다. 배양액을 분리하여 IL-1£, IL-6, TNF-a 의 분비 량을 ELISA 사이토카인 kit(R&D system, NY, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 더덕물 추출물과 에탄올 추출물 10, 50, 100, 250, 500, 1, 000, 2,000 #의 농도로 첨가하여 배양하였고 음의 대조군(negative control) 으로는 더덕 시료의 추출물 대신 배양액 (10% FBS-RPMI 1640)을 첨가하고 양의 대조군(positive con- trol)으로는 ConA(5 “g/n#와 LPS(15 #/#를 첨가하여 배양하였다. 더덕의 물 추출물과 에탄올 추출물이 비장세포 증식능에 미치는 영향에 대한 결과는 Table 1과 같다.
- 동결 건조된 시료를 증류수 또는 에 탄올로 환류 냉각시키면서 80 ℃ 수욕상에서 3시간씩 3회 반복 추출한 후 감압 농축하여 물 추출물과 에탄올 추출물을 얻었다(Kg. 1). 본 연구에 사용된 동물은 7~8주령된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한실험동물센터로부터 공급받아 고형사료와 물을 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다.
- 05). 또한, 더덕 물 추출물 10, 250 #/M 농도첨가시 미토젠인 LPS(15 #/M)에 의한 TNF-a 생성량 수준으로 유의적으로 높은 TNF-a를 생성하였다(P<0.05). 더덕 에탄올 추출물 10 # 농도 첨가 시에, 460.
- 2)와 증류수에 현탁시켜 5분간 처리하여 적혈구를 제거하고 RPMI 1640 용액으로 2 회 원심세척하였다. 모아진 대식세포를 10%의 불활성화된 FBS를 함유한 RPMI 1640 용액 에 분산시 켜, trypan blue solution으로 염색한 후 hemocytometer를 이용하여 그 세 포수를 측정하였다. 세포수를 1*106 cell/M의 농도로 희석하여 24-well plate에 분주 후 37C, 5% CO2 incubator에서 배양하였다.
- Louis, MO, USA)에서 48시간배양하였다. 배양액을 분리하여 IL-1£, IL-6, TNF-a 의 분비 량을 ELISA 사이토카인 kit(R&D system, NY, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 반응에 중요한 역할을 담당한다고 알려져 있다261. 본 실험에서는 IL-1£, IL-6, TNF-a의 분비량을 측정하였고, 각 군별 양성 대조군으로는 LPS(15 #n)로 자극한 대식세포로부터 분비된 사이토카인을 측정함으로써 대식세포의 활성화에대한 지표로 삼았다.
- ConA와 LPS는 선행 연구에서 가장 높은 증식능을 보였던 농도인 5 ”g/M(ConA)와 15 ”g/M(LPS)를 첨가하였다#). 비장세포 증식능은 배양액 10% FBS-RPMI 1640을 넣은 대조군의 흡광도를 1로 하여 상대적인 값으로 표현하였다.
- 본 연구에 사용된 동물은 7~8주령된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한실험동물센터로부터 공급받아 고형사료와 물을 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다. 실험 동물실 온도는 22±2C, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다.
- 2)와 증류수에 현탁시켜 5분간 처리하여 적혈구를 제거하였다. 적혈구가 제거된 비장세포는 다시 RPMI medium 1640 용액에 분산시켜, trypan blue solution으로 염색한 후 hemocytometer를 이용하여 그세포수를 측정하였다. 세포농도 5.
대상 데이터
- 4에 나타내었다. 대조군은 227.71±1.20 pg/M의 TNF-a를 생성하였고, 미토젠인 LPS(15 #/M)를 첨가한 경우에 2, 220.87±1.93 pg/M의 TNF-a를 생성하여 대조군에 비해 유의적으로 높은 TNF-a 을 생성하였다(p<0.05). 더덕물 추출물 10, 250 #/M 농도를 첨가한 경우, 각각 1, 626.
- 마우스는 경추 탈골법에 의해 희생시킨 후 복부의 표피를 절개하여 벗긴 다음, RPMI 1640 용액으로 복강을 가볍게 마사지한 후 세척액을 취하여 멸균 시험관에 수집하였다. 수집된 세척액을 4C, 3, 000 rpm에서 10분간 원심 침전시켜 cell pellet을 얻었다.
- 1). 본 연구에 사용된 동물은 7~8주령된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한실험동물센터로부터 공급받아 고형사료와 물을 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다. 실험 동물실 온도는 22±2C, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암 주기(Light and dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다.
- 본 연구에 사용된 배지는 GIBCO BRL(Grand Island, NY, USA) 제품의 RPMI medium 1640를 사용하였고, fetal bovine serum(FBS), lipopolysaccharide(LPS), thioglycollate, sodium bicarbonate, ammonium chloride, TRIZMAbase, TRIZMAhydro- chloride, trypan blue solution(0.4%), DMSO(dmethyl sulfide), 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 등의 시약은 Sigma(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 2) Means with different letters(a, b, c) within a colume significantly different from each other at a =0.05 as determined by Duncan's multiple range test(a>b>c).
- 모든 연구결과의 자료는 통계 프로그램인 SAS package (ver. 12.0)를 이용하여 평균 및 표준편차를 계산하였으며, 군간의 비교에서 각각의 요인은 분산분석 (Analysis of Variance, ANOVA)을 사용하였고, Duncan's multiple range test로 p=0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 마우스 비장세포 분리는 Mishell21)의 방법에 의해 시행되었다. 경추 탈골법으로 희생시킨 마우스로부터 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640 배 양액으로 씻은 후 멸균 유리봉으로 가볍게 분쇄하여 세포를 유리시켰다.
성능/효과
- In vitro 실험을 통한 더덕 추출물 첨가가 마우스의 면역세포 증식에 미치는 영향에 대한 연구 결과, 더덕 물 추출물 50 #/mC의 농도와 500 #/mC의 농도를 첨가했을 때 비장세포 증식을 촉진하는 효과가 높은 것으로 보여지며, 에탄올추출물 첨가에서는 차이를 보이지 않았다. 반면, 사이토카인 생성의 경우 IL-1£, IL-6, TNF-a 사이토카인 생성량을 측정한 결과, 더덕물 추출물과 에탄올 추출물 10, 250, #/m 농도에서 생성된 IL-1£, IL-6, TNF-a 사이토카인은 대조군보다 높은 생성량을 보였다.
- 이상의 본연구결과를 종합해 보면 더덕 추출물을 첨가한 IL-1£의 경우, 물 추출물 10, 250 ^/^ 농도에서 높은 생성 량을 보여주었고, IL-6의 경우, 물 추출물 10, 250 #/M 농도, 특히 250 段/M의 경우 LPS 수준의 생성량을 나타내었다. TNF-a 의경우, 물 추출물을 첨가한 10, 250 #;/M 두 농도 모두에서 유의적으로 높은 생성량을 나타내었고, 250 #;/M의 경우 미토젠인 LPS 수준의 생성량을 보여주었다. 한편, 맨드라미30) 와 생강 물 추출물과 율무물 추출물 10 #M와 100 #/M 농도에서 TNF-a 생성이 대조군에 비해 유의적으로 높게 나타난 연구결과가 있다5기).
- 05). 더덕물 추출물 10, 250#/M 농도첨가시 각각 424.53±1.41, 604.82±1.26 pg/M로 대조군보다 유의적으로 높은 IL-6가 생성되어, 두 농도 모두에서 미토젠인 LPS보다 유의적으로 높은 IL-6 생성 량을 보였다(p<0.05). 에탄올 추출물 첨가군에서는 각각 10, 250#/M 농도에서 98.
- 사이토카인을 지표로 본 또 다른 연구에 따르면18) 더덕 물 추출물 투여가 무첨가군에 비가 10배의 IL-6의 생성을촉진시킨 것으로 보고한 바 있다. 따라서 더덕 물 추출물이 B 림프구를 분화시켜 항체 생성을 유도하는 IL-6의 생성 량을증가시 켜, B 세포를 활성화시킬 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 첨가에서는 차이를 보이지 않았다. 반면, 사이토카인 생성의 경우 IL-1£, IL-6, TNF-a 사이토카인 생성량을 측정한 결과, 더덕물 추출물과 에탄올 추출물 10, 250, #/m 농도에서 생성된 IL-1£, IL-6, TNF-a 사이토카인은 대조군보다 높은 생성량을 보였다. 특히 에탄올 추출물보다는 물 추출물에서 높은 생성량을 보였고, IL-1£, IL-6와 TNF-a 사이토카인 모두 250 #/m의 농도에서 유의적으로 높은 생성량을 나타내었다.
- 05) 결과와는 차이를 보였다. 본 실험 결과 물 추출물 10, 250 #/M 농도 모두에서 대조군보다 높은 IL-6 생성 량을 보였고 특히, 물 추출물을 첨가한 250 #/M 농도 모두에서 미토젠인 LPS로 배양한양의 대조군(597.51±0.16 pg/M)보다 높은 IL-6 생성 량을 나타내었다. 사이토카인을 지표로 본 또 다른 연구에 따르면18) 더덕 물 추출물 투여가 무첨가군에 비가 10배의 IL-6의 생성을촉진시킨 것으로 보고한 바 있다.
- 이는 외부 항원의 자극 시 더덕물 추출물이 면역반응을 증진시킬 가능성이있음을 보여주는 결과로 사료된다. 본 실험 결과 에탄올 추출물보다는 물 추출물에서 높은 IL-1 B 생성량을 보였으며, 물추출물 250 昭/M 농도에서 높은 IL-1£을 생성하였다. 관련연구로 더덕물 추출물 10, 100 #/M 첨가군에서 림프구 증식이 항진되었다는 보고27)와 더덕 물 추출물 25 #농도 첨가군에서 림프절 세포가 무 첨가군에 비해 11.
- 특히 에탄올 추출물보다는 물 추출물에서 높은 생성량을 보였고, IL-1£, IL-6와 TNF-a 사이토카인 모두 250 #/m의 농도에서 유의적으로 높은 생성량을 나타내었다. 이상의 결과에 의하면 더덕 물 추출물 및 에탄올 추출물은 마우스 비장세포를 증식시키고, 더덕 물 추출물은 사이토카인 생성량에도 영향을 주어 면역 기관의 주요 기능을 증진시킬 가능성이 있을 것으로 사료된다. 또한, 더덕 추출물을 이용하여 면역력 감소를 예방하는 기능성 식품 개발의 소재로 활용될 가능성이 있을 것으로 기대된다.
- 05). 이상의 본연구결과를 종합해 보면 더덕 추출물을 첨가한 IL-1£의 경우, 물 추출물 10, 250 ^/^ 농도에서 높은 생성 량을 보여주었고, IL-6의 경우, 물 추출물 10, 250 #/M 농도, 특히 250 段/M의 경우 LPS 수준의 생성량을 나타내었다. TNF-a 의경우, 물 추출물을 첨가한 10, 250 #;/M 두 농도 모두에서 유의적으로 높은 생성량을 나타내었고, 250 #;/M의 경우 미토젠인 LPS 수준의 생성량을 보여주었다.
- 16 pg/M로 대조군과 차이를 보이지 않았다. 이와 같이 더덕 물 추출물 첨가시 미토젠인 LPS로 배양한 양의 대조군과 유사한 수준으로 높은 TNF-a 생성 량을 보였다(p<0.05). 이상의 본연구결과를 종합해 보면 더덕 추출물을 첨가한 IL-1£의 경우, 물 추출물 10, 250 ^/^ 농도에서 높은 생성 량을 보여주었고, IL-6의 경우, 물 추출물 10, 250 #/M 농도, 특히 250 段/M의 경우 LPS 수준의 생성량을 나타내었다.
- 반면, 사이토카인 생성의 경우 IL-1£, IL-6, TNF-a 사이토카인 생성량을 측정한 결과, 더덕물 추출물과 에탄올 추출물 10, 250, #/m 농도에서 생성된 IL-1£, IL-6, TNF-a 사이토카인은 대조군보다 높은 생성량을 보였다. 특히 에탄올 추출물보다는 물 추출물에서 높은 생성량을 보였고, IL-1£, IL-6와 TNF-a 사이토카인 모두 250 #/m의 농도에서 유의적으로 높은 생성량을 나타내었다. 이상의 결과에 의하면 더덕 물 추출물 및 에탄올 추출물은 마우스 비장세포를 증식시키고, 더덕 물 추출물은 사이토카인 생성량에도 영향을 주어 면역 기관의 주요 기능을 증진시킬 가능성이 있을 것으로 사료된다.
- 사료된다. 한편, 에탄올 추출물의 경우 10 #/n에서 증식 효과를 보여, 500~ 1,000 #/n 농도 이상에서 비장세포 증식능을 억제하는 것으로 나타난 고들빼기, 돌미나리, 메밀, 톳, 생강을 혼합한 혼합시료의 연구와 다르지 않은 경향을 보였다. 따라서 50 ~500# 농도로 첨가된 더덕 추출물이 세포 활성을 촉진시키거나 면역반응을 증가시킬 가능성이 있을 것으로사료된다.
후속연구
- 이상의 결과에 의하면 더덕 물 추출물 및 에탄올 추출물은 마우스 비장세포를 증식시키고, 더덕 물 추출물은 사이토카인 생성량에도 영향을 주어 면역 기관의 주요 기능을 증진시킬 가능성이 있을 것으로 사료된다. 또한, 더덕 추출물을 이용하여 면역력 감소를 예방하는 기능성 식품 개발의 소재로 활용될 가능성이 있을 것으로 기대된다.
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