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문제 정의
- 생강도 면역세포 증진 영향을 미치는 것으로 보고되고 있으며13), 생강 첨가 된장을 투여한 쥐에서 우수한 종양세포 생성 억제 작용을 가지는 것으로 나타나, 생강의 항암 효과에 대한 연구가 보고되기도 하였다씨 톳의 면역 세포 증진 효과와 항산화 효소 활성에 대한 연구도 이루어진 바 있다.(15,16) 따라서 본 연구에서는 in-vitro 실험을 통해 이러한 면역 세포 증진에 영향을 미친 각각의 재료들을 혼합하여, 혼합하여 먹었을 때의 효과를 검정하여, 고들빼기, 돌미나리, 메밀, 톳, 생강을 혼합한 혼합시료의 물과 에탄올 추출물 첨가에 의한 마우스 비장세포 증식능 및 사이토카인 IL4 B, L6, TNF-a 생성량의 변화를 측정하여 혼합시료의 추출물에 대한 면역 활성을 검토하고자 한다.
제안 방법
- In vitro를 통한 혼합시료의 물 추출물과 에탄올 추출물을 시료로 사용하였고 마우스 비장세포 증식능 및 활성 복강 대식세포에서 분비하는 사이토카인(II』6, IL-6, TNF-a)의 분비능을 측정하였다. 그 결과 혼합시료의 물 추출물과 에탄올 추출물 모두 5-250 μg/ML의 농도로 첨가했을 때 세포증식을 촉진하는 효과가 있는 것으로 나타났고 물 추출물인 경우 고농도인 1,000 μg/ML에서, 에탄올 추출물인 경우는 500-1, 000 μg/ML 이상의 고농도 첨가시 세포증식이 억제되는 효과를 보였다.
- T세포를 선택적으로 증가시키는 ConA와 B세포를 선택적으로 증가시키는 LPS는 농도 의존적이어서 본 실험에서는 선행연구에서 가장 높은 증식능을 보였던 농도인 5 μg/ml(GonA) 와 15 μg/ml(LPS)를 첨가하였다0 혼합시료의 물 추출물과 에탄올 추출물이 비장세포 증식능에 미치는 영향에 대한 결과는 Table 1과 같다. ConA와 LPS 를 첨가하여 배양한 경우, 혼합시료의 추출물을 첨가하지 않은 대조군에 비해 세포 증식 능이 1.
- 비부착성 세포는 제거하고 부착성 마우스 복강대식세포에 10%의 불활성화된 FBS를 함유한 RPMI 1640 용액을 900μl 넣고 최종농도가 10μg/ml와 100 μg/ml가 되도록 혼합시료의 추출물을 각 100 μl씩 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator(Sanyo) 에서 48시간 배양하였다. 배양액을 분리하여 T3B, L6, TNF-a의 분비량을 ELISA 사이토카인 kit(Biosource, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 비장 세포 증식 능은 배 양액 10% FBS-RPMI 1640을 넣은 대조군의 흡광도를 1로 하여 상대적인 값으로 표현하였다. T세포를 선택적으로 증가시키는 ConA와 B세포를 선택적으로 증가시키는 LPS는 농도 의존적이어서 본 실험에서는 선행연구에서 가장 높은 증식능을 보였던 농도인 5 μg/ml(GonA) 와 15 μg/ml(LPS)를 첨가하였다0 혼합시료의 물 추출물과 에탄올 추출물이 비장세포 증식능에 미치는 영향에 대한 결과는 Table 1과 같다.
- 2) 에 5분간 현탁시켜 적혈구를 제거하였다. 위의 세포는 다시 RPMI 로 2회 원심 세척한 다음, lOeFBS RPMI 1640으로 5.0^106 cell/ml의 농도로 희석하여 96-well plate 에 90μl씩 분주한 후세포증식능 측정에 사용하였다.
- 혼합시료의 추출물 첨가에 의해 활성화된 대식세포의 배양 상층액으로 사이토카인(IL-16, IL-6, TNF-a) 분비량을 측정하였다. 비부착성 세포는 제거하고 부착성 마우스 복강대식세포에 10%의 불활성화된 FBS를 함유한 RPMI 1640 용액을 900μl 넣고 최종농도가 10μg/ml와 100 μg/ml가 되도록 혼합시료의 추출물을 각 100 μl씩 분주한 다음 37℃, 5% CO2 incubator(Sanyo) 에서 48시간 배양하였다.
- 이용하였다. 혼합시료의 추출물은 10%의 불활성화 된 FBS를 함유한 RPMI 1640 용액으로 50, 100, 500, 1,000, 2, 500, 5,000, 10, 000 μg/ml가되도록 조제하고, 비장세포가 5.0×106 cell/me 농도로 90μl씩 분 주된 96-well plate에 10 μl씩 가하여 최종농도가 5, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000 μg/ml가 되도록 하였다. 또한 미토젠으로 Con A(5 μg/ml), LPS(15 μg/ml)를 첨가하고 대조군에는 배지를 동량 분주하였다.
대상 데이터
- 본 연구에 사용된 고들빼기, 돌미나리, 메밀, 톳, 생강은 깨끗한 물로 세척한 후 동결 건조하고 분말화하여 각 시료들의 비율을 1 : 1 : 1 : 1 : 1 로 배합, 추출하여 사용하였다. 연구에 사용된 동물은 7~8주령 된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한 실험동물센터로부터 분양 받아 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험 동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다.
- 연구에 사용된 동물은 7~8주령 된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한 실험동물센터로부터 분양 받아 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험 동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다. 실험 동물실 온도는 22±2℃, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암주기(Light and dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다.
데이터처리
- 1) Means with different letters(a, b, c, d) within a colume significantly different from each other at α=0.05 as determined by Duncan's multiple range test(a>b>c>d).
- 1) Means with different letters(a, b, c, d) within a colume significantly different from each other at α=0.05 as determined by Duncan's multiple range test(a>b>c>d).
- 2)Means with different letters(a? b, c, d, e) within a colume significantly different from each other at α=0.05 as determined by Duncan's multiple range test(a>b>c>b>e).
- 프로그램을 이용하여 평균 및 표준편차를 구하였다. 각 군 간의 평균치의 차이는 분산분석(Analysis of Variance, ANOVA) 및 Duncan's multiple range test를 사용하여 a= 0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
- 모든 실험결과의 자료는 SAS(Statistic Analysis System) 통계 프로그램을 이용하여 평균 및 표준편차를 구하였다. 각 군 간의 평균치의 차이는 분산분석(Analysis of Variance, ANOVA) 및 Duncan's multiple range test를 사용하여 a= 0.
이론/모형
- 마우스 비장세포의 분리는 Mishell 등17)의 방법에 의해 실행하였다. 경추 탈골법으로 희생시킨 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640 용액으로 씻은 다음 멸균 유리 봉으로 가볍게 분쇄하여 세포를 유리시켰다.
- 비장세포 증식능 측정은 생존세포의 효소작용에 의해 MTT 시약이 환원되어 생기는 formazan의 양을 측정함으로써 세포독성(cytotoxicity), 생세포 수(viability), 세포증식능(proliferation) 등을 측정하는데 자주 사용되는 MTT assay18)를 이용하였다. 혼합시료의 추출물은 10%의 불활성화 된 FBS를 함유한 RPMI 1640 용액으로 50, 100, 500, 1,000, 2, 500, 5,000, 10, 000 μg/ml가되도록 조제하고, 비장세포가 5.
성능/효과
- 05)으로 높은 분비능을 보여주었고, 에탄올 추출물을 10 μg/ML와 100 μg/ML 첨가 시에도 대조군보다 높은 분비 량을 보였다. IL-6의 결과에서도 물 추출물 10 μg/ML를 첨가했을 때 유의적0<0.05)으로 높은 분비량을 보였고 TNF-a 의 경우, 물 추출물의 10 μg/ML와 100 μg/ML 의 농도에서 대조군에 비해 높은 TNF-a 분비능을 보였다. 이상의 결과에 의하면, 혼합 물 추출물이 비장세포 증식능과 복강 대식세포에 의한 사이토카인 분비능을 상승시킴으로서 면역 기관의 주요 기능을 증진시키는 것으로 사료된다.
- 이에 비해 5가지 혼합시료의 추출물을 첨가한 경우.LPS를 첨가했을 때보다 낮은 LI B 생성량을 보였으나, 혼합시료의 물 추출물 10 μg/ML를 첨가한 경우, 601.1 μg/ML 47.12 pg/M로 대조군에 비해 유의적으로 높은 분비량을 보였고, 100 μg/ML의 농도에서는 305.3±38.12 pg/M로 나타났다. 에탄올 추출물을 10 μg/ML와 100 μg/ML 첨가시에도 각각 400.
- 분비하는 사이토카인(II』6, IL-6, TNF-a)의 분비능을 측정하였다. 그 결과 혼합시료의 물 추출물과 에탄올 추출물 모두 5-250 μg/ML의 농도로 첨가했을 때 세포증식을 촉진하는 효과가 있는 것으로 나타났고 물 추출물인 경우 고농도인 1,000 μg/ML에서, 에탄올 추출물인 경우는 500-1, 000 μg/ML 이상의 고농도 첨가시 세포증식이 억제되는 효과를 보였다. 복강 대식세포의 사이토카인 분비량을 측정한 결과, 혼합 물 추출물과 에탄올 추출물 모두에서 대조군보다 높은 분비량을 보였다.
- 동일한 시료는 아니지만 선행 연구된 다른 식물시료들 중 생강물 추출물 첨가군)의 경우, 50-500 μg/ml에서 유의적인 증식 능을 나타내 본 연구와 유사한 결과를 나타냈으며, 고들빼기 물 추출물에서 100, 250 μg/ml 농도에서 비장증식능을 촉진하는 것으로 나타났다W 순수 물 추출물에서 100 μg/ml 농도에서 높은 증식을 나타냈으며, 에탄올 추출물의 경우 500~ 1, 000μg/ml 농도 이상에서는 비장세포 증식능을 억제하는 것으로 나타났다. 따라서 이상의 실험 결과 중간 농도로 첨가된 혼합시료의 추출물이 세포 활성을 촉진시키거나 면역 반응을 증가시킬 가능성이 있는 것으로 사료된다.
- 13 μg/ML로 높은 생성량을 보였던 결과를 바탕으로 본 실험 결과 혼합시료의 에탄올, 물 추출물을 모두에서 대조군에 비해 IL-1/9 분비량이 높게 나타났으며 특히 혼합시료의 물 추출물 10 μg/ML 농도에서 높은 증식 능을 보였다. 따라서 혼합시료의 물 추출물이 에탄올 추출물보다 높은 분비능을 나타냈으며, KX) μg/ML에서 보다는 10 μg/ML에서 마우스 복강 대식세포의 활성 에 영향을 미칠 가능성이 있는 것으로 사료된다.
- 5 μg/ML로 나타났다. 또한 순수 에탄올 추출물의 경우 대조군에 비해 10, 100 μg/ML 농도 첨가시 유의적으로 높은 분비량을 보였으며 특히 10μg/ML에서 높은 분비량을 나타내었다. 톳 열수 추출물)의 IL-6 분비량을 관찰한 실험에서도 10, 100 μg/ML의 농도에서 대조군보다 높은 IL-6 분비 량을 보였고, 생강 추출물의 경우 10, 100 μg/ML에서 음의 대조군보다 유의적으로 높은 Ⅱ.
- 2 μg/ML의 IL-6* 생성하여 대조군에 비해 대식세포에 의한 IL-6 분비능이 상승된 것으로 나타났다. 물 추출물 10 /zg/mC를 첨가했을 때 554.85±24.9 μg/ML로 대조군보다 유의적으로 높은 IL-6 분비 량을 보였고 100 μg/ML의 추출물을 첨가한 경우에는 149.50±34.8 pg/mC의 분비능을 보였다. 에탄올 추출물의 경우에는 10 μg/ML와 100 μg/ML의 농도에서 각각 265.
- 그 결과 혼합시료의 물 추출물과 에탄올 추출물 모두 5-250 μg/ML의 농도로 첨가했을 때 세포증식을 촉진하는 효과가 있는 것으로 나타났고 물 추출물인 경우 고농도인 1,000 μg/ML에서, 에탄올 추출물인 경우는 500-1, 000 μg/ML 이상의 고농도 첨가시 세포증식이 억제되는 효과를 보였다. 복강 대식세포의 사이토카인 분비량을 측정한 결과, 혼합 물 추출물과 에탄올 추출물 모두에서 대조군보다 높은 분비량을 보였다. 생성량 검색 결과, 물 추출물 투여군 10 μg/ML 농도 첨가에서 유의적S0.
- -6의 분비 량을 나타난 결과를 볼 때 이들 혼합물인 본 실험의 결과에 영향이 있을 것으로 사료된다. 본 실험 결과 물 추출물 10 μg/ML 농도에서 IL-6 분비 량이 증가하는 경향을 보였으나, 에탄올층에서는 유의성을 발견할 수 없었다. 따라서 혼합시료의 물 추출물 경우 10 μg/ML 농도에서 B세포 mitogen의 성질을 포함한 면역활성 물질이 있거나 면역조절인자가 존재하리라 사료된다.
- 7 pg/M로배양액 대조군에 비해 높은 TOF-a 분비능을 보였다. 생강 물 추출물 10 μg/ML와 100 μg/ML 농도에서 TNF-a 생성이 160.12±4.40, 270.34±7.03으로 대조군에 비해 유의적으로 높은 것으로 본 연구와 유사한 결과를 나타내었다짜 따라서 혼합시료의 물 추출물이 마우스 복강 대식세포의 TNF-a 분비를 촉진하는데 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- 복강 대식세포의 사이토카인 분비량을 측정한 결과, 혼합 물 추출물과 에탄올 추출물 모두에서 대조군보다 높은 분비량을 보였다. 생성량 검색 결과, 물 추출물 투여군 10 μg/ML 농도 첨가에서 유의적S0.05)으로 높은 분비능을 보여주었고, 에탄올 추출물을 10 μg/ML와 100 μg/ML 첨가 시에도 대조군보다 높은 분비 량을 보였다. IL-6의 결과에서도 물 추출물 10 μg/ML를 첨가했을 때 유의적0<0.
- 45 pg/mC의 분비 능을 보였다. 에탄올 추출물의 경우 또한 대조군에 비해 높은 분비 능을 보였으며, 물 추출물의 경우 10 μg/ML와 100 μg/ML2의농도에서 각각 1690.80±45.87 pg/mg와 1200.01±34.7 pg/M로배양액 대조군에 비해 높은 TOF-a 분비능을 보였다. 생강 물 추출물 10 μg/ML와 100 μg/ML 농도에서 TNF-a 생성이 160.
- 2 pgM로 대조군보다 높은 분비량을 보였다. 이는 돌미나리 물 추출물 10μg/ML 의 농도에서 유의성 있는 분비능을 나타냈고14), 톳 추출물15)을 첨가하지 않은 대조군은 56.38i4.25 pg/M의 IL-1를 생성하였으며, LPS를 첨가한 경우에는 116.16±4.13 μg/ML로 높은 생성량을 보였던 결과를 바탕으로 본 실험 결과 혼합시료의 에탄올, 물 추출물을 모두에서 대조군에 비해 IL-1/9 분비량이 높게 나타났으며 특히 혼합시료의 물 추출물 10 μg/ML 농도에서 높은 증식 능을 보였다. 따라서 혼합시료의 물 추출물이 에탄올 추출물보다 높은 분비능을 나타냈으며, KX) μg/ML에서 보다는 10 μg/ML에서 마우스 복강 대식세포의 활성 에 영향을 미칠 가능성이 있는 것으로 사료된다.
- 05)으로 높은 분비량을 보였고 TNF-a 의 경우, 물 추출물의 10 μg/ML와 100 μg/ML 의 농도에서 대조군에 비해 높은 TNF-a 분비능을 보였다. 이상의 결과에 의하면, 혼합 물 추출물이 비장세포 증식능과 복강 대식세포에 의한 사이토카인 분비능을 상승시킴으로서 면역 기관의 주요 기능을 증진시키는 것으로 사료된다.
- 추출물을 첨가하지 않은 대조군은 15.01±0.21 μg/ML 의 L6 를 분비되고, 미토젠인 LPS(15μg/ML)를 첨가한 경우에는 681.9H41.2 μg/ML의 IL-6* 생성하여 대조군에 비해 대식세포에 의한 IL-6 분비능이 상승된 것으로 나타났다. 물 추출물 10 /zg/mC를 첨가했을 때 554.
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