생체 내 (ex vivo) 실험에서 더덕의 물 추출물을 4주간 격일로 마우스 체중 kg 당 0, 50, 500 mg/kg B.W.의 농도로 마우스에 경구 투여한 후 비장세포 증식능, LPS에 의해 활성화된 복강 대식세포가 분비하는 염증성 사이토카인 (IL-1${\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$) 의 생성량을 측정하였다. 그 결과 더덕 물 추출물은 ConA나 LPS로 자극하지 않은 경우 500mg/kg B.W. 농도에서 대조군에 비해 유의적으로 높은 비장 증식능을 보였다. LPS에 의해 활성화된 복강 대식세포의 사이토카인 분비량을 측정한 결과에서도 IL-1 ${\beta}$, TNF-${\alpha}$의 분비량은 마우스 체중 kg 당 500 mg/kg B.W. 농도의 투여군에서 유의적으로 높은 생성량을 보여주었으며, 50 mg/kg B.W.의 농도 투여군에서는 대조군에 비해 유의적인 차이를 보이지 않았다. IL-6의 경우 50 mg/kg B.W.과 500 mg/kg B.W. 두 농도 모두에서 유의적으로 높은 분비능을 보였다. 이상의 결과에 따르면 더덕 추출물의 비장세포 증식능과 사이토카인 분비 효과는 500 mg/kg B.W. 농도 투여시 가장 효과적으로 면역 세포와 면역 기관의 주요기능을 증진시킬 가능성이 있을 것으로 사료된다. 이러한 연구결과를 토대로 앞으로 더덕을 이용한 기능성 식품 개발에 기초 연구 자료로 활용되기를 기대된다.
생체 내 (ex vivo) 실험에서 더덕의 물 추출물을 4주간 격일로 마우스 체중 kg 당 0, 50, 500 mg/kg B.W.의 농도로 마우스에 경구 투여한 후 비장세포 증식능, LPS에 의해 활성화된 복강 대식세포가 분비하는 염증성 사이토카인 (IL-1 ${\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$) 의 생성량을 측정하였다. 그 결과 더덕 물 추출물은 ConA나 LPS로 자극하지 않은 경우 500mg/kg B.W. 농도에서 대조군에 비해 유의적으로 높은 비장 증식능을 보였다. LPS에 의해 활성화된 복강 대식세포의 사이토카인 분비량을 측정한 결과에서도 IL-1 ${\beta}$, TNF-${\alpha}$의 분비량은 마우스 체중 kg 당 500 mg/kg B.W. 농도의 투여군에서 유의적으로 높은 생성량을 보여주었으며, 50 mg/kg B.W.의 농도 투여군에서는 대조군에 비해 유의적인 차이를 보이지 않았다. IL-6의 경우 50 mg/kg B.W.과 500 mg/kg B.W. 두 농도 모두에서 유의적으로 높은 분비능을 보였다. 이상의 결과에 따르면 더덕 추출물의 비장세포 증식능과 사이토카인 분비 효과는 500 mg/kg B.W. 농도 투여시 가장 효과적으로 면역 세포와 면역 기관의 주요기능을 증진시킬 가능성이 있을 것으로 사료된다. 이러한 연구결과를 토대로 앞으로 더덕을 이용한 기능성 식품 개발에 기초 연구 자료로 활용되기를 기대된다.
Codonopsis lanceolatae has been used as one of the traditional remedies as well as food source. However, few studies on their immunomodulating effects have been reported. We previously reported that ex vivo supplementation of Codonopsis lanceolatae water extracts enhanced splenocyte proliferation co...
Codonopsis lanceolatae has been used as one of the traditional remedies as well as food source. However, few studies on their immunomodulating effects have been reported. We previously reported that ex vivo supplementation of Codonopsis lanceolatae water extracts enhanced splenocyte proliferation compared to the control group. In order to elucidate its ex vivo effect, six to seven week old balb/c mice were fed ad libitum on a chow diet and water extracts of Codonopsis lanceolatae were orally administrated every other day for four weeks at two different concentrations (50 and 500 mg/kg B.W). After preparing the single cell suspension, the proliferation of splenocytes was determined by MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-y] -2,5-diphenyl terazolium bromide) assay. The production of cytokine (IL-1${\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$), secreted by macrophages stimulated with LPS or not, was detected by ELISA assay using a cytokine kit. After 48 hrs of incubation with the mitogen (ConA or LPS) stimulation, the mice splenocyte proliferation in experimental group was statistically increased at two different concentrations than that in control group. The cytokines production was more significantly enhanced at the lower supplementation (500 mg/kg B.W.) group rather than higher concentration (500 mg/kg B.W.) compared to the control group. The results of this study may suggest that the supplementation of water extract of plant mixture could regulate the immune function by increasing the splenocyte proliferation and enhance the immune function through regulating cytokine production capacity by activated macrophages in mice.
Codonopsis lanceolatae has been used as one of the traditional remedies as well as food source. However, few studies on their immunomodulating effects have been reported. We previously reported that ex vivo supplementation of Codonopsis lanceolatae water extracts enhanced splenocyte proliferation compared to the control group. In order to elucidate its ex vivo effect, six to seven week old balb/c mice were fed ad libitum on a chow diet and water extracts of Codonopsis lanceolatae were orally administrated every other day for four weeks at two different concentrations (50 and 500 mg/kg B.W). After preparing the single cell suspension, the proliferation of splenocytes was determined by MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-y] -2,5-diphenyl terazolium bromide) assay. The production of cytokine (IL-1${\beta}$, IL-6, TNF-${\alpha}$), secreted by macrophages stimulated with LPS or not, was detected by ELISA assay using a cytokine kit. After 48 hrs of incubation with the mitogen (ConA or LPS) stimulation, the mice splenocyte proliferation in experimental group was statistically increased at two different concentrations than that in control group. The cytokines production was more significantly enhanced at the lower supplementation (500 mg/kg B.W.) group rather than higher concentration (500 mg/kg B.W.) compared to the control group. The results of this study may suggest that the supplementation of water extract of plant mixture could regulate the immune function by increasing the splenocyte proliferation and enhance the immune function through regulating cytokine production capacity by activated macrophages in mice.
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문제 정의
14, 15) 한편 식품을 이용한 면역증강 효과에 대한 보고로는 생강첨가가 비장세포증식과 사이토카인 (IL-1g, IL-6, TNF-α) 분비를 촉진시킨 효과에 대해 보고된바 있으며, 16) 톳과 수수 추출물의 마우스 경구투여가 항체생성을 촉진시킨 보고와 NO 활성효과를 나타내어 면역세포 증진 효과가 있을 것으로 보고한 연구 결과가 있다.17-19) 이러한 연구결과를 바탕으로 본 연구에서는 纣 vivo 실험을 통해 더덕추출물의 면역 활성 효과를 살펴보고자 4주간 경구 투여함으로서 더덕 추출물이 마우스 생체 내에서 면역능에 미치는 영향을 관찰하였다. 그 지표로 마우스의 비장세포 증식능, 활성 복강대식세포에서 분비되는 사이토카인 (IL-1g, IL-6, TNF-α)생성량의 변화를 측정하여 더덕 물 추출물이 마우스 면역능에 미치는 영향을 연구하고자 하였다.
17-19) 이러한 연구결과를 바탕으로 본 연구에서는 纣 vivo 실험을 통해 더덕추출물의 면역 활성 효과를 살펴보고자 4주간 경구 투여함으로서 더덕 추출물이 마우스 생체 내에서 면역능에 미치는 영향을 관찰하였다. 그 지표로 마우스의 비장세포 증식능, 활성 복강대식세포에서 분비되는 사이토카인 (IL-1g, IL-6, TNF-α)생성량의 변화를 측정하여 더덕 물 추출물이 마우스 면역능에 미치는 영향을 연구하고자 하였다.
본 연구에서는 더덕 시료의 물 추출물 경구투여가 마우스 비장세포 증식능에 미치는 영향을 확인하기 위한 지표로 MTT assay를 이용하여 비장세포 증식능을 측정하였다. 더덕 추출물에 의한 비장세포 증식능의 결과는 Table 1에 나타내었다.
제안 방법
더덕 물 추출물을 체중 kg 당 50 ㎎/㎏ B.W.과 500 ㎎/㎏ B.W.의 농도로 경구 투여한 마우스로부터 복강 대식세포를 분리해 낸 다음 활성화된 대식세포가 생성해 낸 IL-18, IL-6, TNF-α의 분비량을 측정하였고, 각 군별 양의 대조군으로는 LPS (15 "g/mL)로 자극한 대식세포의 배양 상층액에서 측정된 값을 이용하였다.
각각 측정하였다. 비부착성 세포를 제거하고 부착성 세포만을 얻은 후, 10%-FBS RPMI 1640, 900 "L 와 대식세포를 활성화시키는 미토젠인 LPS와 배지를 100 " L 가한 후 37C, 5% CO2 incubator (Sanyo)에서 48시간 배양하였다. 배양 상층액을 분리하여 배양액에 축적된 Ⅱ.
마우스를 임의 배치법에 의해 대조군과 투여군으로 나누었으며, 실험군마다 4마리씩 사용하였다. 대조군에는 생리 식염수를 투여군에는 선행연구를 바탕으로 각각 50 ㎎/㎏ B.W./day과 500 mg/ kg B.W./day씩 4주간 격일로 경구 투여하였다 (Fig. 2).
더덕 물 추출물을 경구 투여한 마우스의 복강 내 대식세포를 추출하여 배양시킨 다음 배양 상층액으로부터 분비되는 사이토카인 (IL-1g, IL-6, TNF-α, IL-10, IL-2, IFN-y) 분비량을 각각 측정하였다. 비부착성 세포를 제거하고 부착성 세포만을 얻은 후, 10%-FBS RPMI 1640, 900 "L 와 대식세포를 활성화시키는 미토젠인 LPS와 배지를 100 " L 가한 후 37C, 5% CO2 incubator (Sanyo)에서 48시간 배양하였다.
동결 건조된 더덕 시료를 증류수 또는 에탄올로 환류 냉각시키면서 80C 수욕상에서 3시간씩 3회 반복 추출한 후 감압 농축하여 더덕 물 추출물 얻어 경구 투여 시료로 이용하였다 (Fig. 1). 본 연구에 사용된 동물은 7~8주령된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한실험동물센터로부터 분양받아 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험 동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다.
생체 내 (ex vivo) 실험에서 더덕의 물 추출물을 4주간 격일로 마우스 체중 kg 당 0, 50, 500 ㎎/㎏ B.W.의 농도로 마우스에 경구 투여한 후 비장세포 증식능, LPS에 의해 활성화된 복강 대식세포가 분비하는 염증성 사이토카인(IL-1g, IL-6, TNF-α)의 생성량을 측정하였다. 그 결과 더덕 물 추출물은 ConA나 LPS로 자극하지 않은 경우 500 ㎎/㎏ B.
본 연구에 사용된 동물은 7~8주령된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한실험동물센터로부터 분양받아 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험 동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다. 실험 동물실 온도는 22 ±2C, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암주기 (Light and dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다. ex vivo 실험에서 더덕 물 추출물 투여는 추출물을 멸균 증류수로 용해시킨 후 적정 농도로 희석하여 사용하였다.
대상 데이터
ex vivo 실험에서 더덕 물 추출물 투여는 추출물을 멸균 증류수로 용해시킨 후 적정 농도로 희석하여 사용하였다. 마우스를 임의 배치법에 의해 대조군과 투여군으로 나누었으며, 실험군마다 4마리씩 사용하였다. 대조군에는 생리 식염수를 투여군에는 선행연구를 바탕으로 각각 50 ㎎/㎏ B.
1). 본 연구에 사용된 동물은 7~8주령된 암컷 Balb/c mouse를 (주)대한실험동물센터로부터 분양받아 고형 사료와 물을 자유로이 공급하면서 7~8일 정도 실험 동물실에서 적응시킨 후 체중이 15 g 내외인 마우스를 실험에 사용하였다. 실험 동물실 온도는 22 ±2C, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암주기 (Light and dark cycle)는 12시간 단위로 조절하였다.
본 연구에 사용된 배지는 RPMI medium 1640의 GIBCO BRL (Grand Island, NY, USA) 제품을 사용하였고, fetal bovine serum (FBS), lipopolysaccharide (LPS), concanavalin A (ConA), thioglycollate, sodium bicarbonate, ammonium chloride, TRIZMA®base, TRIZMA®hydro-chloride, trypan blue solution (0.4%), DMSO (dimethyl sulfide), 3- (4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) 등의 시약은 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.
데이터처리
각 군간의 평균치의 차이는 분산분석 (Analysis of Variance, ANOVA)및 Duncan's multiple range test를 사용하여 a = 0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.
모든 실험결과의 자료는 SAS (Statistic Analysis System) 통계 프로그램을 이용하여 평균 및 표준편차를 구하였다. 각 군간의 평균치의 차이는 분산분석 (Analysis of Variance, ANOVA)및 Duncan's multiple range test를 사용하여 a = 0.
이론/모형
마우스 비장세포의 분리는 Mishell 등20)의 방법에 의해 실행하였다. 경추 탈골법으로 희생시킨 마우스의 비장을 무균적으로 적출하여 RPMI 1640 용액으로 씻은 다음 멸균 유리봉으로 가볍게 분쇄하여 세포를 유리시켰다.
성능/효과
24) 또한 생강 추출물과 탈지 들깨 물추출물을 식이로 첨가한 연구에서도 역시 LPS로 자극했을 때 유의적으로 높은 TNF-α가 분비됨을 보고하였다.28) 따라서 본 실험 결과 더덕 물 추출물을 경구 투여한 경우라서 더덕 추출물은 마우스 복강 대식세포를 활성화하여 TNF-α 생성을 촉진시킴으로서 면역증강효과가 있을 것으로 사료된다. 또한 선행연구들에서와 같이 본 연구에서도 50 ㎎/㎏ B.
-6 분비량 결과는 Table 3에 나타내었다. LPS로 처리하지 않은 경우 50 ㎎/㎏ B.W.의 농도에서 271.49 ±109.96 pg/mL으로 대조군 208.34 ± 7.61 pg/mL 보다 높은 분비량을 보여주었고, 500 ㎎/㎏ B.W. 농도에서는 408.02 ± 74.92 pg/mL로 유의적으로 높은 분비능을 보였다 (p < 0.05). LPS 첨가시에는 50 ㎎/㎏ B.
농도에서 대조군에 비해 유의적으로 높은 비장 증식능을 보였다. LPS에 의해 활성화된 복강 대식세포의 사이토카인 분비량을 측정한 결과에서도 IL-1g, TNF-α의 분비량은 마우스 체중 kg 당 500 ㎎/㎏ B.W. 농도의 투여군에서 유의적으로 높은 생성량을 보여주었으며, 50 ㎎/㎏ B.W.의 농도 투여군에서는 대조군에 비해 유의적인 차이를 보이지 않았다. IL-6의 경우 50 ㎎/㎏ B.
-6의 분비를 촉진시킴으로서 면역기능 증강에 효과적으로 작용할 가능성이 있을 것으로 사료된다. TNF-α 분비량에 대한 결과는 추출물 투여시 500 ㎎/㎏ B.W. 실험군에서 대조군에 비해 유의적으로 높은 수준의 TNF-α가 생성되었으며, 이는 더덕 물 추출물 첨가시 1~100 pg/mL의 저농도에서는 변화를 보이지 않다가 1,000 pg/mL 의 고농도에서 유의적인 증가를 보인 다른 연구와도 유사한 경향을 보였다.24) 또한 생강 추출물과 탈지 들깨 물추출물을 식이로 첨가한 연구에서도 역시 LPS로 자극했을 때 유의적으로 높은 TNF-α가 분비됨을 보고하였다.
의 농도로 마우스에 경구 투여한 후 비장세포 증식능, LPS에 의해 활성화된 복강 대식세포가 분비하는 염증성 사이토카인(IL-1g, IL-6, TNF-α)의 생성량을 측정하였다. 그 결과 더덕 물 추출물은 ConA나 LPS로 자극하지 않은 경우 500 ㎎/㎏ B.W. 농도에서 대조군에 비해 유의적으로 높은 비장 증식능을 보였다. LPS에 의해 활성화된 복강 대식세포의 사이토카인 분비량을 측정한 결과에서도 IL-1g, TNF-α의 분비량은 마우스 체중 kg 당 500 ㎎/㎏ B.
농도에서 T세포와 B 세포를 자극하여 비장세포 증식을 촉진시키는 것으로 사료되며 이러한 결과는 면역 증진 효과를 기대할 수 있는 가능성을 제시해준다. 더덕의 물 추출물 경구투여와 사이토카인 분비능 연구에서 IL-1B 분비량에 대한 결과는 500 ㎎/㎏ B.W. 농도에서 높은 증식효과를 보여주었으며, 이는 더덕 물 추출물을 100과 1,000 “g/mL에서 각각 32.49 pg/mL 과 39.69 pg/mL로 유의적으로 증가한 연구 결과와 유사한 경향을 보였다.24)
IL-1은 Th cell에 의한 IL-2, IL-4, IFN-y 등의 분비를 유도시키고 B 림프구가 pre B 림프구로부터 성숙하는 단계와 미토젠에 의해 증식하는 단계에 직접 또는 Th cell 경유하여 작용함으로써 이들의 분화 및 증식을 촉진시킨다. 따라서 더덕추출물은 마우스 복강 대식세포를 활성화하여 IL-18 생성을 촉진시킴으로서 면역증강효과가 있을 것으로 사료된다. IL-6 분비량에 대한 연구의 결과는 생강21) 추출물 2주 경구 투여 실험의 50, 500 ㎎/㎏ B.
83 pg/mL로 대조군에 비해 유의적으로 상승시켰다는 선행연구가 있었다. 본 실험의 LPS 처리시 더덕 물 추출물 마우스 50, 500 ㎎/㎏ B.W. 두 농도 모두에서 높은 IL-6 분비량 증가를 나타냈다. 따라서 더덕 물 추출물이 마우스 복강 대식세포를 활성화시켜 Ⅱ.
19)에 비해 증가를 나타냈다. 세포성 면역과 연관되어 T세포를 선택적으로 증식시키는 미토젠인 ConA 첨가시 50 ㎎/㎏ B.W.과 500 ㎎/㎏ B.W. 투여군에서 2.70 ±0.25, 3.63 ±0.94 pg/mL로 대조군(2.23 ±0.06)에 비해 유의적으로 높은 증식능을 보였다 (p < 0.05). 체액성 면역과 관련이 있는 B 세포를 선택적으로 증식시키는 미토젠인 LPS 첨가시에도 50 ㎎/㎏ B.
두 농도 모두에서 유의적으로 높은 분비능을 보였다. 이상의 결과에 따르면 더덕 추출물의 비장 세포 증식능과 사이토카인 분비 효과는 500 ㎎/㎏ B.W. 농도 투여시 가장 효과적으로 면역 세포와 면역 기관의 주요기능을 증진시킬 가능성이 있을 것으로 사료된다. 이러한 연구결과를 토대로 앞으로 더덕을 이용한 기능성 식품 개발에 기초 연구 자료로 활용되기를 기대된다.
농도 첨가군에서 유의적인 증가를 보여 유사한 결과를 나타내었다. 이와 같이 더덕 추출물 경구 투여가 마우스 비장세포 증식능에 미치는 영향에 대한 연구 결과, 더덕 추출물을 투여하지 않은 대조군에 비해 비장세포 증식이 증진되었으며, 50 ㎎/㎏ B.W. 의 농도보다 500 ㎎/㎏ B.W. 농도에서 T세포와 B 세포를 자극하여 비장세포 증식을 촉진시키는 것으로 사료되며 이러한 결과는 면역 증진 효과를 기대할 수 있는 가능성을 제시해준다. 더덕의 물 추출물 경구투여와 사이토카인 분비능 연구에서 IL-1B 분비량에 대한 결과는 500 ㎎/㎏ B.
05). 체액성 면역과 관련이 있는 B 세포를 선택적으로 증식시키는 미토젠인 LPS 첨가시에도 50 ㎎/㎏ B.W.과 500 ㎎/㎏ B.W. 투여군에서 3.44 ±0.34, 3.19 士 0.37 pg/mL로 대조군에 비해 유의적으로 높은 증식능을 보였다 (p < 0.05).
후속연구
농도 투여시 가장 효과적으로 면역 세포와 면역 기관의 주요기능을 증진시킬 가능성이 있을 것으로 사료된다. 이러한 연구결과를 토대로 앞으로 더덕을 이용한 기능성 식품 개발에 기초 연구 자료로 활용되기를 기대된다.
이상의 결과 더덕시료의 추출물을 마우스에 경구 투여하였을 경우 활성화된 복강대식세포에서 염증성 사이토카인 IL-1g, IL-6, TNF-α 분비량이 촉진되어, 더덕 추출물 섭취에 의한 면역활성을 잠재적으로 가지고 있다가 외부 항원 침입시 더덕 추출물이 면역세포의 활성화에 관여하여 면역기능을 향상시킬 것으로 기대된다.
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