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제안 방법
- 14C-cholesterol (NEN, Boston MA, USA) 0.2 μci을 각각의 쥐에게 섭취시킨 후, 만 1일에서부터 6일까지의 변을 수집하여 상온에서 건조시켜 무게를 측정하였다.
- 4)에 넣고, 12 tubes 에 할당하여 duplicate tube를 0, 10, 20, 30, 40, 50분간 배양 후 얼음으로 옮겨 efflux를 중단시켰다. 각 tube들을 원심 분리하여 상층을 다른 tube에 옮긴 후 상층액속의 Na 농도를 원자분광계로 측정하였다. Ouabain과 furosemide의 존재 하에서 농도차에 의해 흘러나오는 Na-passive leak은 라디칼 생성물질, AAPH [2, 2-Azobis (2-amidinopropane) dihydrochloride]에 노출되었을 때 적혈구막의 손상과 함께 증가된다.
- 각 군당 4마리의 간과 대동맥을 같은 부위에서 채취하여각 4견본을 만들어 관찰하였는데 대표성이 있는 조직사진을 Fig. 1에 제시하였다. 간의 크기에서는 그룹간 별 차이가 없었으나 육안으로 봤을 때 대조군의 간이 녹차 분말군과 녹차 추출물군에 비해 저색소 (hypochromic)임을 알 수 있었다.
- 간 시료의 콜레스테롤과 중성지방의 추출은 Folch 등21) 의 방법을 다소 수정한 것으로, 간 조직 1 g을 6 ml chloroform/methanol mixture (2：1, v/v)와 2 ml 증류수를 넣어 균질화한 후 3,000 × g에서 원심분리하였다.
- 본 연구에서 녹차 추출물 식이군의 섭취량에 준해 대조군의 식이섭취량을 조절하여 pair feeding 함으로서 녹차의 항증체나 지질개선 및 혈소판 응집성에 대한 효과에 대해 보다 정확하게 이해하고자 하였고, 콜레스테롤 흡수를 비롯한 녹차의 생리활성 효과에 있어서 녹차분말이 녹차추출물에 상응하는지를 조사하기 위해 대조군 식이와 함께 녹차분말군, 녹차추출물군으로 나누어 비교하였다. 또한 녹차의 항산화효과에 초점을 맞추어 적혈구막의 안정성 및 TBARS생성 등 산화관련 몇가지 지표를 함께 조사하였다.
- 본 연구에서 pair feeding함으로서 사료 섭취량이 체중이나 지단백 대사에 미칠 요인을 제거한 상태에서 녹차분말이나 녹차추출물이 갖는 항 비만효과나 지질 강하효과를 비교 조사하였다.
- 동물실험에 있어서 사료의 섭취량은 증체와 연결되고 체중의 증가는 지질대사나 혈소판 응집성 등의 심순환 관련 지표에 직접 영향을 줄 수 있으므로 녹차의 항 증체 효과나 지질개선 효과가 녹차의 어떤 성분에 의한 대사적 기전에서 오는 것인지 녹차의 부정적인 맛으로 인한 식이섭취량 감소 때문인지 분명하지 않다. 본 연구에서 녹차 추출물 식이군의 섭취량에 준해 대조군의 식이섭취량을 조절하여 pair feeding 함으로서 녹차의 항증체나 지질개선 및 혈소판 응집성에 대한 효과에 대해 보다 정확하게 이해하고자 하였고, 콜레스테롤 흡수를 비롯한 녹차의 생리활성 효과에 있어서 녹차분말이 녹차추출물에 상응하는지를 조사하기 위해 대조군 식이와 함께 녹차분말군, 녹차추출물군으로 나누어 비교하였다. 또한 녹차의 항산화효과에 초점을 맞추어 적혈구막의 안정성 및 TBARS생성 등 산화관련 몇가지 지표를 함께 조사하였다.
- 사료제조에서 녹차분말군의 녹차 분말10%에 준해서 대조군과 녹차 추출군에 섬유소 5% 첨가하였는데 대조군, 녹차 분말군 그리고 녹차 추출물군의 6일간 수집된 변의 무게는 큰 차이 없었다 (Table 6). 섭취한 0.
- 실험기간동안 물은 무제한으로 공급하였으며 실험식이는 녹차 추출물군에 준한 제한식이를 하였다. 사양기간 동안 3일 간격으로 식이섭취량, 체중변화를 기록하였고, 4주 때 쥐들을 12시간 절식한 후 cardiac puncture에 의해 heparin 처리된 전혈 (whole blood)을 채취하였다. 간은 바로 적출하여 거름종이로 표면의 혈액을 제거하여 무게를 측정한 후, 간 조직 일부와 동맥을 분리하여 조직 검사를 위해 Bouin’s solution용액에 고정시키고, 남은 간 조직은 총콜레스테롤, 중성지방 분석을 위해 -20℃ 냉동고에 보관하였다.
- 생후 7주된 체중 200~230 g 전후의 Sprague Dawley 숫쥐 30마리를 각 10마리씩 3 실험군으로 나누어 AIN-76을 근거로 0.5% cholesterol과 0.2% cholate를 함유한 대조군 (control)과 대조군 식이에 10% 녹차분말을 첨가한 녹차 분말군 (green tea powder) 또는 녹차의 에탄올 추출에 있어서 최대 회수율을 약 30%으로 추정하여 3% 녹차 추출물을 첨가한 녹차 추출물군 (green tea extract)의 2개 처리군으로 식이로 조제하였으며, 녹차 분말에 상응하는 5%의 섬유소를 대조군과 녹차 분말군에 첨가하였다 (Table 1). 쥐들은 각기 stainless steel cage에서 4주간 분리·사육하였으며, 동물 사육실의 명암주기는 12시간, 온도 20~25℃와 습도 40~60%는 일정하게 유지되도록 조절하였다.
- Suzuki 등26)의 mouse 실험에서 1일 400 mg 녹차추출물을 물에 타서 섭취시키는 경우 사료섭취량의 감소와 함께 낮은 증체율과 더불어 혈중지질의 개선효과를 보였다. 이렇게 녹차나 녹차 카테킨은그 특유의 수렴성 쓴맛으로 인해 식욕감소 효과가 있는 것으로 알려져 있는데, 본 연구에서는 예비실험에서 식이섭취량이 가장 낮은 녹차 추출물군에 맞추어 pair feeding 함으로서 섭취열량에 의한 요인을 배제한 녹차 자체의 항비만 효과나 지질 개선효과를 비교할 수 있었다. 각 군당 평균 사료섭취량을 15.
- 하층액 500 ㎕을 취하여 clean bench에서 자연 건조한 후, 여기에 50 ㎕ Triton X-100/chloroform mixture (1：1, v/v)와 450 ㎕ chloroform을 넣어서 500 ㎕로 만들어 가볍게 흔들어 내용물을 용해시켰다. 이중 20~50 ㎕을 취하여 chloroform을 휘발시킨 후 Asan kit을 사용하여 간의 콜레스테롤을 측정하였다. 간 중성지방은 하층액 20~50 ㎕를 취하여 chloroform을 휘발시킨 후 50 ㎕ 메탄올을 넣고 용해 시켜 Asan kit을 사용하여 측정하였다.
- 적출 즉시 손상을 최소화하기 위해 Bouin’s solution에 고정하였고, 자동조직파라핀 유도장치를 이용해 paraffin 유도과정을 거쳐 파라핀 블록을 만들어 microtome을 이용하여감 및 동맥 조직의 종단면을 5~7 μm 두께로 절편하였다.
- 적혈구를 다시 CWS로 희석하여 hematocrit 40~50%의 적혈구 용액이 되게 조정한 후 hematocrit을 측정하였다. 적혈구 용액 50 ㎕를 5 ml 의 0.02% acationox (metal free detergent, Scientific Product, USA) 넣은 것으로 intracellular Na을 측정하였다.
- 4]를 넣고 천천히 섞어 원심 분리하는 과정을 5회 반복하여 씻어주었다. 적혈구를 다시 CWS로 희석하여 hematocrit 40~50%의 적혈구 용액이 되게 조정한 후 hematocrit을 측정하였다. 적혈구 용액 50 ㎕를 5 ml 의 0.
- 적출 즉시 손상을 최소화하기 위해 Bouin’s solution에 고정하였고, 자동조직파라핀 유도장치를 이용해 paraffin 유도과정을 거쳐 파라핀 블록을 만들어 microtome을 이용하여감 및 동맥 조직의 종단면을 5~7 μm 두께로 절편하였다. 조직표본은 Harris hematoxylin과 0.5%-eosin으로 비교염색을 하여 광학현미경 400배율에서 관찰하였다.
- 준비한 적혈구 용액 각 2 ml를 1 mM의 AAPH가 들어 있거나 들어있지 않는 각 40 ml medium (150 mM choline chloride, 10 mM glucose, 1 mM furosemide, 1 mM ouabain, 10 mM Tris-MOPS, pH 7.4)에 넣고, 12 tubes 에 할당하여 duplicate tube를 0, 10, 20, 30, 40, 50분간 배양 후 얼음으로 옮겨 efflux를 중단시켰다. 각 tube들을 원심 분리하여 상층을 다른 tube에 옮긴 후 상층액속의 Na 농도를 원자분광계로 측정하였다.
- 쥐들은 각기 stainless steel cage에서 4주간 분리·사육하였으며, 동물 사육실의 명암주기는 12시간, 온도 20~25℃와 습도 40~60%는 일정하게 유지되도록 조절하였다.
- 5 ml씩 넣은 후 37℃ water bath에서 총콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤은 5분간, 중성지방은 10분간 배양 하여 발색시켰다. 총 콜레스테롤과 HDL-콜레스테롤은 500 nm에서, 그리고 중성지방은 550 nm에서 spectrophotometer로 흡광도를 측정하였다.
- , Ltd, Korea)을 사용하였다. 총 콜레스테롤과 중성지방 분석에는 혈청 10 ㎕을 사용하였고, HDL-콜레스테롤의 분석에는 200 ㎕을 사용하여 두 반복으로 진행하였다. HDL-콜레스테롤은 분리시액 200 ㎕를 넣고 vortex 하여, 10분 방치한 것을 1,000 × g에서 10분간 원심 분리한 후 상층액 50 ㎕를 가지고 분석하였다.
- 콜레스테롤 흡수율을 측정하기 위한 실험으로 생후 8주된 Sprague Dawley 숫쥐 12마리를 각각 4마리씩 3개 군으로 나누어, 동일한 사육실 환경에서 3일간 실험식이를 공급하고 20시간을 절식시킨 후 0.2 μCi 분량의 C14-cholesterol 용액 200 ㎕를 암흑주기 시작 10분 전에 실험 식이에 넣어 섭취시켰다.
- 혈액 0.25 ml을 생리식염수로 희석하여 (1：4) 혈소판이 대략 200,000/ ㎕로 조정한 후 ADP (2μM)을 첨가하여 응집을 유도했고, 3회 반복한 평균치를 사용하였다.
데이터처리
- 본 실험의 결과는 평균 (mean)과 표준편차 (SD, standard deviation)로 표시하였고, 각 실험군간의 비교는 one-way ANOVA를 이용하여 분석한 후, p < 0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test에 의해 각 식이에 따른 처리구간의 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 2 μci을 각각의 쥐에게 섭취시킨 후, 만 1일에서부터 6일까지의 변을 수집하여 상온에서 건조시켜 무게를 측정하였다. 분쇄한각 시료 0.2 g를 20 ml scintillation cocktail (S￠INT-A XF, Packard)에 넣어 상온에서 3일간 보관한 후 Liquid scintillation counter (Packard 2700PR)를 이용하여 측정 하였고 소량의 색도광은 외표준선원법 (ESCR)으로 보정하였다.
- 25 ml을 생리식염수로 희석하여 (1：4) 혈소판이 대략 200,000/ ㎕로 조정한 후 ADP (2μM)을 첨가하여 응집을 유도했고, 3회 반복한 평균치를 사용하였다. 혈소판 응집은 whole blood platelet aggregation을 측정하는 impedance 방법으로, 혈소판의 응집에 따라 형성되는 두 전극간의 저항 (ohm)의 증가로 나타나는데 Chronolog aggregometer (model 500, Havertown PA, USA)를 사용하여 측정하였다.
- 혈장 TBARS (thiobarbituric acid reactive substance)측정은 변형된 Yagi 방법24)에 의한 것으로, 1/12N 황산과 10% phosphotungstic acid로 침전된 혈장내의 지방을 TBA와 반응시킨 후 n-butanol층으로 옮긴 TBARS (Thiobarbituric acid reactive substance)를 Spectrofluorometer (Kontron Instruments SFM-25)의 excitation 515 nm, emission 553 nm에서 정량하였고, 1, 1, 4, 4-tetramethoxy propane을 표준용액으로 사용하였다.
- 혈청내의 총콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, 그리고 중성지방의 성분정량분석에는 En-zyme assay kit (Asan pharmaceutical Co., Ltd, Korea)을 사용하였다. 총 콜레스테롤과 중성지방 분석에는 혈청 10 ㎕을 사용하였고, HDL-콜레스테롤의 분석에는 200 ㎕을 사용하여 두 반복으로 진행하였다.
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