Gas chromatography를 이용한 향미 유전자원의 2-acetyl-1-pyrroline 정량분석 Quantification of 2-Acetyl-1-pyrroline from the Aroma Rice Germplasm by Gas Chromatography원문보기
본 실험은 국내 육성향미자원과 유전적 배경이 서로 다른 도입향미 유전자원의 2AP 함량을 비교분석하여, 2AP 함량이 높고 농업적 형질이 우수한 자원을 선발하여 우수한 향미자원의 육성에 필요한 기초 자료를 제공하고자 실시하였다. 3종류의 유기용매에 대한 추출효율은 ethanol>acetonitle>methanol 순으로 확인되었으며, ethnanol의 경우 $30-90^{\circ}C$의 온도범위에서 3가지 유기용매 중 2AP 추출효과가 가장 뛰어났고, 특히 $90^{\circ}C$에서 30분간 추출하였을 때 2AP 추출함량이 가장 높았고 추출 시간이 경과할수록 2AP의 함량이 낮았다. 현미의 분쇄정도에 따른 2AP 추출함량은 5초간 분쇄하였을 경우 가장 높았으며 분쇄 시간이 길어질수록 낮아졌다. 선발한 30품종 중 국내 향미자원과 자포니카형 도입자원의 평균 출수일은 각각 130.3일과 131.8일로 비슷하였으며 인디카형 도입자원은 약 137.1일로 가장 늦었다. 평균 1,000립중은 인디카형 도입자원이 19.9 g으로 가장 낮았으며, 국내 향미자원이 21.65 g이었고 자포니카형 도입자원은 25.5 g으로 높았다. 선발자원의 향에 대한 관능검사는 국내 향미자원 5품종 중향남벼 2호, 아랑향찰벼가 중간 정도의 향을 띄었고 인디카형 도입자원 19품종 중에서 11품종(57.9%)과 자포니카형 도입자원 6품종 중 2품종(33.3%)이 중간 이상의 향을 나타났다. 선발한 30품종의 평균 2AP 함량은 국내 육성 향미자원이 도입 향미자원에 비해 낮았으며 도입자원에서는 인디카형이 자포니카형보다 높은 2AP 함량을 나타내었다. 국내 육성 향미자원은 아랑향찰벼외 4품종과 도입 향미자원 중 인디카형은 Basmati6313 외 18품종 및 자포니카형은 자향나 861 외 5품종을 선발하였다.
본 실험은 국내 육성향미자원과 유전적 배경이 서로 다른 도입향미 유전자원의 2AP 함량을 비교분석하여, 2AP 함량이 높고 농업적 형질이 우수한 자원을 선발하여 우수한 향미자원의 육성에 필요한 기초 자료를 제공하고자 실시하였다. 3종류의 유기용매에 대한 추출효율은 ethanol>acetonitle>methanol 순으로 확인되었으며, ethnanol의 경우 $30-90^{\circ}C$의 온도범위에서 3가지 유기용매 중 2AP 추출효과가 가장 뛰어났고, 특히 $90^{\circ}C$에서 30분간 추출하였을 때 2AP 추출함량이 가장 높았고 추출 시간이 경과할수록 2AP의 함량이 낮았다. 현미의 분쇄정도에 따른 2AP 추출함량은 5초간 분쇄하였을 경우 가장 높았으며 분쇄 시간이 길어질수록 낮아졌다. 선발한 30품종 중 국내 향미자원과 자포니카형 도입자원의 평균 출수일은 각각 130.3일과 131.8일로 비슷하였으며 인디카형 도입자원은 약 137.1일로 가장 늦었다. 평균 1,000립중은 인디카형 도입자원이 19.9 g으로 가장 낮았으며, 국내 향미자원이 21.65 g이었고 자포니카형 도입자원은 25.5 g으로 높았다. 선발자원의 향에 대한 관능검사는 국내 향미자원 5품종 중향남벼 2호, 아랑향찰벼가 중간 정도의 향을 띄었고 인디카형 도입자원 19품종 중에서 11품종(57.9%)과 자포니카형 도입자원 6품종 중 2품종(33.3%)이 중간 이상의 향을 나타났다. 선발한 30품종의 평균 2AP 함량은 국내 육성 향미자원이 도입 향미자원에 비해 낮았으며 도입자원에서는 인디카형이 자포니카형보다 높은 2AP 함량을 나타내었다. 국내 육성 향미자원은 아랑향찰벼외 4품종과 도입 향미자원 중 인디카형은 Basmati6313 외 18품종 및 자포니카형은 자향나 861 외 5품종을 선발하였다.
This study was conducted to optimize the analysis condition and quantify the 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) in the brown aroma rice. Extraction effect of the solvent for 2AP was the order of ethanol>acetonitrile>methanol in the range from 30 to $90^{\circ}C$. In the extraction time of 15, 30,...
This study was conducted to optimize the analysis condition and quantify the 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) in the brown aroma rice. Extraction effect of the solvent for 2AP was the order of ethanol>acetonitrile>methanol in the range from 30 to $90^{\circ}C$. In the extraction time of 15, 30, 60, and 90 min, the 30 min had the highest 2AP concentration, and it was decreased according to lapse of time. At grinding time, 5 sec resulted in highest 2AP concentration. It was recommended that five sec grinding time, using ethanol, at $90^{\circ}C$ for 30 min was the optimization conditions to quantify the 2AP. Hyangmibyeo2ho and Aranghyangchalbyeo were mild aroma. In the foreign aroma rice, 11 of 19 accessions of Indica types and 2 of 6 accessions of Japonica types were more than mild aroma. Finally, 30 accessions of aroma rice were selected based on their 2AP concentration and agronomic traits.
This study was conducted to optimize the analysis condition and quantify the 2-acetyl-1-pyrroline (2AP) in the brown aroma rice. Extraction effect of the solvent for 2AP was the order of ethanol>acetonitrile>methanol in the range from 30 to $90^{\circ}C$. In the extraction time of 15, 30, 60, and 90 min, the 30 min had the highest 2AP concentration, and it was decreased according to lapse of time. At grinding time, 5 sec resulted in highest 2AP concentration. It was recommended that five sec grinding time, using ethanol, at $90^{\circ}C$ for 30 min was the optimization conditions to quantify the 2AP. Hyangmibyeo2ho and Aranghyangchalbyeo were mild aroma. In the foreign aroma rice, 11 of 19 accessions of Indica types and 2 of 6 accessions of Japonica types were more than mild aroma. Finally, 30 accessions of aroma rice were selected based on their 2AP concentration and agronomic traits.
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문제 정의
Buttery 등(5)은 ‘2-acetyl-1-pyrroline’에 대하여 양적으로는 미량 함유되어 있으나 쌀을 취반할 때 생성되는 향기생성에 중요한 역할을 하며 일반미보다는 향미에 많이 함유되어 있다고 보고하였다. 따라서 본 실험은 국내 육성향미자원과 유전적 배경이 서로 다른 도입향미 유전자원 및 다면적 재배품종의 2AP 함량을 비교 분석하여, 2AP 함량이 높고 농업적 형질이 우수한 자원을 선발하고 향후 우수한 향미 품종의 육성에 필요한 기초 자료를 제공하고자 실시하였다.w
본 실험은 국내 육성향미자원과 유전적 배경이 서로 다른 도입향미 유전자원의 2AP 함량을 비교분석하여, 2AP 함량이 높고 농업적 형질이 우수한 자원을 선발하여 우수한 향미자원의 육성에 필요한 기초 자료를 제공하고자 실시하였다. 3종류의 유기용매에 대한 추출효율은 ethanol>acetonitle>methanol 순으로 확인되었으며, ethnanol의 경우 30-90℃의 온도범위에서 3가지 유기용매중 2AP 추출효과가 가장 뛰어났고, 특히 90℃에서 30분간 추출 하였을 때 2AP 추출함량이 가장 높았고 추출 시간이 경과할수록 2AP의 함량이 낮았다.
본 실험의 목적 중에 하나는 대량의 유전자원이 가지는 특성을 신속·정확하게 분석하는 것이다.
제안 방법
2AP의 효과적인 검출을 위해 GC(Thermo Fisher Scientific)의 샘플당 분석시간 과 작업시간을 고려하여 가장 효과적이고 경제적인 추출시간을 알아보고자 90℃ 항온수조에서 15, 30, 60분, 그리고 90분간 각각 추출하여 2AP의 함량을 비교하였다. 또한 보다 효과적인 추출조건의 확립을 위해 현미를 분쇄하는 정도에 따른 2AP의 추출량을 비교하고자 5초부터 25초까지 5초 간격으로 분쇄기를 작동하여 분쇄한 현미가루와 분쇄하지 않은 현미를 90℃ water bath에서 30분간 추출하여 3,500 rpm에서 30초간 원심분리 하고 상등액을 1 μL씩 GC(Thermo Fisher Scientific)에 주입하여 분석하였다.
각 재료에 대한 2AP의 효과적인 추출을 위해 실험실용 현미기(Ssangyong)로 탈영시켜서 사미, 피해립 등을 제거하여 사용하였으며, 파키스탄에서 도입한 Bsamati 370(WAR09)을 대표 향미벼로 선발하여 다음의 조건에서 2AP 최적 추출 조건을 구명하였다.
공시재료 79품종의 현미를 분쇄기로 5초 간 분쇄한 현미가루 200 mg을 1 mL screw cap vial에 넣고 0.75 mL 100% ethanol을 첨가하여 90℃ 항온수조에 30분간 가열하여 2AP를 추출한 후, 3,500 rpm에서 30초간 원심분리하여 상등액을 1 μL씩 분석하였다.
공시재료 중 정상적으로 출수한 79품종을 실험실용 현미기(SY88-TH, Ssangyong, Incheon, Korea)로 탈영시켜 현미로 만든 다음 Blind test 방식으로 각각의 현미를 씹어서 느껴지는 향을 세분하여 무향(non-aromatic; -), 약유향(lightly aroma; +), 유향(mild aroma; ++), 팝콘향(popcorn aroma; +++)로 분류하였다.
본 실험의 목적 중에 하나는 대량의 유전자원이 가지는 특성을 신속·정확하게 분석하는 것이다. 따라서 다소 화학적으로 복잡한 추출방법을 피하고 가능하다면 간편하고 신속하게 2AP를 정량할 수 있는 추출 및 분석방법을 택하여 비교분석 하였다. 향후, 본 실험의 결과를 통해 선발된 30품종들은 GC-MS분석을 통한 품종간의 방향성 화합물의 정성·정량적 분석을 통해보다 정확한 방향성 향미자원 육종 재료의 선발이 필요할 것으로 사료된다.
또한 보다 효과적인 추출조건의 확립을 위해 현미를 분쇄하는 정도에 따른 2AP의 추출량을 비교하고자 5초부터 25초까지 5초 간격으로 분쇄기를 작동하여 분쇄한 현미가루와 분쇄하지 않은 현미를 90℃ water bath에서 30분간 추출하여 3,500 rpm에서 30초간 원심분리 하고 상등액을 1 μL씩 GC(Thermo Fisher Scientific)에 주입하여 분석하였다.
또한 유기용매별로 추출온도에 따라 2AP의 휘발성 정도가 다를 것으로 판단하여 30-90℃까지 10℃ 간격으로 온도를 변화시켜 현미가루로부터 2AP를 추출하여, 3,500 rpm에서 30초간 원심분리 후, 상등액을 1 μL를 GC(Thermo Fisher Scientific)에 주입하여 분석하였다.
공시재료로 79품종의 생육특성을 농촌진흥청 농업과학기술 연구조사 분석기준에 준하여 조사하였다. 벼의 생육특성은 출수기(heading date)는 총경수의 40%가 출수한 날을 기준으로 구별로 조사하였다. 수량 구성 요소에 해당하는 천립중은 현미 1,000립의 무게를 각각 3반복 조사하였다.
본 실험에서는 향미벼로부터 2AP를 비롯한 방향성 화합물을 효과적으로 추출하기 위한 다양한 용매와 조건들에 대한 연구 결과들 중(5,15) 2AP 추출에 가장 효과적인 것으로 보고되어 있는 acetonitrile, ethanol 그리고 methanol 등 3가지 유기용매(Sigma- Aldrich)를 사용하여 비교분석하였다(16-17). 또한 유기용매별로 추출온도에 따라 2AP의 휘발성 정도가 다를 것으로 판단하여 30-90℃까지 10℃ 간격으로 온도를 변화시켜 현미가루로부터 2AP를 추출하여, 3,500 rpm에서 30초간 원심분리 후, 상등액을 1 μL를 GC(Thermo Fisher Scientific)에 주입하여 분석하였다.
분석한 시료의 peak area(%)로부터 2AP의 함량을 구하기 위해 Sigma사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입한 2AP 표준물질을 ethanol에 0.5, 1, 2, 3, 4 ppm으로 용해시켜 GC (TRACE2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 주입한 후 표준 물질 농도별로 나온 peak area와 상관계수를 구하여 검량선을 작성하였다.
벼의 생육특성은 출수기(heading date)는 총경수의 40%가 출수한 날을 기준으로 구별로 조사하였다. 수량 구성 요소에 해당하는 천립중은 현미 1,000립의 무게를 각각 3반복 조사하였다.
대상 데이터
Table 1은 실험에 사용한 79품종 중에서 2AP 함량(Fig. 4)이 높으며 벼의 수량을 결정하는 구성요소 중 1,000립중(1,000 weight) 이 많고 출수기간이 짧은 자원을 선발하였다. 국내 육성 향미자원은 아랑향찰벼 외 4품종(21)과 도입 향미자원은 Indica type의 Basmati6313 외 18품종 및 도입 향미자원은 Japonica type의 Jahyangna861 외 5품종을 선발하였다.
선발한 30품종의 평균 2AP 함량은 국내 육성 향미자원이 도입 향미자원에 비해 낮았으며 도입자원에서는 인디카형이 자포니카형보다 높은 2AP 함량을 나타내었다. 국내 육성 향미자원은 아랑향찰벼외 4품종과 도입 향미자원 중 인디카형은 Basmati6313 외 18품종 및 자포니카형은 자향나 861 외 5품종을 선발하였다.
실험에 사용한 벼품종은 Kim 등(14)이 사용한 재료와 동일하며, 향미자원 65품종(국내 육성-5품종, 국외 육성-60품종) 및 국내에서 다면적 재배품종 14품종을 비향미 자원으로 하여 총 79품종이었다. 시험재배관리는 농촌진흥청 농업생명공학연구원 유전자원과 답작포장에서 수행하여 재배, 수확한 것을 사용하였다. 수확한 벼는 수분이 15%가 되도록 음건시켜 4℃에 저장하여 실험에 사용하였다.
실험에 사용한 벼품종은 Kim 등(14)이 사용한 재료와 동일하며, 향미자원 65품종(국내 육성-5품종, 국외 육성-60품종) 및 국내에서 다면적 재배품종 14품종을 비향미 자원으로 하여 총 79품종이었다. 시험재배관리는 농촌진흥청 농업생명공학연구원 유전자원과 답작포장에서 수행하여 재배, 수확한 것을 사용하였다.
이론/모형
GC는 Thermo-FID형을 사용하였다. 분석용 column은 Thermo DB5MS(30 m×0.
2007년 수원시 권선구 유전자원과 증식포장에 국내 및 도입 향미자원을 파종하여 생육관련 형질을 조사하였다. 공시재료로 79품종의 생육특성을 농촌진흥청 농업과학기술 연구조사 분석기준에 준하여 조사하였다. 벼의 생육특성은 출수기(heading date)는 총경수의 40%가 출수한 날을 기준으로 구별로 조사하였다.
성능/효과
2AP 표준물질을 농도별로 희석하여 GC로 분석한 후 표준물질 농도별로 나온 peak area로부터 검량식을 구하였고, Fig. 1과 같이 상관계수(R2)가 0.999로 매우 높은 유의성을 보였으며 검량선의 패턴은 y=0.00004x−0.02226의 직선형을 나타내었다.
ethanol의 경우 30-90℃의 온도 범위에서 3가지의 유기용매 중 2AP 추출효과가 가장 뛰어났고, 특히 90℃에서 2AP 추출농도가 가장 높았다. 3종류의 유기용매 중 극성이 가장 높은 acetonitrile은 methanol과 ethanol 의 중간적인 효과를 나타내었는데 90℃보다 70℃에서 2AP 추출 농도가 높았다. Itani 등(18)은 ethanol을 이용하여 80℃ 항온수조에서 60분간 진탕하여 효과적으로 추출한 것으로 보고하였다.
3종류의 유기용매에 대한 추출효율은 ethanol>acetonitle>methanol 순으로 확인되었으며, ethnanol의 경우 30-90℃의 온도범위에서 3가지 유기용매중 2AP 추출효과가 가장 뛰어났고, 특히 90℃에서 30분간 추출 하였을 때 2AP 추출함량이 가장 높았고 추출 시간이 경과할수록 2AP의 함량이 낮았다.
9 ng/g이었다. 결과에서 평균 2AP함량은 국내 육성 향미 자원이 도입 향미자원에 비해 낮은 경향을 보였으며 도입자원에서는 Indica type의 향미 자원이 높은 2AP 함량을 나타내었다. Jeong 등(20)에 의하면 향미자원을 GC로 분석하였을 때, 향남벼를 비롯한 Japonica type의 평균 2AP 농도는 142.
3 ng/g이었다. 도입 향미자원 중 Indica type의 평균 2AP함량은 115.5 ng/g이었고 2AP 함량 범위는 30.6-603.0 ng/g이었으며, Japonica type의 평균 2AP함량은 102.1 ng/ g이었고 2AP 함량 범위는 32.7-285.9 ng/g이었다. 결과에서 평균 2AP함량은 국내 육성 향미 자원이 도입 향미자원에 비해 낮은 경향을 보였으며 도입자원에서는 Indica type의 향미 자원이 높은 2AP 함량을 나타내었다.
5 g으로 높았다. 선발자원의 향에 대한 관능검사는 국내 향미자원 5품종 중 향남벼 2호, 아랑향찰벼가 중간 정도의 향을 띄었고 인디카형 도입자원 19품종 중에서 11품종(57.9%)과 자포니카형 도입자원 6품종 중 2품종(33.3%)이 중간 이상의 향을 나타났다. 선발한 30품종의 평균 2AP 함량은 국내 육성 향미자원이 도입 향미자원에 비해 낮았으며 도입자원에서는 인디카형이 자포니카형보다 높은 2AP 함량을 나타내었다.
현미의 분쇄정도에 따른 2AP 추출함량은 5초간 분쇄하였을 경우 가장 높았으며 분쇄 시간이 길어질수록 낮아졌다. 선발한 30품종 중 국내 향미자원과 자포니카형 도입자원의 평균 출수일은 각각 130.3일과 131.8일로 비슷하였으며 인디카형 도입자원은 약 137.1일로 가장 늦었다. 평균 1,000립중은 인디카형 도입자원이 19.
3%)이 중간 이상의 향을 나타났다. 선발한 30품종의 평균 2AP 함량은 국내 육성 향미자원이 도입 향미자원에 비해 낮았으며 도입자원에서는 인디카형이 자포니카형보다 높은 2AP 함량을 나타내었다. 국내 육성 향미자원은 아랑향찰벼외 4품종과 도입 향미자원 중 인디카형은 Basmati6313 외 18품종 및 자포니카형은 자향나 861 외 5품종을 선발하였다.
시험재료로부터 2AP를 비롯한 방향성 화합물을 효과적으로 추출하기 위해 일반적으로 많이 사용하고 있는 3종류의 유기용매(acetonitile, ethanol, methanol)를 이용하여 추출온도(30-90℃)별로 각각 2AP를 추출하였고, 그 결과 Fig. 2와 같이 추출온도에 따라 차이를 보였으며, ethanol>acetonitle>methaol 순으로 추출효율을 보였다.
향미로부터 효과적인 2AP 추출을 위해 100% ethanol을 용매로 하여 90℃에서 15분, 30분, 60분, 90분 간격으로 추출하였고, 그 결과 Fig. 3의 A와 같이 30분간 추출하였을 때 2AP 추출함량이 가장 높았으며 추출 시간이 경과할수록 2AP의 함량이 낮아지는 경향을 보였다. 이와 유사한 결과가 SPME(solid phase micro extraction)방법에 의한 2AP의 추출조건으로 80℃에서 25분간 전열처리 후 15분간 2AP를 포집하여 분석하여 보고되었다(12-13).
현미의 분쇄정도(0, 5, 10, 15, 20, 25초)에 따른 2AP 추출함량의 차이를 살펴보면, Fig. 3의 B와 같이 5초간 분쇄하였을 경우 2AP 추출함량이 높았으며 분쇄하지 않은 현미로부터 추출하였을 경우 가장 낮은 2AP 함량을 나타내었고 분쇄 시간이 길어질수록 2AP의 함량이 낮아지는 경향을 나타내었다.
3종류의 유기용매에 대한 추출효율은 ethanol>acetonitle>methanol 순으로 확인되었으며, ethnanol의 경우 30-90℃의 온도범위에서 3가지 유기용매중 2AP 추출효과가 가장 뛰어났고, 특히 90℃에서 30분간 추출 하였을 때 2AP 추출함량이 가장 높았고 추출 시간이 경과할수록 2AP의 함량이 낮았다. 현미의 분쇄정도에 따른 2AP 추출함량은 5초간 분쇄하였을 경우 가장 높았으며 분쇄 시간이 길어질수록 낮아졌다. 선발한 30품종 중 국내 향미자원과 자포니카형 도입자원의 평균 출수일은 각각 130.
후속연구
향후, 본 실험의 결과를 통해 선발된 30품종들은 GC-MS분석을 통한 품종간의 방향성 화합물의 정성·정량적 분석을 통해보다 정확한 방향성 향미자원 육종 재료의 선발이 필요할 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
향미란?
향미는 북동아시아, 인도, 유럽, 남미 등에서 알려진 다양한 향을 갖는 고급미로서 일반미에 비해 고부가가치의 쌀로 알려져 있다. 최근 우리나라는 급격한 경제적인 성장과 더불어 소비자들의 소비성향도 변하여 점차 식량으로서의 기능 이외에 건강 증진에 도움이 되는 기능성을 가지고 있는 특수미에 대한 관심과 수요가 점차 늘고 있다(1-4).
관능적인 검사법의 한계는?
과거 육종가들은 향미벼를 선발하기 위해 관능적인 검사법(9) 을 통해 향의 정도를 평가하였으나 이것은 소요되는 시간은 짧고 주관적인 성향에 의존하고 있어서 정확한 평가가 이루어지지 않았다. 그러나 최근에는 향미벼의 향을 내는 주요한 요소 중의 하나인 2-acetyl-1-pyrroline(2AP)(5,10)의 효과적인 추출방법과 gas chromatography(GC)를 이용하여 2AP 함량을 정량적으로 분석하여 보다 과학적인 방법에 의해 우수한 향미벼를 선발하고 있으며, GC-MS(mass spectrophotometer)를 이용하여 정성·정량분석을 동시에 수행하고 있다(11-13).
과거의 관능적인 검사법과 달리 현재 향미벼를 선발하기 위해 사용하는 방법은 무엇인가?
과거 육종가들은 향미벼를 선발하기 위해 관능적인 검사법(9) 을 통해 향의 정도를 평가하였으나 이것은 소요되는 시간은 짧고 주관적인 성향에 의존하고 있어서 정확한 평가가 이루어지지 않았다. 그러나 최근에는 향미벼의 향을 내는 주요한 요소 중의 하나인 2-acetyl-1-pyrroline(2AP)(5,10)의 효과적인 추출방법과 gas chromatography(GC)를 이용하여 2AP 함량을 정량적으로 분석하여 보다 과학적인 방법에 의해 우수한 향미벼를 선발하고 있으며, GC-MS(mass spectrophotometer)를 이용하여 정성·정량분석을 동시에 수행하고 있다(11-13).
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