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문제 정의
- 2009)으로 주로 수행되었다. 본 연구에서는 particle bombardment를 이용하여 인체 모유 유래 락토페린 유전자를 고구마에 도입하여 락토페린 생산 형질전환 식물체를 개발하고 그 특성을 조사하였다.
- 본 연구에서는 인체 락토페린 유전자를 고구마의 배발생 캘러스에 particle bombardment 방법으로 도입하여 락토페린 생산 형질전환 고구마를 개발하였다. “Bio-factoriese 로써 식물에서 유용 단백질을 생산하기 위해 많은 연구가 진행되고 있는 시점에서 antimicrobial 락토페린 발현되는 형질전환 식물체는 경제적으로 중요한 특정 질병에 저항성을 증대시킴으로써 작물의 질적 향상을 꾀할 수 있으므로 신품종으로 개발될 수 있을 것이다.
제안 방법
- 0 kb 크기의 EcoRI-BgZII lactoferrin DNA fragment를 random primed DNA labeling kit (Boehringer Mannheim, Germany) 을 사용하여 동위원소 [a-32P]dCTP 로 표지한 후 probe로 사용하여 Southern 분석을 수행하였다. Membrane 을 prehybridization (1 M NazHPOq, 1 M NaHzPOi, 7% SDS, 1 mM Na"EDTA)용액에 넣고 60C에서 2시간 정도 prehybridization 한 후 약 16시간 동안 hybridization 시켰다. 반응을 마친 membrane 을 세척용액 (1 M N2HPO4, 1 M NaHPO& 1% SDS, 1 mM Na2-EDTA)으로 세척한 후 X-ray 필름에노출시켰다.
- 1979). Membrane을 1% BSA와 TBS[10 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.15 M NaCl]가 첨가된 blocking solution 에 4C 에서 2시간 동안 처리한 후 1:10, 000으로 희석된 락토페린 항체와 함께 1시간 동안 incubation 하였다 Membrane 을 TBS buffere 세척한 후 1시간 동안 alkaline phosphatase-conjugated goat anti-rabbit IgG (Bio-Rad) 에 담근 후 membrane을 alkaline phosphatase 발색용액 [0.015% BCIP, 0.03% NBT, carbonate buffer (0.1 M NaHCO3, 1 mMMgCl2, pH 9.8)] 을 이용하여 락토페린 생산을 확인하였다.
- Particle bombardment 후 1 mg/L 2, 4-D, 100 mg/L kanamycin 이 첨가된 MS (Murashige and Skoog 1962) 선발배지 (MS1DK) 에서 선발 증식된 배발생 캘러스를 MS 기본배지 (MSBMK) 로 옮겨 체세포배를 유도한 후 식물체로 분화시켰다. 재분화 식물체는 순화과정을 거쳐 생육상에서 재배하여 정상적인 괴근을 수확하였다.
- 2004). 식물의 경우 Mitra와 Zhang (1994)。]35S 프로모터를 이용하여 인체 락토페린을 담배 배양세포에서 처음으로 발현시킨 이래 인체 락토페린을 생산하는 형질전환 담배 (Zhang et al. 1998), 벼 (Humphrey et al. 2002) 및 토마토 (Lee et al. 2002) 등에서 특정 pathogen 에대해 antibacterial activity 를 가진 식물체를 개발하였다. 또한, CMV-Y 바이러스 대해 antiviral activity 를 가지는 형질전환 담배 (Liu et al.
- 락토페린 특이 염기서열 부분 (LactoF: 5’-GGC TCC TGC AAA TTT GAT GA-3’, Lacto R: 5’- TTA CTT CCT GAG GAA TTC AC-3’)을 사용하여 94℃ 에서 1 분, 55C 에서 1분 및 72C 에서 1분으로 30회 PCR 수행하였다. 또, PCR 로 유전자 도입이 확인된 고구마 식물체의 잎에서 식물 DNA 추출 kit 인 PHYTOpureTM (Amer- sham Co.)을 이용하여 genomic DNA를 분리한 후, 약 50 1ug의 DNA 를 제한효소 HindⅢ 로 절단한 후 0.8% agarose 젤에서 전기영동 하였다. 전기영동을 마친 후 젤을 0.
- 반응을 마친 membrane 을 세척용액 (1 M N2HPO4, 1 M NaHPO& 1% SDS, 1 mM Na2-EDTA)으로 세척한 후 X-ray 필름에노출시켰다. 또한, 도입된 외래 유전자의 발현을 보기 위하여 식물체의 잎으로부터 TRIzolTM (GIBCO/BRL, Grand Island, NY, USA)을 이용하여 분리된 약 20 ug의 total RNA 를 5.1% (v/v) formaldehyde 가 포함된 agarose gel 에 전기영동한 후 Zeta-Probe membrane (Bio-Rad) 에 blotting 한 후 Southern 과 동일한 방법으로 northern blot 을 수행하였다. 한편, 수확한 형질전환 고구마 괴근 절편체 (200 mg) 로부터 10 mM DTT 를 포함한 80 mM Hepes buffer (pH 7.
- 을 수행하였다. 락토페린 특이 염기서열 부분 (LactoF: 5’-GGC TCC TGC AAA TTT GAT GA-3’, Lacto R: 5’- TTA CTT CCT GAG GAA TTC AC-3’)을 사용하여 94℃ 에서 1 분, 55C 에서 1분 및 72C 에서 1분으로 30회 PCR 수행하였다. 또, PCR 로 유전자 도입이 확인된 고구마 식물체의 잎에서 식물 DNA 추출 kit 인 PHYTOpureTM (Amer- sham Co.
- 면역강화와 같은 생리활성 기능을 가지는 인체 락토페린 cDNA 가 들어있는 pLSM1 벡터를 이용하여 고구마 배 발생 캘러스에 particle bombardment 방법으로 형질전환을 수행하여 인체 락토페린 생산 고구마를 개발하였다. 선발배지에서 형성된 배발생 캘러스로부터 체세포 배 발생 과정을 거쳐 식물체로 재분화되었고 토양에서 정상적으로 생장하여 괴근을 형성하였다.
- 8% agarose 젤에서 전기영동 하였다. 전기영동을 마친 후 젤을 0.2 NHCl 용액에서 depurination 후 1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH 용액에 담가 30분 동안 변성시키고 이어서 1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl (pH 8.0) 용액에서 30분간 중화시킨 후 10X SSC 용액에서 Zeta-Probe membrane (Bio-Rad) 에 전이하였다 1.0 kb 크기의 EcoRI-BgZII lactoferrin DNA fragment를 random primed DNA labeling kit (Boehringer Mannheim, Germany) 을 사용하여 동위원소 [a-32P]dCTP 로 표지한 후 probe로 사용하여 Southern 분석을 수행하였다. Membrane 을 prehybridization (1 M NazHPOq, 1 M NaHzPOi, 7% SDS, 1 mM Na"EDTA)용액에 넣고 60C에서 2시간 정도 prehybridization 한 후 약 16시간 동안 hybridization 시켰다.
이론/모형
- 국내 품종 고구마 (Ipomoea batatas L. cv. Yulmi)의 정단분열조직 유래 배발생 캘러스 (Liu et al. 1989; Min et al. 1994) 에 인체 모유 유래 락토페린 cDNA 가 들어있는 pLSM1 벡터 (Liu et al. 1999; Min et al. 2006, Fig. 1)를 이용하여 Min 등 (1998, 2006, 2007)의 방법에 따라 텅스텐 입자}에 코팅 (Sanford et al. 1993)한 후 BioRad사의 PDS-1000 /He particle delivery system을 이용하여 6 cm 거리, 1100 psi 에서 particle bombardment 를 수행하였다.
- 선발배지에서 형성된 배발생 캘러스로부터 체세포 배 발생 과정을 거쳐 재분화된 기내 유식물체의 잎으로부터Edwards등 (1991)의 방법으로 genomic DNA를 분리하여 PCR 을 수행하였다. 락토페린 특이 염기서열 부분 (LactoF: 5’-GGC TCC TGC AAA TTT GAT GA-3’, Lacto R: 5’- TTA CTT CCT GAG GAA TTC AC-3’)을 사용하여 94℃ 에서 1 분, 55C 에서 1분 및 72C 에서 1분으로 30회 PCR 수행하였다.
- 1% (v/v) formaldehyde 가 포함된 agarose gel 에 전기영동한 후 Zeta-Probe membrane (Bio-Rad) 에 blotting 한 후 Southern 과 동일한 방법으로 northern blot 을 수행하였다. 한편, 수확한 형질전환 고구마 괴근 절편체 (200 mg) 로부터 10 mM DTT 를 포함한 80 mM Hepes buffer (pH 7.4) 를 이용하여 얼음 위에서 마쇄한 뒤 4C, 10, 000 rpm에서 10분간 2회 원심분리 후 상등액을 취하여 총 단백질을 Bradford (1976) 방법으로 정량하였다. 추출한 20 ug의 단백질을 끓는 물에 denature 시킨 후 10% polyacrylamide gel에서 전기영동 (Laemmli, 1970) 시킨 후 nitrocellulose membrane에 전이하였다 (Towbin et al.
성능/효과
- 2003)에 도입된 락토페린 단백질에서는 80 kDa 이외에 약 40 kDa에 해당하는 truncated된 락토페린이 생산되었다고 보고하였다. Northern 분석 결과에서처럼 락토페린 transcripts의 발현량이 높았던 #1, #4, #6 식물체는 이들로부터 형성된 괴근의 immunoblot 분석 결과에서도 마찬가지로 락토페린 단백질이 다른 라인에 비해 더 많이 생산됨을 보여주었다 (Fig. 6, 7).
- PCR 분석으로 외래 유전자 도입이 확인된 식물체에서 락토페린 probe를 이용하여 Southern 분석을 실시한 결과 형질전환 식물체에서는 약 8 kb 크기의 인체 락토페린 유전자가 고구마 염색체 안에 1 copy 로 삽입되었음을 확인할 수 있었다 (Fig. 5). Particle bombardment 를 이용하여 본 연구자들이 개발한 락토페린 함유 고구마 배양세포 (Min et al.
- 5). Particle bombardment 를 이용하여 본 연구자들이 개발한 락토페린 함유 고구마 배양세포 (Min et al. 2006)에서는 1개 혹은 다수의 밴드를 가지는 형질전환 배양세포를 생산하였는데 본 연구에서 분석된 형질전환 식물체에서는 단일 밴드를 보여줌으로써 이는 동일한 배발생 캘러스에서 유래된 식물체임을 짐작할 수 있었다. 락토페린 유전자의 발현을 확인하기 위해 total RNA 를 분리하여 northern 분석을 수행한 결과 모든 형질전환체에서 2.
- 재분화된 식물체를 대상으로 PCR과 Southern 분석을 실시한 결과 고구마의 염색체 게놈에 인체 락토페린 유전자가 도입되었음을 확인하였다. 또한, northern blot 분석을 통해 락토페린 유전자의 발현을 확인하였으며 immunoblot 분석을 통해 고구마 괴근에서도 80 kDa 크기의 락토페린 단백질이 생산됨을 확인할 수 있었다. 본 연구결과 고구마는 치료용 인체 단백질을 생산하는 숙주로서 매우 우수하다는 것을 입증하였다.
- 2006)에서는 1개 혹은 다수의 밴드를 가지는 형질전환 배양세포를 생산하였는데 본 연구에서 분석된 형질전환 식물체에서는 단일 밴드를 보여줌으로써 이는 동일한 배발생 캘러스에서 유래된 식물체임을 짐작할 수 있었다. 락토페린 유전자의 발현을 확인하기 위해 total RNA 를 분리하여 northern 분석을 수행한 결과 모든 형질전환체에서 2.3 kb 크기의 락토페린 transcripts 가 발현됨을 확인하였다 (Fig. 6). 한편, 형질전환 고구마 괴근 절편 체로부터 총 soluble 단백질을 분리하여 western blot분석을 수행한 결과 형질전환되지 않은 고구마 괴근에서는 전혀 anti-lactoferrin 항체와 반응하지 않았으나 형질전환 괴근에서 약 80 kDa 크기의 락토페린 단백질이 생산됨을 확인하였다 (Fig.
- 또한, northern blot 분석을 통해 락토페린 유전자의 발현을 확인하였으며 immunoblot 분석을 통해 고구마 괴근에서도 80 kDa 크기의 락토페린 단백질이 생산됨을 확인할 수 있었다. 본 연구결과 고구마는 치료용 인체 단백질을 생산하는 숙주로서 매우 우수하다는 것을 입증하였다.
- 선발배지에서 재분화된 고구마 기내 식물체의 잎으로부터 genomic DNA 분리하여 락토페린 프라이머를 이용하여 PCR 을 수행한 결과, 형질전환 되지 않은 개체와는 달리 형질전환된 모든 개체에서 약 700 bp 크기의 락토페린 밴드가 합성됨을 확인할 수 있었다 (데이터 미제시). PCR 분석으로 외래 유전자 도입이 확인된 식물체에서 락토페린 probe를 이용하여 Southern 분석을 실시한 결과 형질전환 식물체에서는 약 8 kb 크기의 인체 락토페린 유전자가 고구마 염색체 안에 1 copy 로 삽입되었음을 확인할 수 있었다 (Fig.
- 선발배지에서 형성된 배발생 캘러스로부터 체세포 배 발생 과정을 거쳐 식물체로 재분화되었고 토양에서 정상적으로 생장하여 괴근을 형성하였다. 재분화된 식물체를 대상으로 PCR과 Southern 분석을 실시한 결과 고구마의 염색체 게놈에 인체 락토페린 유전자가 도입되었음을 확인하였다. 또한, northern blot 분석을 통해 락토페린 유전자의 발현을 확인하였으며 immunoblot 분석을 통해 고구마 괴근에서도 80 kDa 크기의 락토페린 단백질이 생산됨을 확인할 수 있었다.
- 6). 한편, 형질전환 고구마 괴근 절편 체로부터 총 soluble 단백질을 분리하여 western blot분석을 수행한 결과 형질전환되지 않은 고구마 괴근에서는 전혀 anti-lactoferrin 항체와 반응하지 않았으나 형질전환 괴근에서 약 80 kDa 크기의 락토페린 단백질이 생산됨을 확인하였다 (Fig. 7). 이와 같은 결과는 락토페린 유전자가 도입된 감자 (Chong and Langridge 2000)나 약용식물인 가시오갈피 (Jo et al.
후속연구
- 3). 또한, 형질전환 되지 않은 대조구 고구마보다 형질전환락토페린 고구마의 표피가 약간 진한 색을 띠었는데 (Fig. 4) 이는 고구마 표피 세포내의 락토페린 단백질이 대조 구보다 더 많은 철을 흡수해서 나타나는 현상인지 좀 더 연구해 볼 필요가 있다. 또한, 형질전환된 락토페린 고구마가 형질전환되지 않은 대조구에 비해 훨씬 건전한 괴근을 생산하였는데 (Fig.
- 4) 이는 고구마 표피 세포내의 락토페린 단백질이 대조 구보다 더 많은 철을 흡수해서 나타나는 현상인지 좀 더 연구해 볼 필요가 있다. 또한, 형질전환된 락토페린 고구마가 형질전환되지 않은 대조구에 비해 훨씬 건전한 괴근을 생산하였는데 (Fig. 4) 이는 락토페린 유전자가 도입된 고구마 괴근에서 특정 pathogen 에 대해 저항성을 가지고 있음을 추측할 수 있으므로 보다 구체적인 실험이 요구된다.
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