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문제 정의
- 본 연구에서는 흑목이 버섯 유래의 기능성 제품화 연구의 일환으로 지금까지 체계적으로 연구된 바 없는 흑목이 버섯의 다당을 열수추출하여 정제하였고, 흰목이 버섯 다당과 비교하면서 구성당, 분자량 및 구조적 특성을 규명함으로써 기능성 소재화의 기초자료를 마련하고자 하였다.
제안 방법
- 추출액을 12,000 × g에서 20분 간 원심분리 (Super 25K, Hanil Science Industrial Co., Ltd., Korea)하였으며, 상등액을 회전진공농축기 (Eyela Co., N-N Series, Japan)로 70℃에서 1/3 정도로 농축하였다.
- 1에서와 같이 추출하였다. 즉, 건조 분말 (100 mesh) 시료 50 g을 증류수 1 L가 담긴 추출용기에 넣고 항온수조에서 95℃로 4시간 동안 3회 환류 추출하였다. 추출액을 12,000 × g에서 20분 간 원심분리 (Super 25K, Hanil Science Industrial Co.
- Ltd, Korea, 순도 95%)을 가한 다음 침전물 또는 spatular로 휘저어 감기는 gel-like 물질을 얻었다. 여기에 다시 5배량의 증류수를 첨가하고 녹인 다음, 동결 건조 (Ilshin Lab. Co., Korea, 0.5 torr, 24 h)하여 조 다당 (crude polysaccharide) 시료로 하였다. 한편, 조다당 시료는 증류수에 용해하여 2일간 투석 (Sigma Co.
- 총 다당 함량의 측정：시료의 총 다당 함량은 전당 함량과 환원당 함량의 차이로부터 계산하였다. 전당 함량은 PhenolSulfuric acid 법 [15]으로 분광광도계 (Spectrophotometer, Genesis 5, Milton ray, USA)를 이용하여 490 nm에서의 흡광도를 측정하였고, 환원당 함량은 DNS 법 [16]에 의해 발색한 후 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
- 30% assay)를 첨가한 후, vortexing하여 혼합하였다. 이 혼합물을 실온에서 30분간 방치한 후, 분광광도계 (Spectrophotometer, Milton Roy, Genesys 5, USA)를 이용하여 750 nm에서의 흡광도를 측정하였으며, albumin (Sigma Co.)을 이용한 표준곡선으로부터 단백질 함량을 구하였다.
- 즉, 400 μL의 시료를 1회용 유리 배양관에 옮기고, 각 관에 4 mL Congo red (sodium 4,4'-diphenyl-2,2'-diazo-bis-1-naphthalamino4-sulonate (Showa Chemicals Inc., Japan) 시약을 첨가한 후 vortexing하여 혼합하였다.
- 분쇄한 건조 자실체의 열수 추출물을 에탄올로 재추출하여 조 다당 분획을 얻었으며, 이를 증류수에 용해한 후 다시 투석 (MWCO = 12,000∼14,000 Da.)하고, 동결건조하여 부분 정제 다당을 얻었다 (Fig. 1).
- 5 mL을 가하여 충분히 혼합하였다. 여기에 10% FolinCiocalteu 시약 (Wako Chemical Co.) 1.5 mL를 가하여 상온에서 30분 동안 방치하고 분광광도계 (Spectrophotometer, Milton Roy, Genesys 5, USA)로 765 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량은 gallic acid (Kanto Chemical Co.
- 5 mL를 가하여 상온에서 30분 동안 방치하고 분광광도계 (Spectrophotometer, Milton Roy, Genesys 5, USA)로 765 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 총 페놀 함량은 gallic acid (Kanto Chemical Co. Inc., Japan)에 의한 표준곡선을 이용하여 산출하였다.
- 구성당의 분석：시료 다당의 구성당 조성비는 HPLC (Bio-LCM Dionex Co.)를 사용하여 다음과 같이 구하였다. 즉, 시료 3 mg을 1.
- 분자량 분포는 GPC system (Breeze, Waters, USA)을 사용하여 수행하였다. Column은 Waters Ultrahydrogel linear 2개, Ultrahydrogel 500, 250 및 120을 사용하였고 온도는 25℃, flow rate는 0.
- Detection은 25℃에서 RI detector를 사용하였다. Column calibration은 pullulan (Shodex standard P-82)의 각종 분자량 표준품을 사용하여 수행하였다.
- FT-IR (Fourier transformed infra red) 스펙트럼은 시료 2 mg을 함유한 KBr disc를 조제하고 3 cm-1의 해상도로 Bio-Rad Model Excaliber (Cambridge, USA) 기기를 사용하여 얻었다. 알로에 표준 다당 및 흰목이 버섯 다당을 비교 표준 시료로 사용하였으며, 흰목이 버섯 다당은 시료와 동일한 방법으로 직접 조제하여 사용하였다 (Fig.
- 시료의 분자량 특성을 알아보기 위하여 부분 정제된 시료 다당과 비교구인 흰목이 버섯 다당을 GPC system에서 겔여과하였으며, 그 결과는 Fig. 4와 같다.
- 부분 정제 다당의 성분 및 구조에 대한 지견을 얻기 위해 1H NMR 스펙트럼을 조사하였으며, 그 결과는 Fig. 5와 같다.
- Ebarandu 등 [19]은 glucomannan의 정량을 위한 정량적이고도 신속한 비색법을 보고 한 바 있는데, 이 방법은 β-1,4 결합의 mannan에 특이적인 방법이다. 따라서 이 방법으로 그 함량을 알로에의 표준 다당을 참조구로 하여, 흑목이 버섯 다당의 함량을 흰목이 버섯 다당과 함께 비교, 측정하였으며, 그 결과는 Fig. 6과 같다.
- 흑목이 버섯 자실체로부터 열수추출, 에탄올 침전 및 투석에 의해 정제 다당을 얻었다. 14.
대상 데이터
- 본 연구의 재료는 중국 길림성 산의 건조한 흑목이 버섯이며, 중국에서 직접 구입한 것을 (주)화인코로부터 제공받아 사용하였다. 건조 시료는 분쇄기 (Hanil Co.
- 본 연구의 재료는 중국 길림성 산의 건조한 흑목이 버섯이며, 중국에서 직접 구입한 것을 (주)화인코로부터 제공받아 사용하였다. 건조 시료는 분쇄기 (Hanil Co., HMF-390, Korea)로 분쇄하여 분말 (100 mesh)화하였고, desiccator에서 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 흑목이 버섯의 조다당은 흑목이 버섯 건조분말을 시료로 하여 Fig. 1에서와 같이 추출하였다. 즉, 건조 분말 (100 mesh) 시료 50 g을 증류수 1 L가 담긴 추출용기에 넣고 항온수조에서 95℃로 4시간 동안 3회 환류 추출하였다.
- 5 torr, 24 h)하여 조 다당 (crude polysaccharide) 시료로 하였다. 한편, 조다당 시료는 증류수에 용해하여 2일간 투석 (Sigma Co., M.W.C.O. 12,000) 하였고, 이를 동결건조하여 정제 다당 (purified polysaccharide) 시료로 사용하였다. 모든 시료는 desiccator에 보관하면서 실험에 사용하였다.
- 표준물질로는 glucose, mannose 및 fucose (Sigma Co.)를 사용하였으며, column은 CarboPacTM PA10, injection volume 10 μL 온도는 실온, flow rate 0.9 mL/min이었으며, 검출기는 PAD (Pulsed amperometric detector), 용매는 8 mM NaOH를 사용하였다.
- 분자량 분포는 GPC system (Breeze, Waters, USA)을 사용하여 수행하였다. Column은 Waters Ultrahydrogel linear 2개, Ultrahydrogel 500, 250 및 120을 사용하였고 온도는 25℃, flow rate는 0.8 mL/min이었으며, 용매는 0.02N NaNO3 (Merck)를 사용하였다. Detection은 25℃에서 RI detector를 사용하였다.
- 의 해상도로 Bio-Rad Model Excaliber (Cambridge, USA) 기기를 사용하여 얻었다. 알로에 표준 다당 및 흰목이 버섯 다당을 비교 표준 시료로 사용하였으며, 흰목이 버섯 다당은 시료와 동일한 방법으로 직접 조제하여 사용하였다 (Fig. 1 참조).
- 시료의 NMR (600 MHz) 스펙트럼은 실온에서 Bruker Model Avance 600 (Germany) spectrometer를 사용하여 얻었다. 이때, 시료는 10 mg을 0.7 mL D2O로 용해하였고, 알로에 표준 다당 및 흰목이 버섯 다당을 비교표준 시료로 사용하였다.
이론/모형
- 총 다당 함량의 측정：시료의 총 다당 함량은 전당 함량과 환원당 함량의 차이로부터 계산하였다. 전당 함량은 PhenolSulfuric acid 법 [15]으로 분광광도계 (Spectrophotometer, Genesis 5, Milton ray, USA)를 이용하여 490 nm에서의 흡광도를 측정하였고, 환원당 함량은 DNS 법 [16]에 의해 발색한 후 570 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 이때, 각각의 전당 및 환원당 함량은 glucose (Sigma Co.
- 단백질함량의 측정：시료의 단백질 함량은 Lowry [17]에 따라 아미노산과 구리이온의 아마이드 결합에 의한 환원정도를 측정하였다. 0.
- 총 폴리페놀함량의 측정：시료의 총 페놀 함량은 FolinCiocalteu 방법 [18]에 따라 측정하였다. 10 mg/mL 농도로 시료 용액을 제조한 후, 시료용액 50 μL에 7.
- Glucomannan 함량의 측정：Glucomannan의 함량은 Ebarandu 등 [19]의 비색법에 따라 측정하였다. 즉, 400 μL의 시료를 1회용 유리 배양관에 옮기고, 각 관에 4 mL Congo red (sodium 4,4'-diphenyl-2,2'-diazo-bis-1-naphthalamino4-sulonate (Showa Chemicals Inc.
성능/효과
- 하지만 색택과 관련되는 것으로 예측되는 총 폴리페놀은 조 다당에서 0.92 ± 0.04%로 나타난 반면, 부분정제 다당에서는 1.36 ± 0.06%로 조 다당 분획보다 더 높은 함량을 나타내었다.
- 총 다당의 함량은 조 다당 (46.27 ± 0.56%)보다 부분정제 다당 (76.47 ± 0.90%)에서 높은 다당 함량을 보였다.
- 8%의 수율을 보였다. 이들 다당은 흑갈색 분말로, 수용성이었으며, 매우 높은 점성을 나타내었고, 정제 다당의 흑갈색 색택강도는 조다당 분획보다 더 짙어지는 특징을 보였다.
- 07%로 낮아졌다. 따라서 투석 (MWCO; 12,000)처리에 의해 저분자 당이나 단백질이 투석되어 빠져나가 정제됨을 보였다. 하지만 색택과 관련되는 것으로 예측되는 총 폴리페놀은 조 다당에서 0.
- 구성당의 비를 알아보기 위해 Bio-LC chromatogram 상의 각 당의 peak의 면적을 구하여 구성당의 비율로 나타내었으며, 그 결과는 Table 2와 같다. 시료는 Glucose：mannose = 16.82：83.18으로 glucomannan의 특성을 보였으며, 흰목이 버섯 다당은 Glucose：mannose：fucose = 2.78：73.43：23.79으로 나타났다.
- 흑목이 버섯으로부터 부분정제된 다당 (1%, w/v)의 glucomannan 함량은 알로에 표준 다당의 약 80% 수준 (1,040∼1,070 mg/L)인 반면, 흰목이 버섯의 경우에는 약 50% 수준 (810∼840)을 보여 흑목이 다당의 glucomannan 함량이 약 1.2배 정도 더 높은 것으로 나타났다.
- 역시 Fig. 4의 box 안쪽에서 볼 수 있는 바와 같이, 표준 시료 (pullulan)를 사용하여 표준곡선을 작성하고 peak B 분획의 분자량을 조사한 결과, 시료 다당 분획의 Mn = 339.4 kDa, Mw = 438.8 kDa이었고, 이 때의 분산성은 polydispersity = 1.29의 다분산성을 나타내었다. 반면, 흰목이 버섯 다당은 B peak 분획에서 Mn = 352.
- 2배 정도 더 높은 것으로 나타났다. 따라서 흑목이 버섯의 열수 추출 다당은 알로에 베라 다당과 유사한 다당으로 알로에 대체 다당으로서의 역할을 기대할 수 있다고 판단되었다.
- 14.8% (w/w)의 정제 다당을 얻었으며, 구성 성분은 총 다당 함량이 76.47 ± 0.90%, 단백질 함량이 8.23 ± 0.07% 및 총 폴리페놀 함량이 1.36 ± 0.06% 이었다.
- 06% 이었다. FT-IR 스펙트럼 분석 결과, 전형적인 다당류 특성을 보이며, 흑목이 및 흰목이 버섯 다당은 서로 동일한 흡수 peak 값을 보여 구조적으로 유사한 것으로 생각되었다. HPLC를 이용한 구성당 분석에서는 흑목이 버섯 다당은 Glucose：mannose = 16.
- FT-IR 스펙트럼 분석 결과, 전형적인 다당류 특성을 보이며, 흑목이 및 흰목이 버섯 다당은 서로 동일한 흡수 peak 값을 보여 구조적으로 유사한 것으로 생각되었다. HPLC를 이용한 구성당 분석에서는 흑목이 버섯 다당은 Glucose：mannose = 16.8：83.2로 glucomannan의 특성을보였으며, GPC system에 의한 분자량 및 다분산성은 439 kD 및 1.29이었다. 1NMR 스펙트럼을 살펴본 결과, 참조구로 사용된 알로에 표준 다당과 동일한 acetylated glucomannan의 peak (2.
- 29이었다. 1NMR 스펙트럼을 살펴본 결과, 참조구로 사용된 알로에 표준 다당과 동일한 acetylated glucomannan의 peak (2.0 ppm)를 나타내었다. 비교구인 흰목이 버섯다당도 동일한 peak를 보였으며, 유효다당으로 glucomannan 을 정량한 결과, 알로에 표준 다당의 약 80% 함량을 나타내었다.
- 0 ppm)를 나타내었다. 비교구인 흰목이 버섯다당도 동일한 peak를 보였으며, 유효다당으로 glucomannan 을 정량한 결과, 알로에 표준 다당의 약 80% 함량을 나타내었다. 따라서 시료 다당은 알로에와 유사한 β-(1-4)-mannan의 구조를 지니는 것으로 생각되었다.
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