[논문]창이자 추출물이 아토피 피부염 유발 생쥐의 비장 세포 Th17의 세포분화 억제에 따른 아토피 피부 상태에 미치는 영향

김금란; 최태부

[국내논문] 창이자 추출물이 아토피 피부염 유발 생쥐의 비장 세포 Th17의 세포분화 억제에 따른 아토피 피부 상태에 미치는 영향
Studies of Xanthium strumarium Extract Suppressing Th17-cell Differentiation and Anti-dermatitic Effect in BMAC-induced Atopy Dermatitis of NC/Nga Mice 원문보기

KSBB Journal, v.24 no.4, 2009년, pp.383 - 392

김금란 (건국대학교 대학원 생물공학과) , 최태부 (건국대학교 대학원 생물공학과)

초록
AI-Helper

아토피피부염 (AD)은 천식, 음식 알레르기, 비염 같은 전신아토피질환을 동반하는 만성재발성 피부염증질환이다. 아토피피부염과 관련된 IL-17의 임상적 역할은 다양한 조건에서 보고되고 있으며, 또한 건선 피부 상태에 깊숙이 관여하고 있다. IL-17은 각질세포 (keratinocytes)에서 과잉으로 생산되며, 아토피피부염의 말초임파구에서도 다량 생성됨을 세포내염색을 통하여 확인된 바 있다. 본 연구에서는 창이자 추출물 (XS-E와 XS-FL)이 NC/Nga 생쥐의 $CD4^+$ T 세포에서 유도된 Th17 세포의 분화억제 및 IL-17의 생산량 감소 효과에 대한 실험을 하였다. 그 결과 XS-E와 XS-FL을 처리한 섬유아세포에서 세포독성은 나타나지 않았고, 4일간 XS-E와 XS-FL에 동시배양 한 $CD4^+$ T 세포의 IL-17 생산량을 FACS로 분석한 결과 $100\;{\mu}g$/mL XS-E 처리군의 IL-17 생산량은 32.3%로 대조군에 비하여 2배 이상의 감소를 나타내었으며, $20\;{\mu}g$/mL XS-30% AFL (acetone XS-FL) 처리군의 Th17 세포는 19.6%으로 대조군에 비하여 3.5배 억제되었다. 또한 real-time PCR을 이용하여 IL-17A와 IL-22 mRNA의 유전자 발현량을 비교 분석한 결과, IL-17A와 IL-22 mRNA의 유전자발현의 RQ값은 XS-E와 XS-30% AFL를 처리한 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었다(p < 0.01, p < 0.001). ELISA로 측정한 IL-17A 생산량은 XS-E와 XS-30% AFL를 처리한 실험군이 대조군에 비하여 현저히 감소 (p < 0.05, p < 0.001)하였다. Th17 세포의 증식을 알아보기 위하여, rIL-6와 TGF-$\beta$로 분화시킨 Th17 세포를 CFSE로 표지한 후 rIL-23 처리를 하여 4일간 배양하여 증식을 유도시켰다. 대조군의 Th17 세포 분열은4일 동안 4번에 걸쳐 비슷한 세포수의 증식이 일어나는 것을 CFSE를 통하여 확인하였고, XS-30% AFL 처리군은 CFSE의 형광 분포가 점점 감소하여 Th17 세포의 증식이 억제됨을 알 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Xanthii fructus which is well known as "Chang-ihjah" in Korea is the dried fruit of Xanthium strumarium L. (or Xanthium sibiricum PATR. Ex WIDD., Asteraceae. XS). Water extract of this fruit has been used for treatment of various inflammatory diseases such as tympanitis, allergic rhinitis, or ozena as alternative therapy material usually by oral administration in far Eastern countries including Korea. In this study, the effect of XS extract (XS-E) or XS-30% acetone fraction layer (XS-30% AFL) on the differentiation of $CD4^+$ T cells isolated from NC/Nga mouse and the production of IL-17 was investigated. The experimental results showed that $100\;{\mu}g$/mL of XS-E could decrease the production of IL-17 by $CD4^+$ Th17 cells by 2 fold and only $20\;{\mu}g$/mL of XS-30% AFL could inhibit 3.5 fold. The amount of IL-17A and IL-22 mRNA determined by real-time PCR was decreased remarkably when XS-E or XS-30% AFL was treated on $CD4^+$ Th17 cells(p<0.01, p<0.001). The amount of IL-17A protein determined by ELISA was also decreased remarkably(p<0.05, p<0.001). To study the effect of XS-E or XS-30% AFL on the proliferation of Th17 cells, $CD4^+$ T cells of a NC/Nga mouse was firstly differentiated by rIL-6/TGF-$\beta$ and then stimulated by rIL-23. The control group of Th17 cells were doubled every each day, while those of XS-E or XS-30% AFL treated group were shown to be delayed remarkably by these extracts. In conclusion, XS can inhibit the differentiation of Th17 cells of NC/Nga mouse and the production of IL-17 successfully, which may be a beneficial result for the treatment of atopic skin dermatitis.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 창이자 추출물 (XS-E)과 창이자 분획 (XS-FL)이 아토피 피부君환의 동물로 알려진 아토피 피부염 유발 생쥐 (atopy dermatitis-like skin NC/Nga mice, NC/Nga)(28, 29)의 Thl7 세포 분화 억제에 따른 아토피 피부 상태에 미치는 영향을 실험적으로 규명하고자 하였다. 동물모델인 16 주령 NC/Nga의 비장을 적출하여 C*T D4 세포를 회수 하였다 회수 된 CD4+T세포에 XS-E와 XS-30% AFL에 대한 알레르기 반응을 IL-17의 세포 내 염색을 통하여 FACS로 분석하였다(30, 31).
IL・17은 각질세포 (kenitinGcytes) 에서 과잉으로 생산되며, 아토피피부염의 말초임파구에서도 다량 생성됨을 세포내 염색을 통하여 확인된 너卜 있다. 본 연구에서는 창이자 추출물 (XS・E오} XS-FL)이 NC/Nga 생쥐의 CD4+ T 세포에서 유도된 Thl7 세포의 분화억제 및 ILJ7의 생산량 감소 효과에 대한 실험을 하였다. 그 결과 XS・E와 XS・FL을 처리한 섬유아세포에서 세포독성은 나타나지 않았고, 4일간 XS-E오} XS.
XS-E보다 유의성이 크게 나온 XS-30% AFL이 Thl7 세포의 분화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester)로 표지 된 Thl7 세포(33)를 rIL-23으로 증식시킨 후 FACS로 분석하였다(34). 실험을 통하여 XS-30% AFL이 Thl7 세포의 분화 억제효과로 아토피 피부의 상태 개선에 영향을 준다는 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
있다(17). 아토피 피부염에 대한 안전하면서도 우수한 효능을 가진 새로운 치료제의 개발이 요구되고 있으며(18, 19), 이에 본 연구에서는 자료검색을 통하여 부작용이 없으며 장기간 복용이 가능한 천연물로 창이자 (Xanthii fructus, XS-E, XS-FL)가 아토피 피부의 상태에 미치는 효과를 알아보고자 하였다.

제안 방법

Thl7 세포 분화유도를 위하여 rIL-6 (20 ng/mL), TGF-p (2 ng/mL), anti-IL-4 (1 ng/mL), 그리고 anti-IFN-y (2 ng/ mLm)를 처리하였고, 4일 후 Thl7 세포 내 염색을 위하여, 실험 종료 4시간 전에 PMA (30 ng/mL), ionomycin (500 ng/mL), 그리고 monensin (1 卩g/mL)을 배양세포에 처리하였다. 4시간 배양 종료 후 BD G* olgiStop 의 방법에 따라 FITC-anti-mouse CD4과 PE-anti-mouse IL-17을 염색하였다. 유세포형광분석은 FACS calibur와 Cell Quest software를 사용하였다(43, 44).
CFSE는 FACS calibur의 green fluorescence (CFSE, 525 nm band pass filter)에서 측정하였고, 분석은 Cell Quest software (BD Biosciences)를 사용하였다(47, 48).
001). ELISA로 측정한 IL-17A 생산량은 XS・E와 XS-30% AFL를 처리한 실험군이 대조군에 비하여 현저히 감소 (p < 0.05, p < 0.001)하였다 Thl7 세포의 증식을 알아보기 위하여, HL・6와 TGF书로 분화시킨 Thl7 세포를 CFSE로 표지한후 rIL-23 처리를 하여 4일간 배양하여 증식을 유도시켰다 대조군의 Thl7 세포 분열은 4일 동안 4번에 걸쳐 비슷한 세포수의 증식이 일어나는 것을 CFSE를 통하여 확인하였고, XS-30% AFL 처리군은 CFSE의 형광 분포가 점점 감소하여 Thl7 세포의 증식이 억제됨을 알 수 있었다.
이 세포를 Magnetic column (CS column, Miltenyi Biotech)을 PBS로 세척하여 준비해 둔 Vario MACS (Miltenyi Biotech)에 장치하였다. Magnetic bead가 표지 된 세포를 통과시키고 PBS로 column을 충분히 세척한 다음 column을 통과한 부유액을 원심분리하여 lineage 음성인 T 세포를 모았다(42).
같다. Mouse glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH)의 probe는 CATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG (VIC) 이며 (probe; Applied Bio system), Super-Taqman PCR Master mix (ABI)를 사용하였고, primer의 최종농도가 200 nM이 되게 반응시켰다. Real time quantitative PCR의 조건으로는 pR・denaturatioii은 50°C 에서 2분, 94°C 에서 10분, 그리고 40 cycles을 95°C에서 15분, 60°C에서 1분 수행하였다.
NC/Nga 생쥐 비장을 적출한 후 100 mesh에서 분쇄하여 비장세포를 추출하였다. 추출한 비장세포를 2, 000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수하였다.
NC/Nga 생쥐에서 분리한 CD4+ T 세포를 Thl7 세포로 4일간 분화시킨 후 배양상층액에서 IL-17A (KMC 3021, BioSource, USA)의 생산량을 측정하였다. 배양상증액 내의 IL-17A의 농도 즉정은 enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) kit로 측정하였다.
Mouse glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (G3PDH)의 probe는 CATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG (VIC) 이며 (probe; Applied Bio system), Super-Taqman PCR Master mix (ABI)를 사용하였고, primer의 최종농도가 200 nM이 되게 반응시켰다. Real time quantitative PCR의 조건으로는 pR・denaturatioii은 50°C 에서 2분, 94°C 에서 10분, 그리고 40 cycles을 95°C에서 15분, 60°C에서 1분 수행하였다. XS오} XS-30% AFL 처리군과 대조군은 internal standard로 G3PDH를 시'용하여 target group의 Quantitative real-time RT-PCR의 RQ (relative quantitative) 값은 Housseau 등(46)과 같은 공식에 의하여 측정하였다.
또한 추출한 비장세포를 2%의 FBS가 함유된 PBS (FBS/PBS)에 1 x l()8/mL로 현탁시키고 normal rat serum을 5% 되게 첨가하여 4°C 에서 15분 동안 blocking 하였다. T 세포는 biotinylated antibody cocktail for lineage(41) (CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123, TCR y/6, CD235a, glycophorin A., CD4+ T Cell Isolation Kit, Miltenyi Biotec)에 각각 4°C에서 15분간 반응시켜 분리하였다. 분리한 세포를 FBS/PBS로 세척하여 1 X 108/mLS 현탁하였고 100 卩L의 streptavidin-microbead을 가하여 다시 4 °C 에서 10분간 반응시켰다.
방치 후 2회수세하여 완충용액으로 세척한 다음 antibody Avidin-HRP conjugated 100 jiL를 처리하였고, 1시간 후 실온에서다시 세척하였다. TMB 기질을 100씩 분주하고 암소에서 30분간 방치하였다. 이것을 100 卩L의 stop 용액에 처리한 다음 ELISA reader 450 nm에서 흡광도를 측정하였다(45).
卩g/mL)과 4일 동안 동시배양 하였다. Thl7 세포 분화유도를 위하여 rIL-6 (20 ng/mL), TGF-p (2 ng/mL), anti-IL-4 (1 ng/mL), 그리고 anti-IFN-y (2 ng/ mLm)를 처리하였고, 4일 후 Thl7 세포 내 염색을 위하여, 실험 종료 4시간 전에 PMA (30 ng/mL), ionomycin (500 ng/mL), 그리고 monensin (1 卩g/mL)을 배양세포에 처리하였다. 4시간 배양 종료 후 BD G* olgiStop 의 방법에 따라 FITC-anti-mouse CD4과 PE-anti-mouse IL-17을 염색하였다.
昭/mL을 4일 동안 동시배양 하였다. Thl7 세포 분화유도를 위하여 rIL-6 (20 ng/mL, R&D system), TGF-P (2 ng/mL, R&D system), anti-IL-4 (1 ng/mL, R&D system), 그리고 anti-IFN-y (2 ng/mL, R&D system)를 처리하였고, 4일 후 세포에 RNAzolB 500 吐를 넣고 용해될 때까지 분쇄하였다 이 혼합 부유액에 chloroform (CHCI3) 50 卩L 를 첨가한 후 15초 동안 다시 혼합하였다 이를 얼음에 15분간 방치한 후 13, 000 rpm에서 원심분리하였다. 원심분리한 약 200 卩L의 상층액을 회수하여 2-propanol 200 mL와 동량 혼합하고 천천히 흔든 후 얼음에 15분간 방치하였다.
또한 Real-time PCR을 이용하여 IL-17과 IL-22 mRNA 및 ELISA를 분석하였으며(32). XS-E보다 유의성이 크게 나온 XS-30% AFL이 Thl7 세포의 분화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester)로 표지 된 Thl7 세포(33)를 rIL-23으로 증식시킨 후 FACS로 분석하였다(34). 실험을 통하여 XS-30% AFL이 Thl7 세포의 분화 억제효과로 아토피 피부의 상태 개선에 영향을 준다는 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
본 실험에서 사용된 섬유아세포는 일반적으로 세포독성 판정에 있어서 기준이 되는 정상세포로 세포의 성장, 분열, 약물에 대한 반응이 최소한으로 조절되는 세포로 알려져 있다(50). 그러나 본 실험에 사용된 NC/Nga 생쥐의 T 세포오} B 세포는 약물에 대한 반응이 세포분열, 사이토카인의 자가분비 및 타가분비 등이 다양하게 나타나 세포독성 측정 에 적합하지 않아 hFCs로 대체하여 실험을 하였다. XS-E와 XS-FL은 세포독성을 측정한 결과 실험범위 내 농도인 100 卩g/mL 이하에서는 세포생존도 85% 이상.
하였다. 동물모델인 16 주령 NC/Nga의 비장을 적출하여 C*T D4 세포를 회수 하였다 회수 된 CD4+T세포에 XS-E와 XS-30% AFL에 대한 알레르기 반응을 IL-17의 세포 내 염색을 통하여 FACS로 분석하였다(30, 31). 또한 Real-time PCR을 이용하여 IL-17과 IL-22 mRNA 및 ELISA를 분석하였으며(32).
동물모델인 16 주령 NC/Nga의 비장을 적출하여 C*T D4 세포를 회수 하였다 회수 된 CD4+T세포에 XS-E와 XS-30% AFL에 대한 알레르기 반응을 IL-17의 세포 내 염색을 통하여 FACS로 분석하였다(30, 31). 또한 Real-time PCR을 이용하여 IL-17과 IL-22 mRNA 및 ELISA를 분석하였으며(32). XS-E보다 유의성이 크게 나온 XS-30% AFL이 Thl7 세포의 분화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 CFSE (Carboxyfluorescein succinimidyl ester)로 표지 된 Thl7 세포(33)를 rIL-23으로 증식시킨 후 FACS로 분석하였다(34).
1 mM EDTA)에 5분 동안 처리하여 적혈구를 제거 하였다. 또한 추출한 비장세포를 2%의 FBS가 함유된 PBS (FBS/PBS)에 1 x l()8/mL로 현탁시키고 normal rat serum을 5% 되게 첨가하여 4°C 에서 15분 동안 blocking 하였다. T 세포는 biotinylated antibody cocktail for lineage(41) (CD8, CD14, CD16, CD19, CD36, CD56, CD123, TCR y/6, CD235a, glycophorin A.
이렇듯 최근 집중되는 많은 분자들이 자가면역 염증 치료에 대한 치료빙법적인 목표가 IL-23/Th 17 axis와 연관되어 있다는 점은 주목할 만하다(57, 58). 본 실험에서는 NC/Nga 생쥐의 CD4+ T 세포를 Th-17 세포로 분화시켰고, 분화과정 중 XS-E와 XS-FL의 억제효과를 관찰하였다(Fig 2).
이 과정을 3회 반복하여 진탕, 추출하였다. 분액깔때기에서 분획하여 n-Hexane층과 40% methanol로 분취한 후 감압 농축하여 n-Hexane 추출물은 따로 보관하였다 남은 40% methanol을 감압 농축하여 용매를 완전히제거한 후에, Diaion HP-20 (Sigma-Aldrich) 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 준비된 Diaion HP-20 수지 column 에 40% methanol 추출물 100 g을 부어 그 폭이약 25~30cm 될 정도로 방치하였다.
비장의 CD4+ T 세포를 순수분리한 후 미리 anti-CD3/ CD28 coating (1 pig/mL)한 24 well plate에 창이자 추출물 (100 胞/mL)과 창이자 분획 (30% methanol 층 70% methanol 층, 30% acetone 층, 70% acetone 층, 각각 20 卩g/mL)과 4일 동안 동시배양 하였다. Thl7 세포 분화유도를 위하여 rIL-6 (20 ng/mL), TGF-p (2 ng/mL), anti-IL-4 (1 ng/mL), 그리고 anti-IFN-y (2 ng/ mLm)를 처리하였고, 4일 후 Thl7 세포 내 염색을 위하여, 실험 종료 4시간 전에 PMA (30 ng/mL), ionomycin (500 ng/mL), 그리고 monensin (1 卩g/mL)을 배양세포에 처리하였다.
세포독성 측정은 SRB (Sulforhodamine B) assay(39) 법을 약간 변형하여 실험에 사용하였다. hFCs 세포는 37°C 5% C6배양기에서 1시간 배양한 후 XS-E (최종 농도 5 ng/mL, 10 fxg/mL, 50 ng/mL, 100 昭/mL, 200 Rg/mL)과 각각의 XS-FL (최종 농도 5 pig/mL, 10 jig/mL, 50 gg/mL, 100 pig/mL, 200 此/mL)을 48시간 동안 처리하였다.
아토피 피부염을 유발하기 위한 감작 및 유발 실험은 16주령 체중 20±2 g의 NC/Nga생쥐(40)를 대상으로 Vestergaard 등(28)의 방법을 수정하旧 실행하였다. NC/Nga 생쥐 비장을 적출한 후 100 mesh에서 분쇄하여 비장세포를 추출하였다.
준비된 Diaion HP-20 수지 column 에 40% methanol 추출물 100 g을 부어 그 폭이약 25~30cm 될 정도로 방치하였다. 이 과정을 거친 후 증류수 1, 000 mL를 부어 Diaion HP-20 수지를 통과한 pass층 분리(37, 38)하였고 (XS-E), 30% methanol 500 mL 층 (XS-30% MFL), 70% methanol 500 mL 층 (XS-70% MFL), 30% acetone 500 mL 층 (XS-30% AFL), 70% acetone 500 mL 층 (XS-70% AFL)을 각각 통과시켜 분리된 분획을 얻었다.
저해한다. 창이자 추출물을 컬럼 크로마토그래피를 실시하여, XS-E와 XS-FL 분획을 얻은 후 이들이 정상세포에 미치는 영향을 SRB법으로 측정하여 세포 내 안정성 여부를 관찰하였다(49). 본 실험에서 사용된 섬유아세포는 일반적으로 세포독성 판정에 있어서 기준이 되는 정상세포로 세포의 성장, 분열, 약물에 대한 반응이 최소한으로 조절되는 세포로 알려져 있다(50).
추출한 비장세포를 2, 000 rpm에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 실온에서 ACK 용액 (8.3 g NH₄C₁, 1 g KHCO₃, 1 L demineralized water, 0.1 mM EDTA)에 5분 동안 처리하여 적혈구를 제거 하였다. 또한 추출한 비장세포를 2%의 FBS가 함유된 PBS (FBS/PBS)에 1 x l()8/mL로 현탁시키고 normal rat serum을 5% 되게 첨가하여 4°C 에서 15분 동안 blocking 하였다.

대상 데이터

NC/Nga생쥐에서 비장을 적출한 후에 비장 CD4+ T 세포를 순수 분리하여 미리 anti-CD3/CD28 coating (1 ng/mL) 한 24 well plate에 XS-E (100 昭/mL)과 XS-30% AFL 20 昭/mL을 4일 동안 동시배양 하였다. Thl7 세포 분화유도를 위하여 rIL-6 (20 ng/mL, R&D system), TGF-P (2 ng/mL, R&D system), anti-IL-4 (1 ng/mL, R&D system), 그리고 anti-IFN-y (2 ng/mL, R&D system)를 처리하였고, 4일 후 세포에 RNAzolB 500 吐를 넣고 용해될 때까지 분쇄하였다 이 혼합 부유액에 chloroform (CHCI3) 50 卩L 를 첨가한 후 15초 동안 다시 혼합하였다 이를 얼음에 15분간 방치한 후 13, 000 rpm에서 원심분리하였다.
본 실험에 사용된 시약은 다음과 같다. Phorbol myristate acetate (PMA), ionomycin, diethylpyrocarbonate (DEPC), chloroform, collagenase, RPMI-1640 배양액, isopropanol, 적혈구 용혈액 (RBC lysis solution), dulbecco's phosphate buffered saline (D-PBS), magnesium chloride는 Sigma사 (U.S.A.), 우태아혈청 (fetal bovine serum, FBS)는 Hyckme사 (Logan, U.S.A.), anti-CD3-PE (phycoerythrin), anti-CD4-FITC (fluorescein isothiocyanate), anti-Grl-PE, anti-CD8-FITC, anti-CD19-PE, anti-CD23-FITC, anti-CDllb-FITC, anti-IgE-HTC, anti-B220-PE, anti-CD69-FITC, anti-IL17-PE는 Pharmingen사 (Torreyana, U.S.A.), monensin (GolgiStop™) 은 BD Biosciences사에서 구입하였고 기타 일반 시약은 특급 시약을 구입 사용하였다.
창이자 추출물을 컬럼 크로마토그래피를 실시하여, XS-E와 XS-FL 분획을 얻은 후 이들이 정상세포에 미치는 영향을 SRB법으로 측정하여 세포 내 안정성 여부를 관찰하였다(49). 본 실험에서 사용된 섬유아세포는 일반적으로 세포독성 판정에 있어서 기준이 되는 정상세포로 세포의 성장, 분열, 약물에 대한 반응이 최소한으로 조절되는 세포로 알려져 있다(50). 그러나 본 실험에 사용된 NC/Nga 생쥐의 T 세포오} B 세포는 약물에 대한 반응이 세포분열, 사이토카인의 자가분비 및 타가분비 등이 다양하게 나타나 세포독성 측정 에 적합하지 않아 hFCs로 대체하여 실험을 하였다.
실험재료

실험동물은 8 주령의 암컷 SPF (Specific Pathogen free) NC/Nga 생쥐 (20 g)로 Charles River Japan (Yokohama, Japan)에서 공급받아 실험동물로 사용하였고, BMAC (biostir mite antigen cream)는 진드기 항원으로 제작된 dermatophagoides farinae crude extract (mite antigen, lyophilized) (Biostir, Hiroshima, Japan)를 사용하였다. 창이자 (Xanthiumstrumari倾i)는 경동건재 한약방에서 구입하여 정선한 후 사용하였다.
창이자 (Xanthiumstrumari倾i)는 경동건재 한약방에서 구입하여 정선한 후 사용하였다.

데이터처리

E of 6 animals per group. Significance was determined using the Student's t-test.
다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean 士 standard error로 기록하였고, 유의성 검증은 Student’s M戒분석 방법을 이용하여 결정하였다.

이론/모형

Real time quantitative PCR의 조건으로는 pR・denaturatioii은 50°C 에서 2분, 94°C 에서 10분, 그리고 40 cycles을 95°C에서 15분, 60°C에서 1분 수행하였다. XS오} XS-30% AFL 처리군과 대조군은 internal standard로 G3PDH를 시'용하여 target group의 Quantitative real-time RT-PCR의 RQ (relative quantitative) 값은 Housseau 등(46)과 같은 공식에 의하여 측정하였다. y = x(l + e)n (x; starting quantity, y; yield, n; number of cycles, e; efficiency)
배양상증액 내의 IL-17A의 농도 즉정은 enzyme-linked immuno sorbent assay (ELISA) kit로 측정하였다. 각 well에 배양상층액 50 卩L와 dilution buffer 50 piL를 혼합하여 각 well에 분주하였고, 동안 25°C 실온에서 방치하였다.
4시간 배양 종료 후 BD G* olgiStop 의 방법에 따라 FITC-anti-mouse CD4과 PE-anti-mouse IL-17을 염색하였다. 유세포형광분석은 FACS calibur와 Cell Quest software를 사용하였다(43, 44).

성능/효과

또한 IL-17A의 단백질 생산량의 변화를 조사하기 위해 Thl7 세포를 분화시킨 CD4+ T 세포 배양 상층액을 분리하여 ELISA 법을 이용하여 IL-17A의 생산량을 측정한 결과;Fig. 4)를 보면, 대조군에 비하여 XS-E와 XS-30% AFL를 처리한 실험군에서 IL-17A 생산량이 유의성 있는 감소를 나타내었다(*p < 0.05, *p ** < 0.001). 이러한 결과로 미루어 볼때 XS-E와 XS-30% AFL은 Thl7 세포에서 IL-17A와 IL-22 mRNA 유전자 발현을 억제하거나 IL-17 생성을 억제하는 것으로 볼 수 있다
5에 나타난 바와 같이 Thl7 세포를 rIL-6와 TGF-P로 분화시킨 후 CFSE로 표지하였다. CFSE-labelled Thl7 세포를 rlL-23을 처리하여 4일간 배양하였고, Thl7 세포의 증식을 유도한 후 XS-30% AFL을 처리한 결과 Thl7 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 대조군에서는 Thl7 세포의 분열이 4일 동안 4번에 걸쳐 세포 수가 거의 비슷한 수로 증식이 일어나는 것을 CFSE를 통하여 확인하였고, XS-30%AFL 처리군은 CFSE의 형광이 점점 감소하여 Thl7 세포의 분열증식이 억제됨을 알 수 있었다.
Fig. 3에서 나타내는 바와 같이, Thl7 세포를 분화시킨 CD4+ T 세포에서 cDNA를 합성한 후 real-time PCR을 이용하여 IL-17A와 IL-22 mRNA의 유전자 발현량을 비교분석한 결과, 대조군에 대한 IL-17A와 IL-22 mRNA의 유전자발현의 상대정량 값 (RQ)은, XS-E와 XS-30% AFL를 처리한 실험군에서 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었다(*p * < 0.01, p *** < 0.001). 또한 IL-17A의 단백질 생산량의 변화를 조사하기 위해 Thl7 세포를 분화시킨 CD4+ T 세포 배양 상층액을 분리하여 ELISA 법을 이용하여 IL-17A의 생산량을 측정한 결과;Fig.
그러나 본 실험에 사용된 NC/Nga 생쥐의 T 세포오} B 세포는 약물에 대한 반응이 세포분열, 사이토카인의 자가분비 및 타가분비 등이 다양하게 나타나 세포독성 측정 에 적합하지 않아 hFCs로 대체하여 실험을 하였다. XS-E와 XS-FL은 세포독성을 측정한 결과 실험범위 내 농도인 100 卩g/mL 이하에서는 세포생존도 85% 이상.으로 세포독성이 거의 나타나지 않았다(Fig.
본 연구에서는 창이자 추출물 (XS・E오} XS-FL)이 NC/Nga 생쥐의 CD4+ T 세포에서 유도된 Thl7 세포의 분화억제 및 ILJ7의 생산량 감소 효과에 대한 실험을 하였다. 그 결과 XS・E와 XS・FL을 처리한 섬유아세포에서 세포독성은 나타나지 않았고, 4일간 XS-E오} XS.FL에 동시배양 한 CD4+ T 세포의 IL-17 생산량을 FACS로 분석한 결과 100 卩g/mL XS-E 처리군의 IL-17 생산량은 32.3%로 대조군에 비하여 2배이상의 감소를 나타내었으며, 20 pig/mL XS-30% AFL(acetone XS-FL) 처리군의 Thl7 세포는 19.6%으로 대조군에 비하여 3.5배 억제되었다. 또한 real-time PCR을 이용하여 IL-17A와 IL-22 mRNA의 유전자 발현량을 비교 분석한 결과, IL-17A와 IL-22 mRNA의 유전자발현의 RQ값은 XS・E와 XS-30% AFL를 처리한 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었다S < 0.
CFSE-labelled Thl7 세포를 rlL-23을 처리하여 4일간 배양하였고, Thl7 세포의 증식을 유도한 후 XS-30% AFL을 처리한 결과 Thl7 세포의 증식이 억제되는 것을 확인하였다. 대조군에서는 Thl7 세포의 분열이 4일 동안 4번에 걸쳐 세포 수가 거의 비슷한 수로 증식이 일어나는 것을 CFSE를 통하여 확인하였고, XS-30%AFL 처리군은 CFSE의 형광이 점점 감소하여 Thl7 세포의 분열증식이 억제됨을 알 수 있었다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때 NC/Nga 생쥐에서 창이자추출물인 XS-E오} XS-30% AFL은 염증유전자 IL-17 발현을 억제시키고 Thl7 세포의 증식의 감소효과로 아토피피부에 적용할 경우 아토피 피부 상태 개선에 효능이 있을 것으로 사료된다.
5배 억제되었다. 또한 real-time PCR을 이용하여 IL-17A와 IL-22 mRNA의 유전자 발현량을 비교 분석한 결과, IL-17A와 IL-22 mRNA의 유전자발현의 RQ값은 XS・E와 XS-30% AFL를 처리한 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있는 감소를 나타내었다S < 0.01, p < 0.001). ELISA로 측정한 IL-17A 생산량은 XS・E와 XS-30% AFL를 처리한 실험군이 대조군에 비하여 현저히 감소 (p < 0.
5배 Thl7 세포 분화를 억제하는 것으로 관찰되었다. 반면에 XS-70% AFL 처리군은 Thl7 세포군이 59.1 %로 나타나 별다른 분화억제를 하지 못하는것으로 나타났다.
2%로 세포의 분화가 유도되었다. 여기에 100 ug/mL XS-E를 처리한 경우 Thl7 세포는 32.3%로 만 분화가 이루어져 대조군에 비하여 2배 이상의 감소를 나타내었으며, 창이자의 물질분리 분획 중 20 gg/mL XS-30% AFL 처리군은 19.6%으로 대조군에 비하여 3.5배 Thl7 세포 분화를 억제하는 것으로 관찰되었다. 반면에 XS-70% AFL 처리군은 Thl7 세포군이 59.
대조군에서는 Thl7 세포의 분열이 4일 동안 4번에 걸쳐 세포 수가 거의 비슷한 수로 증식이 일어나는 것을 CFSE를 통하여 확인하였고, XS-30%AFL 처리군은 CFSE의 형광이 점점 감소하여 Thl7 세포의 분열증식이 억제됨을 알 수 있었다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때 NC/Nga 생쥐에서 창이자추출물인 XS-E오} XS-30% AFL은 염증유전자 IL-17 발현을 억제시키고 Thl7 세포의 증식의 감소효과로 아토피피부에 적용할 경우 아토피 피부 상태 개선에 효능이 있을 것으로 사료된다.
001). 이러한 결과로 미루어 볼때 XS-E와 XS-30% AFL은 Thl7 세포에서 IL-17A와 IL-22 mRNA 유전자 발현을 억제하거나 IL-17 생성을 억제하는 것으로 볼 수 있다

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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